KR20020050672A

KR20020050672A - 신균주 스트렙토마이세스 속 ａｇ－ｐ（ｋｃｔｃ８９６５ｐ）및 이를 이용한 식물병 방제제

Info

Publication number: KR20020050672A
Application number: KR1020000079923A
Authority: KR
Inventors: 김창진; 박상호; 이향범; 박동진; 김흥태; 조광연
Original assignee: 복성해; 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2002-06-27
Also published as: KR100411185B1

Abstract

본 발명은 신균주 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P) 및 이를 이용한 식물병 방제제에 관한 것으로 더욱 상세하게는 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P) 균주가 식물 역병균인 파이토프토라 속(Phytophthorasp.) 및 입고병균인 피시움 속(Pythiumsp.)균 등 식물병원성 난균류(Oomycete)에 대하여 선택적인 항균활성을 나타냄을 확인하고 이 균주를 이용한 식물역병 및 입고병와 같은 식물병 방제를 위한 생물농약(biocontrol agent)으로서 이용 가능한 신균주 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P) 및 이를 이용한 식물병 방제제에 관한 것이다.

Description

신균주 스트렙토마이세스 속 ＡＧ－Ｐ（ＫＣＴＣ８９６５Ｐ）및 이를 이용한 식물병 방제제{A new Streptomyces sp. AG-P(KCTC 8965P), and an agent for control of plant diseases using this strain}

본 발명은 신균주 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P) 및 이를 이용한 식물병 방제제에 관한 것으로 더욱 상세하게는 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P) 균주가 식물 역병균인 파이토프토라 속(Phytophthorasp.) 및 입고병균인 피시움 속(Pythiumsp.)균 등 식물병원성 난균류(Oomycetes)에 대하여 선택적인 항균활성을 나타냄을 확인하고 이 균주를 이용한 식물역병 및 입고병와 같은 식물병 방제를 위한 생물농약(biocontrol agent)으로서 이용 가능한 신균주 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P) 및 이를 이용한 식물병 방제제에 관한 것이다.

역병균인 파이토프토라 및 입고병균인 피시움에 의한 식물병은 대단히 종류가 많고 그 피해는 막대하다. 전 세계적으로 지금까지 60여종의 역병균과 1,000종 이상의 역병 기주식물이 보고되었으며, 국내에서는 현재까지 16종의 파이토프토라가 46종 작물에 병해를 발생시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)는 주로 감자 및 토마토에, 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici)는 고추, 수박, 오이, 참외 및 토마토 등 여러 종의 식물체 전 부위에 발생하는 것으로 알려져 있으며 한 균주 종이 다수의기주에서 발생되고 있다. 특히, 파이토프토라 인페스탄스와 파이토프토라 캡사이시는 우리나라에서도 감자, 토마토 및 고추에 큰 피해를 입히고 있다.

역병균은 균사 상태로 토양 속의 병든 식물에서 월동하고 병원균이 생육한 후 지상부에 나타나 제 2차 전염원이 된다. 역병은 서늘하고 습도가 높은 환경에서 많이 발생하는데 일단 병이 발생하면 급격하게 병이 진전되기 때문에 작물생산에 크나큰 손실을 초래하는 중요한 식물병 중의 하나이다. 피시움 속 병원균에 의한 벼 종자썩음병 및 입고병은 우리 나라를 포함하여 전 세계적으로 잘 알려져 있으며 그 피해도 심각하다. 우리 나라에서는 피시움속 균이 벼입고병 이외에도 토마토, 오이 등 각종 작물의 묘썩음병을 비롯하여 생강 근경부패병 등 뿌리썩음병을 일으키는 주요 병원균으로 알려져 있다.

또한, 난균류(Oomycetes)의 일종인 역병균은 전형적인 토양 병원균으로서 지금까지는 균 분류학상 사상균에 포함되어 있었으나 최근 개최된 국제 균학회에서 프로티스트(protist)에 속하는 것으로 분류된 바와 같이 이들 병을 방제하기 위해 사용하는 살균제 또한 그 특성이 달라 일반적으로 사용되는 진균용 살균제와는 다른 메타락실(metalaxyl), 디메토모프(dimethomorph), 포세틸-에이1(focetyl-A1) 등이 사용되고 있다.

