CN112646739A - 一株芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其应用，所述芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K‑19，该菌株已于2020年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO:M 2020672。K‑19在优化发酵条件下，表面活性素surfactin产量不低于1.4g/L，且surfactin和iturinA仅两者产量之和可达1.82g/L；其代谢产物为天然抗菌剂，无毒副作用，基本无溶血活性，不产生耐药性，具有良好的植物促生、生防作用，在田间条件下，用于姜、花生等的种植中，对花生植株的促进作用显著高于对照组，且能抑制黄瓜植株的衰老，减少病斑，延长生长期，证明其具有良好的定殖效果，能够适应大田环境，可促进植物生长，降低植物病害。

Description

一株芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
表面活性素(Surfactin)是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株产生的次级代谢产物，是由七元肽和1条β-羟基脂肪酸链组成的环状脂肽，有多种同系物，根据碳链长度可分为 C12—C165种组分。其与一般化学表面活性剂相比，除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等作用外，还具备热稳定、无毒、生物降解性和更强的表面、界面活性等优点，具有多种生物活性，可抑制细菌、病毒、真菌、支原体的生长，它们主要作用于病原菌细胞膜的磷脂双分子层，改变细胞膜通透性和功能性，从而抑制病原菌的生长，不易产生耐药性，抗菌脂肽surfactin作为高效表面活性剂和新型抗菌物质，在农业生物防治、食品保鲜、石油工业等方面具有广泛的应用。
Surfactin具有抗多种细菌、真菌的能力，是生物易降解的，对环境是无害的，这使得 Surfactin在农业病害防治有着广阔的前景。Surfactin的产生菌很大一部分是筛选出来的植物病害拮抗菌。但Surfactin天然合成量相对较低，高昂的成本限制了它的应用。因此提高菌株的产脂肽能力，一直是研究热点。获得surfactin高产菌株是降低成本的最有效方法，近年来由于从环境中筛选高产野生菌株难度较大，国内外研究大多集中在对原始菌株通过诱变、代谢工程改造、基因组改造等手段来提高其产量，但改造菌株提高其产surfactin能力需要建立在优良野生菌株的前提下，目前对高产surfactin野生菌株的筛选研究较少。本发明研究了多种特性包括血平板初筛、排油活性、抑菌活性结合高效液相色谱分析从环境土壤中分离筛选得到一株能高产surfactin且具有广谱抑菌性，应用前景广阔的野生菌株。旨在为提高菌株的产surfactin能力降低开发成本，进而实现surfactin工业化生产提供菌种资源。
Surfactin是生物易降解的，对环境是无害的，这使得Surfactin在农业病害防治有着广阔的前景。但生产Surfactin高昂的费用及低收率阻碍了它的应用，获得Surfactin高产菌株是降低成本的最有效方法，一方面可以从环境中筛选高产野生菌株，优良菌种的选育，发酵过程的优化，寻找更廉价的原料和高效的分离纯化方式来降低成本。
发明内容
本申请从环境中筛选得到一株高产野生菌株，并优化发酵过程，为surfactin的规模化生产提供优良菌种。所述可用于制备抗菌脂肽，亦可应用于微生物饲料、饲料添加剂、微生物肥料、植物病害防治、食品防腐保鲜、化妆品、医药、环保等领域，具有十分巨大的应用价值和市场开发潜力。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19，该菌株已于2020年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO:M 2020672。
在本发明的第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)K-19和/或贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的代谢产物；
优选的，所述代谢产物中包含表面活性素；
优选的，所述菌剂中，有效活菌数≥10亿/mL。
优选的，所述菌剂的剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；进一步的为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
优选的，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
在本发明的第三方面，提供一种第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis) K-19的培养方法，培养基以0.8-1.5％的葡萄糖作为碳源，以2.0-5.0％的豆粕作为氮源；培养温度为10～40℃，进一步优选为30～40℃；培养pH值为3.5～8.5，进一步优选为6.5～ 7.5，发酵时间为36～44h。
