CN113502240A - 一种复合生物保鲜剂及其制备方法、使用方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种复合生物保鲜剂，由枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的菌液或菌粉复配而成；其中枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL‑B12005，其生物保藏号为：CCTCC NO:M 2021642；本发明还提供复合生物保鲜剂的制备方法、使用方法及在果蔬保鲜方面的应用。该复合生物保鲜剂在果实采摘前进行喷施，可有效减少果实生长期病害的发生，减少贮藏期果实质量损失率和降低了果实腐烂率，室温条件下草莓果实贮藏期可延长2‑3d，结合4℃冷藏，能更好的保持果实色泽和品质，草莓和桃等的贮藏期可延长5‑20d；本发明菌剂能进一步减少化学杀菌剂的使用。

Description

一种复合生物保鲜剂及其制备方法、使用方法和应用
技术领域
本发明属于水果生物保鲜技术领域，具体涉及一种复合生物保鲜剂及其制备方法、使用方法和应用。
背景技术
我国是农业大国，水果种植范围广泛、面积大。水果的储存保鲜问题是提高农业生产效率的重要影响因素之一，储存过程中，由于植物致病细菌和致病真菌引起的病害所造成的损失严重影响了产品的产量，损失率达10-50％，特殊情况下甚至达到60-80％。水果由于水分含量高，贮藏保鲜比较困难，容易腐烂变质，失去原有的口感、风味，尤其在炎热的夏季，更加难以保存。
目前市场上水果的保鲜技术仍旧采用传统方法，如冷藏、气调、紫外照射等物理方法以及使用各类广谱化学杀菌剂，且多用于采摘后；化学杀菌剂的使用虽然防腐效果较好，但具有许多负面影响，如产生毒素、引发过敏反应、污染环境、提高植物病原菌的抗药性，甚至会影响舌尖上的安全，很多有效的杀菌剂被限制使用。随着人们对自身健康和环境的重视，市场需要安全、高效、绿色、安全的水果保鲜剂和保鲜方法。因此，开发新型安全无毒的防腐保鲜技术迫在眉睫。
针对目前水果保鲜技术存在的问题，在水果的储存过程中，可以使用微生物制剂作为农产品保护的替代手段，微生物制剂主要由对植物病原真菌和病原细菌有拮抗作用的微生物构成。应用研究证明，以枯草芽孢杆菌属为基础的微生物制剂效果良好，其产生的各种次级代谢产物(抗生素、酶、色素、植物激素等)对各种不利的环境因素具有良好的抵抗力。
但是，发明人发现，利用单一的拮抗菌株防腐保鲜具有效果不稳定、防治谱较窄等缺点，且果实保鲜技术大都集中在果实采摘后，使用浓度高(拮抗菌悬液的浓度一般在108CFU/ml 以上使用)生产成本高且效果有限。发明专利201410590184.1中将生物保鲜剂采前浸果和采后浸泡的方式进行梨果实的保鲜，实际使用中不易操作实现。
发明内容
针对上述研究背景，本发明提供一种复合生物保鲜剂及其制备方法、使用方法和应用，本发明将枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌联合低浓度使用，可有效抑制引起水果腐败的多种致病菌，具有广谱抑菌性且效果稳定、安全高效等优点；另外，采前喷施，操作简便，可减少生长期水果病害的发生，提高抗病性，同时抑制贮藏期腐败病原菌侵染果蔬，减少果蔬的发病及腐烂率，从而延长其保鲜贮藏期，并减少化学抑菌剂的使用，在果蔬保鲜方面具有良好的应用价值。
为了实现上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种一种复合生物保鲜剂，由枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的菌液或菌粉复配而成；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) NBL-B12005；该菌株分离自山东省肥城市中央桃行的桃果实样品，其菌落形态满足芽孢杆菌特征，经基因组测序比对，与其他已知同属的芽孢杆菌的16S rDNA序列有98％的相似性，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间MALDI-TOF MS质谱分析，本发明菌株与Bacillus subtilis 准确率达2.201。综合形态特征、16S rDNA基因序列结果和MALDI-TOF MS质谱分析确定，本发明菌株属于枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBL-B12005。该菌株已于2021年05月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址：中国武汉武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO: M 2021642。
