KR20020057463A

KR20020057463A - 식물병 억제 길항균의 선발방법 및 그로부터 선발된 신규미생물

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Publication number: KR20020057463A
Application number: KR1020010000501A
Authority: KR
Inventors: 김정동; 김윤성; 김현겸; 이현태
Original assignee: 이병길; 주식회사 에코바이오
Priority date: 2001-01-05
Filing date: 2001-01-05
Publication date: 2002-07-11

Abstract

본 발명은 식물병 억제효과가 있는 토양유래 미생물의 선발방법, 그러한 방법으로 선발된 신규 미생물에 관한 것으로서, 종래의 대치배양과는 달리 포장(field)에 유사한 식물병 발생 모델 시스템을 개발하여 식물병에 길항작용을 가진 토양유래 미생물을 선발하고, 그러한 방법에 의해 특히 오이 모잘록병균(Pythium ultimum), 고추 역병균(Phytophthora capsici), 토마토 시들음병균(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici) 등에 길항작용을 갖는 신규 미생물을 제공한다. 종래의 길항균 선발방법이 주로 미생물의 2차 대사산물에 의한 병원균의 균사생장 억제 현상을 이용한 반면, 본 발명은 기존의 방법으로는 선발하기 어려운 미생물 중 토양내에서 병원균과 미생물과의 다양한 상호작용을 통해 병이 억제되는 현상을 이용하여 유용 미생물을 선발하는 방법을 제시하고 있다.

Description

식물병 억제 길항균의 선발방법 및 그로부터 선발된 신규 미생물 {Differential Screening Methods for Antagonistic Microorganism against Plant Pathogenic fungi and Antagonists selected therefrom}

본 발명은 식물병 억제효과가 있는 토양유래 미생물의 선발방법, 그러한 방법으로 선발된 신규 미생물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 종래의 대치배양과는 달리 포장(field)에 유사한 식물병 발생 모델 시스템을 개발하여 식물병에 길항작용을 가진 토양유래 미생물을 선발하고, 그러한 방법에 의해 특히 오이 모잘록병균(P. ultimum), 고추 역병균(P capsici), 토마토 시들음병균(F. oxysporum f.sp. lycopersici)등에 길항작용을 갖는 신규 미생물을 제공한다.

인공적인 화학물질을 사용하지 않고 자연에 존재하는 미생물을 이용하여 농약을 개발하고자 하는 체계적인 연구가 이루어지기 시작한 19세기 이후부터 생물학적 방제에 가장 큰 문제점으로 지적되어온 유용미생물을 선발하는 다양한 방법이 개발되어왔다. 이러한 방법의 일환으로, 현대 합성농약에서는 농약의 작용점으로 병원균에 직접 작용하여 죽이는 것이 아니라 병원균이 병을 일으키는데 필요한 일부 대사과정을 억제해서, 병 발생을 억제하는 작용기작(mode of action)을 이용하고자 하는 노력들이 이루어지고 있다. 그 대표적인 예인 벼 도열병 방제용 살균제인 트리시클라졸(tricyclazole: Beam)은 균의 생장에 직접적인 영향을 주지 않아서 농약에 대한 약제 저항성 발현이 매우 느리며 다른 생물이 가지고 있지 않은 대사를 저해하기 때문에 다른 생물에 영향을 최소화하는 저독성 농약이다. 또한, 프로베나졸(probenazole) 같은 농약은 식물 병원균을 직접 죽이지는 않지만 식물에 저항성을 유도하여 병을 억제하는 것으로 알려져 있다.

이런 현대의 농약개발의 추세에 맞추어서 생물농약 제조를 위한 길항 미생물을 선발하기 위한 다양한 시도가 있었지만, 기존의 방법을 통해서 선발된 미생물을 이용하여 실제 포장(field)에서 효과를 발휘하고 이것이 제품으로 개발되는 예는 매우 드물었다. 그 이유는 길항 미생물의 선발이 이하 자세히 설명하는 대치배양(dual culture)법을 통해 이루어지기 때문인데, 이 방법은 식물에 병을 일으키는 병원균과 길항 후보 미생물이 모두 이용할 수 있는 배지(medium)에서 동시에 배양하여 길항균이 병원균의 생육을 억제하는 현상을 확인함으로써 길항균을 선발한다.