그러나, 상기 것들은 화학합성 농약이며, 미생물 균주를 직접적으로 이용하는 미생물살균제는 거의 개발되어 있지 않다. 또한, 최근 농업 생산시 유전공학 기법에 의하여 많은 작물들이 수경재배 되고 있지만, 수경재배를 할 경우 물을 선호하는 역병 및 입고병원균에 의한 피해가 많이 보고되고 있고 대부분의 기존 농약들이 물에 녹지 않으므로 그 방제율이 매우 미약하거나 효과가 전혀 없다고 보고되고 있다.

따라서, 오늘날 환경친화형 농업에 대한 관심이 커지면서 미생물을 이용한 생물농약을 이용하는 방제방법에 대한 관심이 커지고 있는 실정이기에, 미생물 균주 또는 미생물 배양액 자체를 사용하는 미생물 살균제의 개발도 절실한 과제라 하겠다.

이에, 본 발명자들은 토양미생물인 방선균을 이용하여 프로티스트에 속하는 역병균이나 입고병균을 생물학적인 방법으로 방제하는 방법을 연구 개발하던 중 이들 병원균에 대해 탁월한 방제 효과를 나타내는 신균주 토양 방선균을 분리하였고 이 균주를 이용하여 역병 및 입고병과 같은 식물병 방제제로서의 개발 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 역병균 및 입고병원균에 선택적으로 항균효과를 나타내는 신균주 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P)를 이용하여 방제하기 어려운 것으로 알려져 있는 역병 및 입고병과 같은 식물병 방제에 효과적인 환경친화형 미생물제제원을 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명에서 사용한 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P) 균주가 벤넷 한천 배지(Bennett's agar)에서 자란 모양을 보여주는 사진이다.

도 2는 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P) 균주 배양액의 희석비율에 따른in vitro상에서의 역병균 파이토프토라(Phytophthora infestans)에 대한 항균활성을 나타낸 사진이다[처리농도는 왼쪽 위부터 오른쪽으로 배양원액, 2배, 4배, 8배, 16배 희석액 처리구 및 대조구임].

도 3은 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P 균주 배양액의 입고병균인 피시움 속(Pythiumsp.)의 균사생장에 대한 균배양액의 저해효과를 나타낸 그래프이다[균사생장저해지수는 1 ∼ 5범위이며 5는 완전한 저해를 나타냄].

도 4는 온실에서 토마토역병 방제실험에서 역병균 파이토프토라 (Phytophthora infestans)에 대한 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P) 균주의 방제효과를 보여주는 사진이다[온실 실험 결과, 처리농도는왼쪽부터 500, 250, 125, 63, 31 ppm 처리구 및 대조구임].

본 발명은 신균주 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P)를 그 특징으로 한다.

또한, 신균주 스트렙토마이세스 속 AG-P의 식물병원균인 파이토프토라 속(Phytophthorasp.)균, 피시움 속(Pythiumsp.)균 등 난균류(Oomycetes) 병원균에 대한 특이적인 항균활성으로 식물역병 및 입고병과 같은 식물병 방제제로서의 이용가능성을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명자들은 식물병 방제를 위한 새로운 미생물을 탐색하고자 전국각지로부터 많은 토양시료를 수집하고, 수집한 토양시료로부터 벤넷 한천(Bennett's agar)배지를 이용하여 역병균 및 입고병균과 같은 식물병원성 난균류(Oomycetes)에 대해 특이적인 활성을 나타내는 균주를 분리하였다. 분리된 방선균을 액체 배양하여in vivopot 실험 등을 실시하여 활성이 가장 우수한 한 균주를 선발하였다.

상기 균주의 동정 및 배양에 관하여 설명하면 다음과 같다.

1. 균주의 동정

1) 균의 형태적 특성

아이에스피(ISP; International Streptomycets Project) 규정에 따라 28℃에서 14일간 배양하고, 광학현미경 및 전자현미경 하에서 형태적 특성을 조사한 결과, 포자의 연쇄형태는 나선상의 형태를 나타내었으며 체인 당 포자의 수는 5 ∼ 10 또는 10개 이상이었고, 포자의 표면은 매끄럽고 포자는 원통형으로 크기는 0.3∼ 0.5 ×0.8 ∼ 1.0 ㎛이었다.