所述贝莱斯芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO: M 2020672的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19，来源中国典型培养物保藏中心。
本发明的另一个目的是提供复合生物保鲜剂的制备方法，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19分别发酵得到发酵液，干燥发酵液获得菌粉，将上述菌株的菌粉或发酵液与其他辅料进行复配得到。
进一步地，将该复合生物保鲜剂制成可湿性粉剂，包括以下步骤：
(1)选取菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19；
(2)菌株的活化：将步骤(1)选取的菌种冻干、分别接种于固体LB斜面培养基上，并于30℃-37℃恒温培养箱中培养24h-30h；
(3)制备种子液：将培养好的斜面取一环接种于50ml-100ml的种子液培养基中，在30℃ -37℃条件下，180rpm震荡培养18-24h，制得一级种子液。
(4)扩大培养：以1％(V/V)的接种量，将一级种子液接于500ml-1000ml种子液培养基中，在37℃条件下，震荡培养12-14h，制得二级种子液。
(5)发酵罐培养：以1％(V/V)的接种量，将二级种子液接种于液体发酵培养基中，于30-37℃条件下，通气培养24-34h；
(6)收集发酵产物：发酵罐中芽孢率达到90％以上时，收集发酵液；
(7)发酵结束后，枯草芽孢杆菌发酵液添加0.5-1％轻质碳酸钙，立即喷雾干燥，即分别得到枯草芽孢杆菌菌粉和贝莱斯芽孢杆菌菌粉；
(8)复配：将步骤(7)所得枯草芽孢杆菌菌粉和贝莱斯芽孢杆菌菌粉按照1：1复配，以活菌数来计；即得。
优选的，步骤(3)和步骤(4)种子液培养基为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、其余为水，pH7.0。
优选的，步骤(5)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的液体发酵培养基为：甜菜糖蜜3.0％，K2HPO4×3H20 0.7％，(NH4)2SO4 0.15％，磷酸二氢钠0.8％，碳酸钙0.2％， MgSO4×7H20 0.01-0.06％，硫酸锰0.03％，其余为水，pH为7.0-7.2；
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的液体发酵培养基为：豆粕40g/L、葡萄糖9g/L、 MgSO4 0.1g/L、MnSO4 2.5mg/L、FeSO4 0.8mg/L，其余为水，初始pH6.8。
进一步地，将该保鲜剂制成液体菌剂，包括以下步骤：
(1)先分别制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的发酵液；并用无菌水配制成1×109CFU/ml的发酵液；
(2)将步骤(1)所得发酵液按1：1进行复配混合，然后加入0.5％山梨酸钾、4％氯化钠混合均匀，添加0.4％-1.0％的柠檬酸调节pH至4.5，即得。
优选的，该液体菌剂的活菌数≥10亿CFU/ml。
本发明第三个目的是提供复合生物保鲜剂在果实防腐保鲜中的应用，所述果实包括但不限于桃(核果类)、草莓(浆果类)等；其中，草莓在膨果期、始红期和采摘前1-2天喷施一次；桃在果实生长期开始喷施，每隔14-20d喷施一次。
本发明第四个目的是提供该复合生物保鲜剂的使用方法，在采摘前开始喷雾，叶面及果实表面喷雾均匀即可；喷施次数至少在2次以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005对多种果实腐败菌和致病菌具有广谱抑菌性；本发明提供的复合生物保鲜剂将其复配使用低浓度应用于果实的防腐保鲜，具有良好的协同增效效果，弥补了单一菌株使用浓度偏高且效果不稳定的缺陷。
(2)本发明复合生物保鲜剂在果实采摘前进行喷施，操作简便，可有效减少果实生长期病害的发生，减少贮藏期果实质量损失率和降低了果实腐烂率，室温条件下草莓果实贮藏期可延长2-3d，结合4℃冷藏，能更好的保持果实色泽和品质，草莓和桃等的贮藏期可延长5-20d。本发明菌剂能进一步减少化学杀菌剂的使用，对于食品安全、环境保护、农业的增收增效等都具有重要的意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005菌落特征图；