经本发明研究表明，培养基中碳源与氮源比例不同的情况下，会影响培养基中发酵液中抗菌脂肽surfactin产量，随着葡萄糖质量浓度的增加，抗菌脂肽产量先增加后下降，这是因为在保证细胞生长的前提下，较高质量浓度的碳源明显促进了脂肽的合成，但是质量浓度过高的碳源会使细胞生长过旺而抑制脂肽的合成。豆粕质量浓度在40-50g/L范围内，似乎对脂肽surfactin的最终产量影响不大。通过研究发现当采用上述比例的培养基时，有利于获得最大的surfactin产量。本发明的培养基对上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis) K-19进行培养，有利于获得最大的surfactin产量。
在本发明的第四方面，提供一种第一方面所述菌株、第二方面所述菌剂在下列任一方面的应用：
(1)抑制植物病原菌，包括植物真菌病原菌及植物细菌病原菌；
(2)降低病情指数，减轻植物病害；
(3)促进植物生长，抑制老化延长生长期；
优选的，所述植物真菌病原菌包括但不限于灰霉病原菌、牡丹根腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、链格孢菌、小麦根腐病病原菌；
优选的，所述促进植物生长体现在促进植物幼苗增长和/或增重；减轻植物病害体现在降低植物病情指数；所述植物包括但不限于花生、黄瓜、姜、白菜、番茄、豆角和豌豆。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
本发明提供的芽孢杆菌，在优化发酵条件下，表面活性素surfactin产量不低于1.4g/L；该菌株还可以产伊枯草菌素iturinA，surfactin和iturinA仅两者产量之和可达1.82g/L。
本发明菌株所产代谢产物为天然抗菌剂，无毒副作用，基本无溶血活性，可以用作食品防腐剂、农用生防制剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性的优点，在实际使用中具有较高安全性。
本发明提供的菌株具有良好的植物促生、生防作用，在田间条件下，用于姜、花生、黄瓜、白菜等的种植中，对花生植株的促进作用显著高于对照组，且能抑制黄瓜植株的衰老，减少病斑，延长生长期，证明其具有良好的定殖效果，能够适应大田环境，可促进植物生长，降低植物病害。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中菌株K-19菌落形态图；
图2为实施例1中菌株K-19排油圈；
图3为实施例1中菌株K-19对根腐病原菌、灰霉病原菌的拮抗作用图；
图4为实施例1中菌株K-19发酵液对根腐病原菌的抑菌活性图；
图5为实施例1中表面活性素紫外扫描光谱图；
图6为实施例1中Surfactin标准品HPLC色谱图；
图7为菌剂组与对照组花生促生长实验图；
图8为菌剂组与对照组黄瓜防效试验图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明的一种实施方式中，提供了一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19，该菌株已于2020年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO:M 2020672。
本发明的一种实施方式中提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19和/或贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的代谢产物；
优选的，所述代谢产物中包含表面活性素；
优选的，所述菌剂中，有效活菌数≥10亿/mL。
优选的，所述菌剂的剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；进一步的为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
优选的，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
本发明的一种实施方式中，提供一种上述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)K-19 的培养方法，培养基以0.8-1.5％的葡萄糖作为碳源，以2.0-5.0％的豆粕作为氮源；培养温度为10～40℃，进一步优选为30～40℃；培养pH值为3.5～8.5，进一步优选为6.5～7.5。
在一种具体的实施方式中，上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的培养基包括小麦粉/玉米粉/葡萄糖/酵母浸膏3-15g/L，黄豆粉/豆粕/蛋白胨9-50g/L，MgSO4 0.1-0.4g/L， MnSO4 1.0-5.0mg/L，FeSO4 0.5-1.0mg/L，L-谷氨酸1.0-7.0mg/L，余量为蒸馏水。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的培养基为豆粕40-50g/L； G 0.9-1.2g/L；MgSO4 0.05-0.2g/L；MnSO4 2.0-3.5mg/L；FeSO4 0.6-1.0mg/L，L-谷氨酸1.0-5.0 mg/L，余量为水。