2) 각종 배지에 따른 배양학적 특성

각종 ISP 배지조건에서 28℃에서 14일간 배양한 후 본 균주의 배양 생리적 특성을 조사하였으며, 그 결과는 다음 표 1과 같다. 본 균주의 생육정도는 효모ㆍ맥아 한천, 오트밀 한천, 무기염ㆍ전분 한천, 글리세롤ㆍ아스파라긴 한천, 타이로신 한천, 글루코스ㆍ아스파라긴 한천, 벤넷 한천 등에서는 비교적 양호한 생육정도를 나타내었고 펩톤ㆍ효모ㆍ철 한천 및 영양 한천 등에서는 보통이었다. 한편, 기균사의 색상은 대부분의 배지에서 연한 노란색을 나타내었으며 수용성 색소는 분비하지 않았다.

3) 생리적 특성

본 균주의 생리적 특성을 조사하기 위하여 쉴링-거트리브 한천 배지를 사용하여 28℃에서 14일간 배양한 후 전분가수분해능, 젤라틴 액화능, 밀크 펩톤화 및 응집화능, 멜라닌 색소 형성능, 가제인 가수분해능, 식염내성 정도 및 생육 온도 등을 조사하였으며 이를 다음 표 2에 나타냈다.

4) 탄소원 이용성

본 균주의 탄소이용성을 조사하기 위하여 쉴링-거트리브 한천배지를 사용하여 28 ℃에서 14일간 배양한 후 탄소원 이용능력을 조사하였으며 그 결과를 다음 표 3에 나타냈다. 본 균주는 공시한 12 종류의 탄소원 중 글루코스, 아라비노스, 이노시톨, 만니톨, 프럭토스, 갈락토스, 람노스, 멜리비오스를 잘 이용하였다.

5) 균체성분

본 균주의 균체세포벽 성분을 벡커 등의 방법[Becker 등, Applied Microbiology 12: 421-423, 1964]에 따라 조사한 결과 본 균주의 균체 가수분해 성분인 디아미노피메린산(diaminopimellic acid)은 LL형이었다.

상기와 같이 본 균주의 형태적, 배양적, 생리적 특성 또는 당이용성, 균체성분을 조사한 결과에 따라 본 균주를 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주로 동정하였으며, 본 균주를 스트렙토마이세스 속 AG-P 균주로 명명하고 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 1999년 9월 27일자로 기탁하여 수탁 번호 KCTC 8965P를 부여받았다.

2. 균주의 배양

본 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 탄소원으로는 글루코스와 가용성 녹말(soluble starch)을 사용하고, 질소원으로는 굵은 콩가루(soybean meal), 효모 추출물(yeast extract), 육즙(beef extract)을 사용하였다. 그리고, 디포타슘 하이드로젠 포스페이트(dipotassium hydrogenphosphate)를 사용하였고, pH 조절을 위하여 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)를 사용하여 배양하였다. 배양방법으로는 호기적 조건에서 진탕 배양하였으며, 배양온도는 28℃로 하였다. 또한, 배양기간이나 진탕 배양의 경우 통상 7 일 배양함으로써 활성물질의 생산이 최고에 달하였다.

그리고, 신균주 스트렙토마이세스 속 AG-P 균주를 배양하여in vitro및in vivo상에서 항균활성을 조사한 결과, 역병 및 입고병균에 대하여 고도의 항균활성을 나타내었으며, 주 활성물질은 표준물질과 비교한 결과 파로모마이신임을 알게 되었다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 신균주 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AG-P(KCTC 8965P)의 배양

종배지 및 생산배지로서 글루코스 20%, 가용성 녹말 10%, 거친 콩가루 25%, 육즙 1%, 효모추출액 4%, NaCl 2%, K₂HPO₄0.25%, CaCO₃2%를 함유한 배지에 pH 7.2로 조정한 후 사용하였다. 500 ㎖의 배플드 플라스크(baffled flask) 2개에 각각 50 ㎖씩 분주한 종배지를 121 ℃에서 20분간 살균하고, 이것에 균주의 한천 조각(agar piece)을 접종하고 28℃, 150 rpm에서 2일간 진탕 배양하여 배양기의 종배양으로 사용하였다. 121℃에서 20분 살균한 400 ㎖을 함유한 2 ℓ배플드 플라스크에 종배양액 2.5%를 접종하여 28℃에서 7일간 140 rpm의 속도로 진탕 배양하였다.