图2为实施例1中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005菌株特征图；
图3为实施例2中拮抗菌组合对M.fructicola 3-4的抑制效果图；
图4为实施例4中本发明菌剂采前不同喷施方法对草莓失重率的影响结果示意图；
图5为实施例4中本发明菌剂采前不同喷施方法对草莓腐烂率的影响结果示意图；
图6为实施例6不同处理组中桃果实表面致病真菌Penicillium数量变化图；
图7为实施例6不同处理组中桃果实表面致病真菌Cladosporium数量变化图。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1菌株的筛选及鉴定
(1)菌株的离体抑菌试验
从山东省肥城市中央桃行采集的桃果实、桃叶、土壤、果柄等8份样品中分离菌株，称取1g样品接入100mL无菌水中，37℃恒温箱中震荡摇匀，对样液进行梯度稀释，稀释液涂布在含有NA固体培养基的平板内，37℃培养过夜。从长出菌落的平板上分离菌株并纯化，转接NA斜面培养基保存。
从样品中分离出100株可以形成孢子的细菌。以从腐败桃果实中分离纯化出的三株致腐菌(互隔交链孢菌、桃褐腐病病菌、枝孢样枝孢霉)为测试对象，使用打孔法，研究分离纯化出的菌株发酵液的抑菌活性，选择明显抑菌作用的菌株。根据抑菌圈直径初步筛选得到几株有不同程度抑菌致病菌扩展的菌株。分离纯化菌株的抑菌活性见表1，
表1菌株的抗真菌活性
Figure BDA0003124301170000041
Figure BDA0003124301170000051
(2)果实活体抑菌试验
将有明显抑菌作用的菌落30℃条件下200r/min，在LB液体培养基中摇培24h后进行桃果实体内实验。桃果实用浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡杀菌2-3min，然后用无菌生理盐水冲洗掉残余的次氯酸钠后，置于无菌操作台中自然晾干，备用。用无菌打孔器在果实的赤道上人为打一个直径5mm，深3mm左右大小一致的孔。每一孔内用移液枪加入20μL拮抗菌悬浮液(1×108CFU/ml)，无菌工作台中静止2h后，至果粒伤口内及周围无流动菌悬液。然后用移液枪伤口处加入20μL病原菌孢子悬浮液(1×105CFU/ml)，室温下放置2h，待果实伤口及周围无流动菌悬液后后用保鲜膜密封，放于塑料盆中，置于28℃/93％RH的培养箱中进行恒温保湿培养，5d后观察并记录果实的腐烂情况，测量伤口病斑直径，并统计发病率，对照组加入无菌水(对照2)和对应的病原菌孢子悬浮液(对照1)。每个处理选用10个桃果实，平行3次，实验重复2次。
发病率计算公式为：发病率(％)＝处理组果实发病数/处理组果实个数×100。
根据果实的发病率和有伤接种后病斑的扩展情况，将具有拮抗作用的菌株挑选出来。
在本实施例中，筛选得到2株浓度为1×109CFU/ml以上可完全抑制桃褐腐病菌的菌株，其中，NBL-B12005菌株防治效果最佳。根据其特征对其进行种属鉴定。
(3)菌种的鉴定
显微镜下观察纯化后的B8菌株特征，如图2所示：细菌形状的革兰氏阳性，杆菌，大小为0.6×1.0-1.4微米，单个、成对或短链排列，形成内生孢子。孢子是椭圆形的，具有中心或亚顶部定位。孢子囊没有肿胀。
菌落特征，如图1所示：LB平板固体培养基37℃培养24h后形成浅米色的圆形菌落，边缘较规则，直径2-4mm，无光泽，中心略有同心圆褶皱突起，质地粘稠。
挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，取1-5ml菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。16S rRNA通用引物27f (5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')对该菌株基因组DNA扩增并送至上海铂尚生物工程股份有限公司测序。BLAST软件比对分析该菌株与以下菌株的同一性可达 99.50％以上：Bacillus subtilis strain 168(99.65％)，Bacillussubtilis strain DSM 10(99.50％)， Bacillus subtilis strain JCM 1465(99.50％)。
通过基质辅助激光解吸电离飞行时间MALDI-TOF MS质谱分析，本发明菌株与Bacillus subtilis准确率达2.201。