미생물을 이용하여 식물병을 제어하고자 하는 선행된 기술로서, 한국공개특허공보 제92-2031호, 제95-18444호, 제97-15734호, 제97-700761호, 제97-70194호, 제1998-67506호와 한국특허 제220402호는 길항효과을 가진 미생물을 발견했지만 미생물을 선발하는 방법에 대해서는 언급되어 있지 않다. 또한, 한국공개특허공보 제1999-78942호, 제1999-79916호, 제2000-19606호, 제2000-36322, 제2000-45843호, 제2000-56261호, 제2000-0058234호, 및 한국특허 제245514호와 제252198호는 길항균을 선발하는 방법으로서 배지상에서 병원균의 균사생장저지 길이를 측정하는 대치배양법을 사용하였음을 명시하고 있다. 한국공개특허공보 제2000-38895호는 통상의 삼중층 평판법을 이용하였다고 명시되어 있는바, 이 방법 역시 배지상에서 병원균의 생육을 억제하는 현상을 통해 선발하는 방법이다. 한국공개특허공보 제2000-40193호는 특이적 길항효과로 알려져 있는 사이드로포어(siderophore)를 생성하는 슈도모나스 플로오레센스(Pseudomonas fluorescens)를 선발하기 위한 선택배지를 사용하는 방법을 개시하고 있다. 기타 한국공개특허공보 제1999-62362호는 미국종균협회에 등록된 공시균 ATCC21431을 길항균으로 사용해 길항 미생물 제제를 제조하는 내용을 개시하고 있다.

하지만, 이 방법을 통해 선발된 길항균의 경우 대부분이 물질을 분비하는 미생물로 식물에 병을 일으키는 상호관계를 직접적으로 억제하지 못하는 경우가 대부분이어서 포장에서 효과가 나타나는 경우는 매우 드물다. 이런 문제점을 해결할수 있는 방법의 하나로서, 미생물이 분비하는 물질을 대량으로 생산하여 화학농약처럼 사용하는 경우를 들 수 있지만, 이것은 화학농약을 사용했을 때와 유사한 문제를 야기할 수 있다. 또한, 물질자체를 이용하는 것은 그 생산과정 때문에 매우 고가일 수밖에 없으므로 경제적 측면에서 농약으로서의 가치는 거의 없다고 할 수 있다.

그러므로, 현재 전 세계적으로 미생물 살균제로 등록되어 사용되는 경우는 살아있는 미생물 자체가 길항작용을 가진 것으로 내생포자(endospore)를 만들어 생존에 유리한 바실루스(Bacillus) 속과 병원균에 기생하는 트라이코덜마 (Trichoderma) 속, 그리고 병원균과 철 경쟁을 통해 길항작용을 나타내는 슈도모나스(Pseudomonas) 속이 대부분을 차지하고 있다. 이것은 현재 다양한 유용 미생물을 효과적으로 선발할 수 있는 방법이 존재하지 않음을 암시하는 것이다.

따라서, 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점을 해결하고 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

즉, 종래의 방법과 차별되는 미생물 선발 방법을 개발함으로써 새로운 작용점을 갖는 신규 미생물을 선발할 수 있고, 이를 이용한 새로운 미생물 살균제를 개발할 수 있도록 하는 것이다. 현재까지는, 유용 미생물의 효과를 검정하는 방법으로, 병이 자연적으로 발생하는 포장에서 직접 식물을 키우고 여기에 미생물을 처리하여 효과를 측정하는 것 이외에는 별다른 방법이 없기 때문에, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 실험실 수준에서 포장실험과 가장 유사한 모델 시스템을 개발하여 경제적이면서도 빠르고 손쉽게 유용 미생물을 선발하는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 이러한 길항균의 선발을 가능케 하는 길항균 선발 모델 시스템의 제공을 목적으로 한다.