실시예 2 : in vitro 항균 활성

상기 실시예 1에서 얻은 배양액을 사용하여 진균류에 대한 항균활성을 검정하였다. 본 검정에 사용된 피검균주인 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides)를 비롯하여 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum), 페니실리움 익스펜숨(Penicillium expensum), 페니실리움 속(Penicilliumsp.), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 뮤코 앰비고우스(Mucor ambigous), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) ATCC26081, 피시움 속(Pythiumsp.) 등 여러 종류의 진균류에 대하여in vitro상에서 항균활성을 조사하였다. 감자액체 배지에 진균과 본 발명에서 분리 선발한 스트렙토마이세스 속 AG-P(KCTC 8965P) 균주 배양액을 V8 쥬스 배지 중 10%농도가 되게 처리하여 균 생육여부를 관찰하였다. 그 결과, 기타 여러 종류의 진균에는 활성이 없었지만 토마토 및 감자 역병균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)에 대하여는 본 발명 균주가 매우 활성이 강하여 배양원액을 8배 희석한 경우에도 균의 생장을 억제하였다[도 2]. 한편, 파이토프토라 유사속균인 입고병균 피시움 속(Pythiumsp.)에 대한 항균활성의 결과[도 3]도 파이토프토라에 대한 항균활성 결과와 대체로 비슷하거나 약간 강한 것으로 나타나 상기 두 난균류의 생물방제제원으로서 이용될 수 있음을 나타내었다.

실시예 3 : in vivo 항균 활성

In vivo상에서 토마토 역병 및 다른 여러 식물병에 대하여 효과가 있는지를 식물에 직접 처리하여 그 활성을 온실에서 검정하였고 그 결과, 벼도열병, 벼입고병, 토마토역병, 밀붉은녹병 등에 방제효과가 있었으며, 특히 토마토역병과 밀붉은녹병에 대하여도 방제효과가 강하였다[표 4].

토마토 역병에 대한 방제 효과를 조사하기 위한 스크리닝 방법으로서는 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)의 포자농도를 10⁵포자낭 (sporangia)/㎖로 포자현탁액을 만들어 13℃에서 2.5시간 저온 처리하여 유주자를 유출시킨 후 AG-P 균주 배양액 3 ㎖이 처리된 토마토 유묘(제 2 ∼ 3 엽기)에 분무접종하였다. 토마토 유묘는 20℃ 습실 상에서 48시간 습실 처리한 후 20℃ 항온항습실상(상대습도 95% 이상)에서 3일간 발병시킨 후 실험에 사용하였고, 활성은 병반면적을 조사하여 나타내었다. 기타 벼도열병, 벼입고병, 오이잿빛곰팡이병, 밀붉은녹병, 보리흰가루병에 대한 방제효과도 비슷한 방법으로 실험하였다. 첨부한 도면 도 4에 나타난 바와 같이 토마토 역병에 대해 그 효과가 매우 높게in vivo에서 나타났고, 이러한 결과는 토마토 역병균인 파이토프토라 인페스탄스에 대하여 배지에서의 활성과 마찬가지로 선택성이 있음을 나타내 주었다. 또한, 상기 결과는 역병균인 파이토프토라와 유사균류 입고병균인 피시움 속(Pythiumsp.)에 대해서도 저해 및 방제효과가 대체로 비슷하며 그 효과도 매우 높았던 점에서 벼 입고병 방제에도 효과적으로 이용될 수 있음을 나타내었다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 난균류(Oomycete)에 대해 특이적 항균활성을 나타내는 우수한 신균주를 분리 동정하고, 이 균주를 배양하여 역병 및 입고병에 대하여 강한 항균활성을 나타내는 것을 알게 되었다. 따라서, 상기 신균주가 환경친화형 생물농약으로서 이용 가능하고 식물역병 및 입고병과 같은 식물병에 매우 유용한 효과를 가진다.

Claims

식물병원균 난균류에 의한 식물역병 및 입고병 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P).
스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.) AG-P(KCTC 8965P)와 농학적 허용 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제제.
제 2 항에 있어서, 상기 식물병이 식물역병 또는 입고병인 것을 특징으로 하는 식물병 방제제.