综合形态特征、16S rDNA基因序列结果和MALDI-TOF MS质谱分析确定，本发明菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005；并提供了该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的基因序列，长度为1413bp。
实施例2拮抗菌组合对病原菌的抑制效果
1.离体抑菌试验
以从腐败桃果实中分离纯化出的致病菌和致腐菌及俄罗斯生物研究所保藏的病原菌为测试对象，采用双层琼脂打孔的方式检测拮抗菌及其组合的抑菌活性。试验方法：下层培养基为2％PDA培养基，凝固后取1ml病原菌与5ml1.2％PDA培养基充分混匀作上层培养基，凝固后打孔器打孔(9cm)，加入100微升菌液(该菌液为枯草芽孢杆菌NBL-B12005菌液和贝莱斯芽孢杆菌K-19菌液1：1组合而成)，于冰箱内静置2h，24℃正置培养5d；结果如表1所示。
表1拮抗菌组合的广谱抑菌性
Figure BDA0003124301170000061
注:*1-Alternaria sp.1；2-M.fructicola 3-4；3-Cladosporium sp.1；4-Diaporthe sp.5-7；5-P. expansumБИМF-564；6-M.fructigenaБИМF-560。
2.果实体内抑菌试验
本实施例中，以桃为果实的代表，选取大小一致、健康无损伤的果实，进行果实体内实验。
试验方法：果实用浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡杀菌2-3min，然后用无菌生理盐水冲洗掉残余的次氯酸钠后，置于无菌操作台中自然晾干，备用。用无菌打孔器在果实的赤道上人为打一个直径5mm，深3mm左右大小一致的孔。每一孔内用移液枪加入20μL液体菌剂，无菌工作台中静止2h后，至果粒伤口内及周围无流动菌悬液。然后用移液枪伤口处加入20μL病原菌孢子悬浮液(1×105CFU/ml)，室温下放置2h，待果实伤口及周围无流动菌悬液后后用保鲜膜密封，放于塑料盆中，置于28℃/93％RH的培养箱中进行恒温保湿培养，5d后观察并记录果实的腐烂情况，测量伤口病斑直径，并统计发病率，对照组加入无菌水(对照 2)和对应的病原菌孢子悬浮液(对照1)。每个处理选用10个果实，平行3次，实验重复2 次；结果如表2所示。
计算公式如下：
发病率(％)＝处理组果实发病数/处理组果实个数×100。
对致病菌扩展的抑制程度(％)＝(对照组1的病斑直径-处理组的病斑直径)/对照组1的病斑直径×100。
表2拮抗菌及其组合菌液对致腐菌的抑制作用
Figure BDA0003124301170000071
由上述数据可知，将枯草芽孢杆菌NBL-B12005菌液和贝莱斯芽孢杆菌K-19菌液1：1 组合，其对M.fructicola 3-4和Alternaria sp.的抑制程度明显好于单一菌液，其病斑直径仅为 5.2-8.9mm，抑制率可达86％以上。这说明复合菌液具有显著的协同增效作用，且低浓度复配效果优于较高浓度单一菌液效果，可较好的控制果实采后腐烂的发生和扩展，因此，选择两者1:1组合制备复合生物保鲜菌剂；其组合浓度优选1×106-1×107CFU/ml。
实施例3复合生物保鲜剂(可湿性粉剂)的制备方法：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)K-19 分别发酵得到发酵液，干燥发酵液获得菌粉。发酵包括斜面培养、一级种子培养、扩大培养及发酵罐培养，待发酵罐中芽孢率达到90％以上时，收集发酵液。
具体包括以下步骤：
1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005菌粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将冻干菌种接种于于固体斜面培养基上，并于37℃恒温培养箱中培养24h-30h；
(2)制备种子液：将培养好的斜面取一环接种于50ml-100ml的种子液体培养基中，在 37℃条件下，180rpm震荡培养18-24h，制得一级种子液；其中种子液培养基为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、其余为水，pH7.0。
(3)扩大培养：以1％(V/V)的接种量，将一级种子液接于500ml-1000ml种子液培养基中，在37℃条件下，震荡培养12-14h，制得二级种子液；其中种子液培养基为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、其余为水，pH7.0。