经本发明研究表明，培养基中碳源与氮源比例不同的情况下，会影响培养基中发酵液中抗菌脂肽surfactin产量，随着葡萄糖质量浓度的增加，抗菌脂肽产量先增加后下降，这是因为在保证细胞生长的前提下，较高质量浓度的碳源明显促进了脂肽的合成，但是质量浓度过高的碳源会使细胞生长过旺而抑制脂肽的合成。豆粕质量浓度在40-50g/L范围内，似乎对脂肽surfactin的最终产量影响不大。通过研究发现当采用上述比例的培养基时，有利于获得最大的surfactin产量。本发明的培养基对上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis) K-19进行培养，有利于获得最大的surfactin产量。
本发明的一种实施方式中，提供一种上述菌株和/或上述菌剂在下列任一方面的应用：
(1)抑制植物病原菌，包括植物真菌病原菌及植物细菌病原菌；
(2)降低病情指数，减轻植物病害；
(3)促进植物生长，抑制老化延长生长期；
在一种具体的实施方式中，所述促进植物生长体现在促进植物幼苗增长和/或增重；减轻植物病害体现在降低植物病情指数；所述植物包括但不限于花生、黄瓜、姜、白菜、番茄、豆角和豌豆。
下面结合实施例对本发明作出更加详细的说明，但是不够成对本发明的限制。
实施例1菌株的筛选和鉴定
菌株的筛选
1.试验材料
1.1土壤
采自山东省泰安市周边的菜园土壤。
1.2病原菌
根腐病病原菌和灰霉病病原菌均由山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种资源保藏中心提供。
1.3培养基
PDA：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂2％，水1L；LB：蛋白胨10g，酵母粉5g， NaCl10g，水1L，pH7.0；血琼脂平板购自上海科玛嘉生物技术有限公司。
1.4标准品
Surfactin标品购自Sigma公司。
2.试验方法
2.1菌株的分离纯化
取采集到的土壤10g，放入90mL无菌水中，振荡混匀，稀释成合适梯度后涂布于LB平板，在37℃培养箱中培养1d，每种土壤样品选取1-2个具有典型芽孢杆菌特征菌落划线于固体LB培养基上，37℃培养1d，保存备用。挑取划线单菌落镜检并接种于LB斜面，保存备用。
2.2溶血性检测
将分离活化菌株接种于血平板上，放入37℃培养箱中培养1d，测量菌落直径R1和溶血圈直径R2，计算溶血性I。溶血性I＝(R2-R1)/R1。
2.3发酵上清液的制备
将分离筛选得到的菌株接种于LB液体培养基中，37℃、170r/min培养48h，10000r/min 离心15min去除菌体，发酵上清液过0.22μm孔径滤膜除菌，4℃保存。
2.4排油活性检测
取一直径9cm的培养皿，加入无菌水，再加入0.2mL大豆油使之在水面形成油膜，然后在油膜中心加入0.01mL发酵上清液，中心油膜会被挤向四周形成一个圆圈，测量排油圈的直径，每个处理重复3次取平均值。
2.5拮抗性能检测
以根腐和灰霉病病原菌为指示菌，采用平板对峙法。用1mL蓝枪头抠取病原真菌菌饼置于PDA平板四周，将所试菌株用接种环接种在平板中央，在28℃培养箱中培养2～5d，观察菌株对不同病原真菌的抑菌效果，用直尺测量抑菌带宽，比较分离菌株的拮抗性能差异。同时接种病原真菌对照组。
2.6HPLC定性分析及surfactin含量测定
HPLC分析系统为岛津AT20，色谱柱为AQ-C18，250mm×4.6mm×5μm；流动相A为无水乙腈，流动相B为0.1％三氟乙酸(V/V)，采用梯度淋洗方式分析，变化条件为：0-8min A70％-85％，B 30％-15％；8-30min A：B＝85:15，31-40min A：B＝70:30。流速0.8ml/min，柱温30℃，紫外检测器，检测波长205nm，进样量20μL。取上清液按上述HPLC方法检测surfactin含量。
2.7菌株的生理生化特性及鉴定
挑选单个菌落进行革兰氏染色镜检观察。同时进行生化鉴定，包括V-P反应试验、D- 木糖、L-阿拉伯糖、7％氯化钠生长试验、PH5.7生长试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐的利用试验、丙酸盐利用试验、D-甘露醇、明胶液化试验，具体方法参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行。
将分离菌株接种到LB液体培养基中过夜培养，10000r/min离心10min弃去上清液，菌体用于提取基因组DNA。利用通用引物27F和1492R对细菌的16S rDNA基因进行 PCR扩增。将纯化后的产物交给上海铂尚生物工程股份有限公司进行测序。将得到的序列在NCBI上进行BLAST比对。
3结果与分析
3.1排油活性和拮抗性能