본 발명의 또다른 목적은 이러한 선발방법을 통해 식물병에 길항작용을 갖는 신규 미생물을 제공하는데 있다.

도 1은 본 발명의 식물병 억제 길항균 확인 모델 시스템의 대략적인 구성도이고;

도 2는 다양한 대조구와 본 발명 처리구의 대략적인 구성도이고;

도 3은 EBCC100002와 EBCC50001의 오이 모잘록병균(P. ultimum)의 방제를 위한 최소효과농도 결정실험의 결과를 도시한 그래프이고;

도 4는 EBCC100002와 EBCC50001의 고추 역병균(P capsici)에 의한 고추역병 발병억제 실험의 결과를 도시한 그래프이다.

이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 식물병 억제 길항균의 선발방법은,

(a) 병이 발생된 포장의 토양과 병이 억제된 포장의 토양을 동시에 채집하는 단계;

(b) 병이 발생된 포장의 토양으로부터 채집된 병원균을 선택배지에서 분리하고 적당한 배지에서 배양하여 이를 배양용기의 하단의 배지 위에 접종시키는 단계;

(c) 미생물 분리용 배지 또는 선택성 배지를 사용하여, 병이 억제된 토양에 특이적으로 존재하는 길항균 후보 균주를 선발하는 단계;

(d) 상기 길항균 후보 균주를 배양한 후 미생물 세포(cell)만을 분리하여 토양 혼합물과 혼합한 뒤, 상기 단계(b)의 병원균이 접종된 배지 상단에 위치시키는 단계;

(e) 토양의 상단에 식물을 파종한 후, 병의 발생 유무로 적정 길항균인지를 확인하는 단계를 포함한다.

상기 단계 (c)에서 미생물을 선발하는 기준은 각각의 배지에 형성되는 배양특성 중, 특히 균총(colony)의 모양 및 색 등이다.

길항균을 확인하는 종래의 대치배양(dual culture)법은 균주가 배양되는 배지의 양단에 병원균과 후보 길항균을 접종시키고, 이들을 일정시간 배양한 후, 병원균의 균사의 생장이 억제된 구역의 길이를 측정하는 것으로 행해진다. 이러한 대치배양법은 후보 길항균이 분비하는 물질(항생물질)이 병원균을 파괴하거나 그것의 성장을 억제함으로써 나타나는 효과를 가시적으로 확인하는 방법이다. 그러나, 다양한 길항균에 의한 병원균의 파괴 및/또는 성장억제에 대한 반응기작과 토양 및/또는 균주 등과의 상호작용이 정확히 알려져 있지 않은 상태에서 종래의 대치배양법은 한계를 드러내고 있다. 즉, 대치배양법에서는 우수한 길항작용을 갖는 균주가 실제 포장에서는 식물병을 억제하지 못하는 경우와, 대치배양법에서는 길항작용을 갖지 못하는 것으로 확인된 균주가 실제 포장에서는 식물병에 대한 억제에서는 우수한 효과를 발휘하는 경우가 많다. 결국, 본 발명자들은 토양 병원균과 기주식물 사이에 일어나는 상호작용의 연구를 통하여 식물병 발생을 억제할 수 있는 길항 미생물을 선발하는 실험방법을 개발한 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 이러한 실제 포장에서 식물병 유발 병원균에 대해 우수한 길항 효과를 나타내는 균주를 확인하기 위한 식물병 억제 길항균 확인 모델 시스템에 관한 것이다.

구체적으로, 식물병 억제 길항균 확인 모델 시스템은 배양용기의 내부에

(ⅰ) 멸균된 배지에 병원균을 접종시킨 후 배양하여 형성된 병원균 배지,

(ⅱ) 병억제 토양(suppressive soil)에 특이적으로 존재하는 길항균 후보 균주의 세포를 토양 혼합물과 혼합함으로써 형성된, 상기 병원균 배지의 상단에 위치하는 길항균 후보 균주처리 토양, 및

(ⅲ) 발아된 식물 종자를 파종함으로써 형성된, 상기 길항균 후보 균주 토양의 상단에 위치하는 식물이 파종된 토양을 포함하는 것으로 구성되어 있다.