(4)发酵罐培养：使用公司车间发酵罐，发酵体积为500L，发酵培养基300L。以1％(V/V)的接种量，将二级种子液接种于液体发酵培养基中，于30℃条件下，通气培养24-32h；其中液体发酵培养基为：甜菜糖蜜3.0％，K2HPO4×3H20 0.7％，(NH4)2SO4 0.15％，磷酸二氢钠0.8％，碳酸钙0.2％，MgSO4×7H20 0.01-0.06％，硫酸锰0.03％，其余为水，pH为7.0-7.2。
(5)收集发酵产物：发酵罐中芽孢率达到90％以上时，收集发酵液。
(6)发酵结束后，添加0.5-1％轻质碳酸钙，立即喷雾干燥，即得菌粉。
2、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19菌粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种的活化：将冻干菌种接种于于固体斜面培养基上，并于37℃恒温培养箱中培养24h；
(2)制备种子液：将培养好的斜面取一环接种于50ml-100ml的种子液体培养基中，在 35℃条件下，180rpm震荡培养24h，制得一级种子液；其中种子液培养基为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、其余为水，pH7.0。
(3)扩大培养：以1％(V/V)的接种量，将一级种子液接于500ml-1000ml种子液培养基中，在35℃条件下，震荡培养14h，制得二级种子液；其中种子液培养基为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、其余为水，pH7.0。
(4)发酵罐培养：使用公司车间发酵罐，发酵体积为500L，发酵培养基300L。以1％(V/V)的接种量，将二级种子液接种于液体发酵培养基中，于35℃条件下，通气培养28h；其中液体发酵培养基为：豆粕40g/L、葡萄糖9g/L、MgSO4 0.1g/L、MnSO4 2.5mg/L、FeSO40.8mg/L，其余为水，初始pH6.8。
(5)收集发酵产物：发酵罐中芽孢率达到90％以上时，收集发酵液。
(6)发酵结束后，添加0.5-1％轻质碳酸钙，立即喷雾干燥，即得菌粉。
3、将所得枯草芽孢杆菌菌粉和贝莱斯芽孢杆菌菌粉按照1：1复配，以活菌数来计；即得复合生物保鲜剂(可湿性粉剂)。
实施例4复合生物保鲜菌剂采前使用方法研究
为研究本发明复合生物保鲜菌剂在果实保鲜方面的使用方法，特进行本试验，本实施例选择草莓为代表进行试验。
本实施例中生物保鲜菌剂(液体菌剂)的制备方法如下：按照实施例3的制备方法分别制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005发酵液和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19发酵液，分别用无菌水配制1×109CFU/ml的枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌发酵液，将两者按1：1进行复配混合，然后加入0.5％山梨酸钾、4％氯化钠混合均匀，添加 0.4％-1.0％的柠檬酸调节pH至4.5左右，即得。
本实施例试验于山东省泰安市宁阳乡饮乡巴夫绿色循环农业示范园进行。所选用的草莓果实品种为“艳丽”。实验分为T1、T2、T3 3个处理组和对照组CK，对照组草莓果实商业成熟采摘之前不做喷施处理，常规管理；三个处理组用复合生物保鲜液体菌剂200倍稀释液对叶面及果实均匀喷施。各处理组处理方式如下：T1：在草莓果实始红期喷施；T2：在草莓果实始红期和采摘前1-2天分别喷施；T3：在草莓膨果期、始红期和采摘前1-2天分别喷施；所有试验小区随机分布，耕作、施肥、病虫害防治处理均相同。每组6垄，各处理间隔1垄。待果实商业成熟后采摘成熟度一致，无病虫害果实，当天运回实验室，去除田间热后，挑选成熟度一致，大小均一，健康、无机械损伤的果实分装在透明塑料盒中，轻放，每盒15个果实，每组3个重复。置于室内常温(28-32℃)保存，每1-2d观察记录果实的腐烂情况、测量果实的质量损失率。
测定方法：(1)失重率(质量损失率)的测定：分别测定待测桃果实贮藏起始质量(M0) 与贮藏中第n次取样测定的质量(Mn)。失重率(％)＝[(M0-Mn)/M0]×100％；
(2)腐烂率：腐烂率(％)＝腐败果实数/被检查总果数×100；
采前喷施本发明菌剂对草莓失重率的影响见图4。从图4中可以看出，与对照组相比，采前喷施复合生物保鲜菌剂组的失重率均保持较低水平。其中，T3处理组优于其他处理组，保持最低水平，在草莓贮藏第5天时，果实失重率仅为11.69％，与对照组之间存在显著差异。这说明，采前喷施处理能有效减少草莓果实贮藏过程中的质量损失。