表1菌株的排油活性及对常见病原菌的抑制效果
Figure RE-GDA0002949247070000091
注：“+++”表示抑菌带宽度≥0.40cm；“++”表示抑菌带宽度0.40-0.20cm；“+”表示抑菌带宽度0-0.19cm；“-”表示无抑菌效果。
综合菌株产表面活性剂和抑菌性能考虑，挑选菌株BLK07、BLK09、BLK014、K-19、BLK027、BLK030、BLK035、BLK036结合高效液相色谱分析测定发酵液中surfactin含量进一步筛选。
3.3发酵液抗菌脂肽定性分析及含量测定
3.3.1表面活性素surfactin的HPLC检测方法摸索
3.3.1.1波长的选择
流动相选择乙腈(A)、0.1％三氟乙酸(B)，流动相比例对比(A:B)85:15，紫外检测器，色谱柱：AQ-C18,4.6*250mm，5μm，柱温：30℃，流速1mL/min，进样体积20μL。
在相同色谱条件下，205nm出峰时间略晚于210nm 10-46s，但响应值明显升高，205nm 均比210nm的峰面积大约1.8倍，同时结合表面活性素紫外扫描光谱因此选择205nm作为 surfactin液相检测波长。
3.3.1.2流动相比例的选择
流动相比例对比(A:B)95:5和85:15，其余同(色谱柱:AQ-C18,4.6*250mm，5μm，柱温：30℃，波长205nm，流速1mL/min，进样体积20μL)。结果表明，乙腈比例提高后，各峰出峰时间提前，峰面积减小约10％，且分离度稍差。因此选择流动相比例为A：B 为85:15。
3.3.1.3柱温的选择
升高柱温后，标品出峰时间提前，除第5个主峰峰面积提高约10％，其余4个主峰峰面积变化不大，3和4号峰分离度较差。因此选择30℃柱温。
3.3.1.4流速的选择
在同等色谱条件下，梯度淋洗前后不同流速，只缩短了出峰时间，保留时间提前约0.8 min，但出峰面积差异不显著。0.8ml/min流速比1.0ml/min出峰时间延长约2min，但峰面积增大约1.2倍。因此流速选择0.8ml/min。
3.3.1.5色谱柱的选择
在相同色谱条件下，对比不同色谱柱AQ(长柱子)和ODS柱(短柱子)进行测定分析。在同等色谱条件下，AQ-c18柱和ODS柱这两种色谱柱的峰形和主峰数目一致，但出峰时间ODS柱比AQ-C18柱提前约3.5-5.5min，峰面积差别不显著。
通过研究波长、流动相比例、柱温、流速、色谱柱等因素，Surfactin标准品在保留时间17.019、19.827、20.636、23.470min出现特征峰，确定表面活性素的色谱条件为：
色谱条件：AQ-C18，4.6*250mm，5μm
柱温：30℃
波长：205nm
流速：0.8ml/min
进样量：20μL
时间程序见表2：
表2 surfactin检测时间程序
时间 乙腈(A) 0.1％TFA(B)
0-1min 70％ 30％
1-8min 70％-85％ 30％-15％
8-31min 85％ 15％
31-40min 70％ 30％
3.3.2不同菌株发酵液中抗菌脂肽含量测定
将分离筛选得到的菌株接种于LB液体培养基中，37℃、170r/min培养48h，10000r/min 离心15min去除菌体，发酵上清液过0.22μm孔径滤膜除菌，采用HPLC高效液相色谱法测定发酵上清液中抗菌脂肽surfactin的含量，结果如下：
表3不同菌株发酵液中抗菌脂肽含量
Figure RE-GDA0002949247070000111
Figure RE-GDA0002949247070000121
K-19菌株产抗菌脂肽surfactin含量最高，可达366.58mg/L。该菌具有较好的排油活性和抑制真菌活性且具有高产抗菌脂肽的能力，有进一步开发、生产抗菌脂肽的潜力。
3.4菌株的鉴定
显微镜下观察纯化后的菌株特征(图1、图2)：革兰氏阳性菌，细菌状的直杆，大小为0.6×1.0-1.4μm，具有圆形末端，单个或成对分组，形成内生孢子；孢子为椭圆形，具有中心或亚顶部定位；孢子囊没有肿胀。培养24h后其菌落不光滑，不透明，不规则，乳白色，圆形菌落，直径2-4mm，略有齿状边缘，在中心有明显褶皱突起，质地粘稠。
参考伯杰氏系统细菌学手册鉴定方法进行生理生化实验进一步验证目的菌株，其反应如下：
表4、菌株的生理生化特性
Figure RE-GDA0002949247070000122
Figure RE-GDA0002949247070000131
挑取单菌落接种至芽孢液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，取1-5ml菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。16S rRNA通用引物27f (5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')对该菌株基因组DNA扩增并送至上海铂尚生物工程股份有限公司测序。BLAST软件比对分析该菌株与以下菌株的同一性可达99％：Bacillus velesensis strain EN01(99.93％)、Bacillus velesensisstrain LB002(99.93％)、 Bacillus amyloliquefaciens strain V167(99.79％)、Bacillus velesensis strain YL17(99.79％)。