상기 (ⅰ)의 병원균 배지의 구성 예로는, 배양용기 안에 물한천배지(water agar)를 분주하고 115 내지 121℃에서 10 내지 20분간 살균한 후 병원균을 접종해서 25 내지 30℃의 암상태에서 약 1일간 배양한다.

상기 (ⅱ)의 후보 길항균 토양의 구성 예로는, 후보 길항균을 최적 배지 배양조건에서 배양하고 원심분리 또는 필터링하여 미생물 세포(cell)만을 수거한 후, 배양용액과 동일한 부피의 살균 수돗물로 희석하여 처리되는 토양 부피의 1/2의 부피로 토양 혼합물과 잘 섞은 뒤 배양용기에 2 내지 4㎝ 높이로 담는다. 상기 토양 혼합물로는, 예를 들어, 원예용토(TKS-1), 질석(vermiculite) 및 펄라이트(perlite)의 약 1:1:1(v/v/v) 혼합물을 사용한다.

본 발명의 식물병 억제 길항균 확인 모델 시스템의 대략적인 구성이 도 1에 도시되어 있다. 도 1은 식물병 유발 병원균으로서 오이 모잘록병균(Pythium ultimum)을 사용하고 식물종자로서 오이종자를 사용한 모델 시스템을 개시하고 있다. 모델 시스템에 적용될 미생물은 식물병 억제토양(Plant disease suppressive soil)에 특이적으로 존재하는 미생물을 사용하여 실험에 들어가는 시간과 비용을 절감할 수 있다.

본 발명은 또한 상기와 같은 방법으로 식물병에 대하여 실제 포장에서 길항작용을 하는 신규 길항균에 관한 것이다.

상기 식물병 억제 길항균 확인 모델 시스템을 바탕으로, 길항균 처리는 최적배지를 이용하여 토양에서 분리된 후보미생물을 배양한 후 배지를 제거하기 위해 원심분리 또는 필터링을 통해 세포만을 수거하고 배양용액과 동일한 양의 살균 수돗물에 희석한 후 혼합토양(soil mixture)의 부피의 1/2로 섞어 길항균의 병억제 효과를 측정하였다. 본 발명에서 이용된 선발방법은 앞서 설명한 오이 모잘록병 등을 유발하는 병원균뿐만 아니라 다양한 토양 식물 병원균에 대해서도 적용할 수 있으며 이러한 방법에 의해 포장에서도 효과를 발휘할 수 있는 유용미생물을 선발할 수 있었다.

이와 같은 방법으로, 오이 모잘록병과 고추 역병 및 토마토 시들음병에 효과가 우수한 균주를 선발하여 각각 EBCC100002 및 EBCC50001으로 명명하였다. Burgey's manual of systemic bacteriology에 기술된 분류방법에 따라 EBCC100002 는 방선균(Actinomyces) 중 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속이며, EBCC50001은 세균(Bacteria)으로 슈도모나스 퓨티다인(Pseudomonas putida)으로 동정되었다. 이들 균주는 사단법인 한국종균협회에 2000년 11월 20일자 수탁번호 제KFCC-11247호 및 제KFCC-11246호로 기탁하였다.

본 발명에서는 특히, 각종 원예작물의 유묘기에 모잘록병을 일으키는 오이 모잘록병균(P. ultimum), 고추 역병균(P capsici), 그리고 토마토 시들음병균(F. oxysporum f.sp. lycopersici)을 식물병 발생 모델시스템으로 개발하여 길항균을선발하였다.

상기 모잘록병균(P. ultimum)은 유묘기 식물에 모잘록병(damping-off)을 일으키는 병원균으로 토양 내에서 증식이 매우 빠르고 저온 다습한 조건에서 쉽게 발생하는데 일단 감염되면 어린식물을 도복시켜 완전히 썩게 만드는 병원균이고 성체가 된 식물에는 거의 병을 일으키지 못하지만 식물생육을 현저하게 저하시키는 병이다. 그러므로, 이 병을 방제하기 위해서는 병발생에 유리한 조건에서 병원균이 증식되어 식물종자를 감염하는 일련의 병발생 과정(pathogenesis)이 수행되는 모델시스템이 필요하며, 이 모델시스템을 수행하기에 적당한 작물로 오이를 이용하여 본 발명의 길항균 선발방법을 개발하였다.