采前喷施本发明菌剂对草莓腐烂率的影响见图5。室温条件下贮藏到第2d时，对照组每盒有1-3个果实水渍斑现象，第3天时，开始出现腐烂。菌剂处理组尚未出现腐烂和水渍斑现象，腐烂率为0。室温贮藏5天时，未处理组腐烂率为66.67％，菌剂处理组腐烂率最低仅为13.33％。
综合上述结果表明，复合生物保鲜菌剂的保鲜效果与喷雾次数有关。在果实采摘前增加喷施次数效果显著，采前喷施本发明复合生物保鲜菌剂可降低草莓果实的质量损失率，可保持良好的外观品质，同时有效减少病原菌侵染果实的几率，降低贮藏期间的腐烂率，从而延长果实贮藏保鲜期。建议分别在草莓果实膨大期、始红期和采前1-2天喷施。
实施例5复合生物保鲜菌剂在草莓保鲜上的应用
参照实施例4制备复合生物保鲜菌剂(液体菌剂)。根据实施例4结果，在本实施例中，在草莓果实膨大期、始红期和采摘前1-2天分别喷施。设置复合菌剂处理组和对照组，处理组用上述复合生物保鲜菌剂200倍稀释液对叶面及果实均匀喷施。对照组用清水喷施。待果实商业成熟后采摘成熟度一致，无病虫害果实，当天运回实验室，去除田间热后，挑选成熟度一致，大小均一，健康、无机械损伤的果实分装在透明塑料盒中，轻放，每盒15个果实，每组三盒重复。置于4℃冰柜中保存，每隔3d后进行腐烂率、腐烂程度以及果实色泽调查。
腐烂程度按腐烂面积占果实表面的百分比划分为五个等级：0级：无腐烂；1级：0-25％； 2级：25％-50％；3级：50％-75％；4级：75％-100％；腐烂指数计算公式如下：
Figure BDA0003124301170000101
草莓果实4℃贮藏24天时的腐烂等级情况见表3。
表3草莓果实4℃贮藏24天的腐烂等级情况
Figure BDA0003124301170000102
草莓采前喷施复合生物保鲜菌剂3次，采后在+4℃冰柜中可保鲜20天以上。冷藏条件下 5天时，对照组出现不同程度水渍斑甚至有腐烂迹象，处理组第9d开始出现轻微水渍斑，15d 后开始出现轻微腐烂现象；草莓4℃贮藏至24d，经采前喷施本发明复合生物保鲜菌剂处理组果实色泽仍然鲜亮。对照组草莓果实色泽下降，果柄干枯，腐烂率为66.67％，腐烂面积增明显增加，而采前菌剂处理后贮藏的草莓腐烂等级低，腐烂率仅为16.67％，比对照组果实减少了50％。
综合实施例4和实施例5结果表明，采前复合菌剂处理的草莓果实不易失水，降低了草莓果实的质量损失率，可保持果实的良好外观品质，同时显著降低贮藏期间的腐烂率，从而延长果实贮藏保鲜期，保持果实的商品价值。建议分别在草莓果实膨大期、始红期和采前1-2 天喷施本发明复合生物保鲜菌剂，室温条件下贮藏期可延长2-3d。结合4℃冷藏贮藏草莓，能更好的保持果实色泽，贮藏期可延长5-15d。
实施例6复合生物保鲜菌剂对桃果实生长期及储存期影响作用评价
试验方法：
本实施例试验在山东省泰安市宁阳乡饮乡桃满盈林果种植专业合作社进行，树龄5年，供试品种为黄金蜜3号。复合生物保鲜菌剂喷施方法：设置复合生物保鲜菌剂组和两个对照组，每组分别选取5株长势均匀、相同树龄的桃树及果实进行喷施，实验组用复合微生物保鲜菌剂200倍稀释后喷施，对照组分别用清水和1‰施保克(化学杀菌剂)喷施，分别在桃盛花期后60d、80d、100d、120d进行喷施，在果实生长期统计不同处理组果实的真菌病害发生率，并分别在处理当天、处理后1周、2周采集果实样品检测果实表面青霉菌和枝孢菌的活菌数。待果实成熟后采摘成熟度一致，无病虫害果实，当天运回实验室，去除田间热后，挑选成熟度一致，大小均一，健康、无机械损伤的果实分装在塑料盒中，轻放，置于4℃保存。分别在贮藏2天和12天时，测定果实的失重率、好果产量及感染果实比例。好果产量及染病果用称重方式确定。结果如表4所示。
表4桃果实采摘前使用复合生物保鲜菌剂处理前后的真菌病害发生率(2020年)
组别 对照组 化学杀菌剂组 本发明复合菌剂组
果实发病率，％ 13.8 8.0 3.8
由表4可知，施保克化学杀菌剂组与清水对照组相比，果实真菌病的发病率降低了1.7 倍，控制到8％，复合菌剂处理组达到最小值3.8％，比对照组低3.6倍。
对照组与复合菌剂组桃果实表面致病菌数量变化如图6和图7所示，从图6和图7可以看出，使用复合生物保鲜菌剂对果树处理后，桃果实致病真菌Penicillium(青霉菌)和Cladosporium(枝孢菌)的发病率相比化学杀菌剂组明显降低(到观察后期分别为2.4和5.2倍)，表现了本发明菌剂在生物保护上具有明显的优势。
为研究复合生物保鲜菌剂对病害率及贮藏状态下果实销售指标的保存率的影响，将对照组与实验组采摘健康果实置于4-6℃环境下贮藏。分别在贮藏2天和12天时，测定果实的失重率、好果产量及感染果实比例。好果产量及染病果用称重方式确定。结果如表5和表6所示。
表5桃贮藏2天后果实销售指标
Figure BDA0003124301170000111
Figure BDA0003124301170000121