综合形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列(SEQ ID NO.1)分析，本发明菌株属于贝莱斯芽孢杆菌。
所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的形态学特征如下：
菌体特征：革兰氏阳性菌，细菌状的直杆，大小为0.6×1.0-1.4μm，具有圆形末端，单个或成对分组，形成内生孢子；孢子为椭圆形，具有中心或亚顶部定位；孢子囊没有肿胀。
菌落特征：LB平板固体培养基培养24h后菌落光滑，不透明，稍规则，乳白色，圆形，直径2-4mm，略具有齿状边缘，在中心有明显褶皱突起，质地粘稠。
所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的生理生化特征如下：
V-P反应试验、D-木糖、L-阿拉伯糖、7％氯化钠生长试验、PH5.7生长试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验阳性；柠檬酸盐的利用试验、丙酸盐利用试验、D-甘露醇、明胶液化试验阴性。
实施例2 3.5液体发酵培养基及培养条件的优化
3.5.1发酵培养基的筛选
对比8种有利于抗菌脂肽形成的培养基进行发酵，筛选K-19产surfactin的最佳发酵培养基。
筛选方法：在250ml三角瓶中，先利用种子培养基活化培养24h，然后以2％的接种量接种到15种不同发酵培养基中，转速170r/min，温度37℃，装液量50ml，自然PH的条件下进行培养。每种培养基三个重复。培养48h后，取样检测各瓶发酵液中的surfactin 含量，确定最佳培养基。
在同种发酵条件下，以LB培养基的产量为对照，其中6号、7号培养基的surfactin产量显著提高(657.16、607.21mg/L)，在6号培养基的基础上添加不同浓度的L-谷氨酸(1mg/L、3mg/L、5mg/L、7mg/L、9mg/L)，对比发现，添加L-谷氨酸有利于提高surfactin 产量，且较适宜浓度在3-7mg/L，surfactin产量最高可达843.24mg/L。同时研究了培养基成分对抗菌脂肽surfactin产量的影响，当豆粕质量浓度在40-50g/L范围内，葡萄糖质量浓度在9-11g/L范围内，抗菌脂肽surfactin产量较高，且当豆粕质量浓度为45g/L，葡萄糖质量浓度为10g/L时，抗菌脂肽的surfactin产量最高。确定本发明菌株的最佳发酵培养基为：豆粕45g/L；G10 g/L；MgSO4 0.2g/L；MnSO4 2.5mg/L；FeSO4 0.8mg/L，L-谷氨酸3mg/L；在此培养基基础上研究培养条件。
表5、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)在不同组分的营养培养基上的Surfactin产量
Figure RE-GDA0002949247070000141
注：1#-小麦粉14g/L；黄豆粉25g/L；玉米粉8g/L；MgSO4 0.1g/L；MnSO4 2.5mg/L；FeSO4 0.8mg/L；蒸馏水1000mL。
2#-蛋白胨9g/L；酵母浸膏3g/L；G 10g/L；K2HPO4 0.2g/L；七水MgSO4 0.2g/L；蒸馏水1000mL。
3#-小麦粉10g/L；黄豆粉20g/L；MgSO4 0.2g/L；MnSO4 5mg/L；FeSO4 0.5mg/L；蒸馏水1000mL。
4#酵母浸膏14g/L；G 14g/L；MgSO4 1g/L；蒸馏水1000mL。
5#-豆粕40g/L；G 9g/L；蒸馏水1000mL。
6#-豆粕40g/L；G 9g/L；MgSO4 0.2g/L；MnSO4 2.5mg/L；FeSO4 0.8mg/L；蒸馏水1000mL。
7#-豆粕40g/L；G 9g/L；L-谷氨酸5mg/L；蒸馏水1000mL。
8#-豆粕40g/L；G 9g/L；MgSO4 0.2g/L；MnSO4 2.5mg/L；FeSO4 0.8mg/L；L-谷氨酸3mg/L，蒸馏水1000mL。
3.5.2发酵最佳时间的确定
表6不同发酵时间的活菌数、surfcatin产量及其对病原菌的抑菌活性测定
Figure RE-GDA0002949247070000151
综合考察本发明菌株在新筛选培养基中生长规律和抗菌脂肽surfactin的产生规律可以发现，抗菌脂肽surfactin的产生与菌体生长规律基本一致，surfactin产量随着活菌数的增加而增加。发酵液的抑菌圈直径与抗菌脂肽含量变化呈正相关，随着发酵时间的延长，抗菌脂肽含量逐渐增加，发酵液对根腐等病原真菌的抑菌性逐渐增加。42h时达到最大值，之后略有下降，因此选择42h为最佳发酵时间。
3.5.3发酵条件研究优化
在此基础上研究了培养基成分(豆粕和葡萄糖质量浓度)和摇瓶发酵条件(发酵温度、转速、pH等)对抗菌脂肽surfactin产量的影响。