储存2天的实验数据(表5)表明，采前喷施复合生物保鲜菌剂的桃果实好果出产率可以达到98％，而对照组仅有93.2％。
表6桃贮藏12天后果实销售指标
Figure BDA0003124301170000122
由对照组与实验组桃果实贮藏12天结果(表6)表明，桃果实最佳保存率组别为复合菌剂组，+4℃贮藏12天后，相较与对照组68.5％的好果率，该组达到91.1％。复合菌剂组好果率比化学杀菌剂组提高了12％，说明复合菌剂采前处理不仅能减少生长期病害的发生，还能较好保持采后果实的销售指标，因此，本发明复合菌剂可以减少化学杀菌剂的使用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东碧蓝生物科技有限公司
<120> 一种复合生物保鲜剂及其制备方法、使用方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
ggcggctggc tcctaaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120
tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaacagattt 180
gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg tagcacgtgt 240
gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300
caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc 360
tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420
gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct 480
ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540
cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600
ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt 660
ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta 720
cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct 780
acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc 840
ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc cctttacgcc 900
caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960
ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccgcccta tttgaacggc acttgttctt 1020
ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc 1080
agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140
tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga 1200
gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc 1260
caccttttat gtctgaacca tgcggttcag acaaccatcc ggtattagcc ccggtttccc 1320
ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac 1380
atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gac 1413

Claims (10)

1.一种复合生物保鲜剂，其特征在于：由枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的菌液或菌粉复配而成；所述枯草芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO: M 2021642的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005；所述贝莱斯芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO: M2020672的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19。
2.根据权利要求1所述的一种复合生物保鲜剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的复配比例为1：1，以活菌数来计。
3.一种如权利要求1-2任一所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19分别发酵得到发酵液，干燥发酵液获得菌粉，将上述菌株的菌粉或发酵液与其他辅料进行复配得到。
4.一种如权利要求3所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：将该保鲜剂制成可湿性粉剂，包括以下步骤：
(1)选取菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19；
(2)菌株的活化：将步骤(1)选取的菌种冻干、分别接种于固体LB斜面培养基上，并于30℃-37℃恒温培养箱中培养24h-30h；
(3)制备种子液：将培养好的斜面取一环接种于50ml-100ml的种子液培养基中，在30℃-37℃条件下，180rpm震荡培养18-24h，制得一级种子液；
(4)扩大培养：以1％(V/V)的接种量，将一级种子液接于500ml-1000ml种子液培养基中，在37℃条件下，震荡培养12-14h，制得二级种子液；
(5)发酵罐培养：以1％(V/V)的接种量，将二级种子液接种于液体发酵培养基中，于30-37℃条件下，通气培养24-34h；
(6)收集发酵产物：发酵罐中芽孢率达到90％以上时，收集发酵液；
(7)发酵结束后，枯草芽孢杆菌发酵液添加0.5-1％轻质碳酸钙，立即喷雾干燥，即分别得到枯草芽孢杆菌菌粉和贝莱斯芽孢杆菌菌粉；
(8)复配：将步骤(7)所得枯草芽孢杆菌菌粉和贝莱斯芽孢杆菌菌粉按照1：1复配，以活菌数来计；即得。
5.根据权利要求4所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)和步骤(4)种子液培养基为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、其余为水，pH7.0。
6.根据权利要求4所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：步骤(5)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的液体发酵培养基为：甜菜糖蜜3.0％，K2HPO4×3H200.7％，(NH4)2SO4 0.15％，磷酸二氢钠0.8％，碳酸钙0.2％，MgSO4×7H20 0.01-0.06％，硫酸锰0.03％，其余为水，pH为7.0-7.2；
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的液体发酵培养基为：豆粕40g/L、葡萄糖9g/L、MgSO4 0.1g/L、MnSO4 2.5mg/L、FeSO4 0.8mg/L，其余为水，初始pH6.8。
7.一种如权利要求3所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：将该保鲜剂制成液体菌剂，包括以下步骤：
(1)先分别制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的发酵液，并用无菌水配制成1×109CFU/ml的发酵液；
(2)将步骤(1)所得发酵液按1：1进行复配混合，然后加入0.5％山梨酸钾、4％氯化钠混合均匀，添加0.4％-1.0％的柠檬酸调节pH至4.5，即得。
8.根据权利要求5所述的复合生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：该液体菌剂的活菌数≥10亿CFU/ml。
9.一种如权利要求1-8任一所述的复合生物保鲜剂在果实防腐保鲜中的应用，所述果实包括但不限于桃(核果类)、草莓(浆果类)。
10.一种如权利要求1-8任一所述的复合生物保鲜剂的使用方法，其特征在于：在采摘前开始喷雾，叶面及果实表面喷雾均匀即可；喷施次数至少在2次以上。
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