将接种该菌株的培养基置于不同温度下摇床培养42h，依据菌液的浑浊程度，镜检无杂菌，可确定本发明菌株在10～40℃环境中的菌株能够生长，且30～40℃环境下的菌株生长最快。将接种本菌株的培养基置于不同初始pH值环境下摇床培养42h，在pH值范围为3.5～8.5的环境中菌株能够生长，且在pH值为6.5～7.5的环境中生长最快。
置于37℃、pH值为6.8的条件下摇床培养，转速分别设置120rpm、140rpm、160rpm、180rpm。
表7、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)发酵条件的优化1
Figure RE-GDA0002949247070000161
表8、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)发酵条件的优化2
培养时间 120rpm 140rpm 160rpm 180rpm
Surfactin含量/mg/L 720.54 975.73 1402.33 1300.26
iturinA含量/mg/L 125.94 208.45 420.54 353.65
最终确定本发明菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的最佳培养条件为：рН6.8；温度为35℃，搅拌速度160r/min，培养时间42h；Surfactin产量可达1.4g/L，surfactin和 iturinA仅两者产量之和可达1.82g/L。
实施例3
3.6微生物制剂生防试验
菌液制备方式：豆粕45g/L；G10 g/L；MgSO4 0.2g/L；MnSO4 2.5mg/L；FeSO4 0.8mg/L， L-谷氨酸3mg/L，余量为水；рН6.8；温度为35°С，搅拌速度160r/min，培养时间42h。获得贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19发酵液。发酵液稀释200-500倍选择不同作物进行盆栽防效实验和田间实验。
3.6.1在花生上的促生长实验
试验田选自山东临沂某一农户露天花生地，长势不好，故使用本发明菌剂在花生上进行促生长实验。试验设置2个组，每组花生3垄，实验组使用2％本发明菌剂(稀释200-500 倍)，灌根冲施，间隔7天冲施第二次，然后观察植株长势情况。对照组和实验组除变量外其余统一管理。30d后观察记录株高、根长、茎粗等生长状况。
结果表明，冲施30d后，实验组花生的株高、根长、茎粗均明显优于对照组，这表明本发明菌剂在花生作物有一定的促生作用。
表10菌剂对花生的促生效果
Figure RE-GDA0002949247070000171
3.6.2在黄瓜上的生防效果
选择生长后期开始出现轻微老化或病斑的黄瓜为研究对象，实验组用制备的发酵液稀释200-500倍进行叶面喷施，以叶面喷施清水为对照组，隔7天喷施一次，14d后观察记录植株的病情分级。结果表明，对照组老化严重，有死秧现象，实验组老化缓慢，病斑少。由此可以看出，本发明菌剂叶面喷施可减轻病害，抑制老化延长生长期。
病情分级标准：0级，全植株无病；1级，植株茎叶有很少病斑，占总面积1/5以下；2级，植株茎叶有少数病斑，占总面积的1/5-1/3；3级，植株茎叶有许多病斑，占总面积1/3-2/3，叶面变黄；4级，全植株发病，叶面出现枯萎。本发明菌剂在黄瓜上的防效指数为55.77％。
病情指数DI(％)＝[∑(病级数×该级发病植株数)]/[病级最高值×调查总株数]×100
防效(％)＝(对照病级指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
表11、微生物制剂在黄瓜上的防效效果
Figure RE-GDA0002949247070000181
通过盆栽实验和大田实验表明，本发明中的微生物制剂切实能够应用于实际种植过程中，通过灌根亦可叶面喷施，可显著降低病情指数，减轻病害，促进植物生长，抑制老化延长生长期。具有良好的促生及防病的功效，可应用于实际生产。
对比实验1：
将现有的贝莱斯芽孢杆菌如同实施例1所述进行抑菌实验，所得结果与本发明菌株K-19的对比如下表12所述。
表12抑菌带宽
Figure RE-GDA0002949247070000182
对比实验2：
将现有的贝莱斯芽孢杆菌如同实施例3所述进行对花生的促生长实验和对黄瓜的生防效果实验，所得结果与发明菌株K-19的对比如下表13所述。
表13.促生长和生防效果实验
Figure RE-GDA0002949247070000191
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东碧蓝生物科技有限公司
<120> 一株芽孢杆菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1454
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis strain）K-19 16S rDNA
<400> 1
ccgggggggg gtgccttaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60
tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120
cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180
ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240
ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300
acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360
tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420
gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540
gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600
gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660
tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720
gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780
cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840
acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960
caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260
caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320
agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg 1440
ccgaagggac ctga 1454

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19，该菌株已于2020年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO:M 2020672。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)K-19和/或贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的代谢产物。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述代谢产物中包含表面活性素；
优选的，所述菌剂中，有效活菌数≥10亿/mL。
4.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；优选的，所述菌剂的剂型为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
6.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)K-19的培养方法，其特征在于，培养基以0.8-1.5％的葡萄糖作为碳源，以2.0-5.0％的豆粕作为氮源；
培养温度为10～40℃，进一步优选为30～40℃；培养pH值为3.5～8.5，进一步优选为6.5～7.5，发酵时间为36～44h。
7.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述培养基包括小麦粉/玉米粉/葡萄糖/酵母浸膏3-15g/L，黄豆粉/豆粕/蛋白胨9-50g/L，MgSO4 0.1-0.4g/L，MnSO4 1.0-5.0mg/L，FeSO4 0.5-1.0mg/L，L-谷氨酸1.0-7.0mg/L，余量为蒸馏水。
8.如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述培养基为豆粕40-50g/L；G0.9-1.2g/L；MgSO4 0.05-0.2g/L；MnSO4 2.0-3.5mg/L；FeSO4 0.6-1.0mg/L，L-谷氨酸1.0-5.0mg/L，余量为水。
9.一种权利要求1所述菌株和/或权利要求2所述菌剂在下列任一方面的应用：
(1)抑制植物病原菌，包括植物真菌病原菌及植物细菌病原菌；
(2)降低病情指数，减轻植物病害；
(3)促进植物生长，抑制老化延长生长期。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述促进植物生长体现在促进植物幼苗增长和/或增重；所述植物包括但不限于花生、黄瓜、姜、白菜、番茄、豆角和豌豆。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502240A (zh) * 2021-06-21 2021-10-15 山东碧蓝生物科技有限公司 一种复合生物保鲜剂及其制备方法、使用方法和应用
CN113773993A (zh) * 2021-09-17 2021-12-10 中国科学院成都生物研究所 一种伊枯草菌素a的新用途
CN113969254A (zh) * 2021-12-07 2022-01-25 山东农业大学 田菁内生芽孢杆菌zh60、复合菌剂及玉米种培养方法
CN113980828A (zh) * 2021-05-21 2022-01-28 广西大学 一株高产绿原酸的栗褐芽孢杆菌诱变菌株
CN114854618A (zh) * 2022-03-02 2022-08-05 上海交通大学 一株贝莱斯芽孢杆菌sf327及其应用
CN114938814A (zh) * 2022-05-31 2022-08-26 京博农化科技有限公司 表面活性素及其组合物在促进植物根系生长中的用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170215429A1 (en) * 2014-07-31 2017-08-03 Universidad De Granada Use of bacillus methylotrophicus as a stimulant of plant growth and biological control means, and isolates of said species
CN110117556A (zh) * 2019-03-27 2019-08-13 海南大学 一种高效产脂肽类物质的生防菌hn-2及发酵工艺
CN111867363A (zh) * 2018-02-12 2020-10-30 博思特生物群落公司 用于预防或减少真菌病原体在植物上生长的微生物组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170215429A1 (en) * 2014-07-31 2017-08-03 Universidad De Granada Use of bacillus methylotrophicus as a stimulant of plant growth and biological control means, and isolates of said species
CN111867363A (zh) * 2018-02-12 2020-10-30 博思特生物群落公司 用于预防或减少真菌病原体在植物上生长的微生物组合物
CN110117556A (zh) * 2019-03-27 2019-08-13 海南大学 一种高效产脂肽类物质的生防菌hn-2及发酵工艺

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QING JIN等: "Complete genome sequence of Bacillus velezensis S3-1, a potential biological pesticide with plant pathogen inhibiting and plant promoting capabilities", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
梅雨薇等: "生物表面活性剂脂肽的发酵生产及抑菌应用研究进展", 《中国生物工程杂志》 *
邓旗: "贝莱斯芽孢杆菌CMT-6的surfactin合成基因表征及其响应溶氧的调控通路研究", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113980828A (zh) * 2021-05-21 2022-01-28 广西大学 一株高产绿原酸的栗褐芽孢杆菌诱变菌株
CN113980828B (zh) * 2021-05-21 2024-02-20 广西大学 一株高产绿原酸的栗褐芽孢杆菌诱变菌株
CN113502240A (zh) * 2021-06-21 2021-10-15 山东碧蓝生物科技有限公司 一种复合生物保鲜剂及其制备方法、使用方法和应用
CN113502240B (zh) * 2021-06-21 2023-05-05 山东碧蓝生物科技有限公司 一种复合生物保鲜剂及其制备方法、使用方法和应用
CN113773993A (zh) * 2021-09-17 2021-12-10 中国科学院成都生物研究所 一种伊枯草菌素a的新用途
CN113969254A (zh) * 2021-12-07 2022-01-25 山东农业大学 田菁内生芽孢杆菌zh60、复合菌剂及玉米种培养方法
CN114854618A (zh) * 2022-03-02 2022-08-05 上海交通大学 一株贝莱斯芽孢杆菌sf327及其应用
CN114938814A (zh) * 2022-05-31 2022-08-26 京博农化科技有限公司 表面活性素及其组合物在促进植物根系生长中的用途

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