고추 재배시 가장 큰 피해를 주는 역병을 일으키는 상기 고추 역병균(P. capsici)은 고추 생육 전단계에서 발병시킬 수 있기 때문에, 이에 대한 길항균 선발은 시간과 경비절감을 위해 고추 유묘에서 실험하는 것이 효과적이며, 이에 대한 병발생 모델시스템을 개발하였다.

각종 채소류에 시들음병을 야기하는 상기 토마토 시들음병균(F. oxysporum)은 병을 일으키기 위한 특이적 구조체인 후막포자를 형성시켜야 하며, 후막포자를 일정하게 처리하여 동일한 병발생 압력(disease pressure)이 필요하기 때문에, 후막포자를 형성시켜서 처리하는 새로운 방법을 개발하여 모델시스템을 개발하였다.

상기 모델시스템을 이용하여 선발된 EBCC100002는 그람염색(Gram stain)에 양성이고, 생육 pH는 5.0 내지 9.0 이며, 생육온도는 10 내지 50℃이고, 내염성 10%인 특성을 보인다. 이 미생물은 방선균으로 ISP(International StreptomycesProject)에서 제시된 배지[이스트-맥아 한천배지(ISP2), 오트밀 한천배지(ISP3) 무기염 한천배지(ISP4), 글리세린-아스파라긴 한천배지(ISP5)]를 사용하여, 포자와 기중균사 등의 형태적 특성과 생육상태, 기균사의 착생상태, 색조, 색소 확산 등의 배양적 특성을 통해 속이 동정되었다.

선발된 또 다른 미생물 EBCC50001은 그람염색에 양성이고, 생육 pH는 4.0 내지 9.0이며, 생육온도는 10 내지 40℃이고, 내염성은 10%이다. 효모추출 배지(YDC) 음성, 킹스비 배지(KB) 음성 등 선택배지를 통한 동정결과 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida)로 동정되었다.

본 발명의 더욱 구체적인 내용을 하기 실시예를 통해 자세히 설명하지만, 본 발명의 범주가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(실시예)

실시예 1: (식물병 억제토양에 특이적으로 존재하는 미생물 분리)

식물병 억제토양에 존재하는 특이적 미생물들의 효과를 검정하기 위한 방법으로 전체적으로 병이 발생된 포장 중에 병발생이 억제된 일부 토양이 존재할 경우, 발병 포장 토양과 병 억제 토양을 동시에 채집하였다. 토양이 채집된 지역은 경기도 광주군, 강원도 횡성군, 경기도 양평군, 충청남도 논산시, 전라남도 장성시 등으로 주로 농약을 살포하지 않는 유기농가였다. 미생물 분리를 위해 영양한천배지(Nutrient agar), 트립틱 콩 한천배지(Tryptic soy agar) 등 일반적 세균 배양용 배지뿐만 아니라 에멀젼 한천배지(Emergen agar), 코리네박테리움 선택배지(Corynebacterium selective medium), 믹소코코스 선택배지(Myxococcusxanthus selective medium), 슈도모나스 선택배지(Pseudomonas F medium), 트립톤-효모추출 한천배지[Trypton-yeast extract agar(IPS1)], 효모ㆍ맥아추출 한천배지[Yeast extract malt extract agar(IPS2)], 귀리 한천배지[Oatmeal agar(IPS3)], 무기염소-전분 한천배지[Inorganic salt starch agar(IPS4)], 글리세롤-아스파라긴 한천배지[Glycerol-asparagine agar(IPS5)], 펩톤-효모추출 한천배지[Peptone-yeast extract agar(IPS6)], 티로신 한천배지[Tyrosine agar(IPS7)], 질산염 한천배지[Nitrate agar(IPS8)], 벤넷 한천배지[Bennett's agar] 등의 선택성 배지를 사용하였다.

상기 미생물 선택배지를 사용해 채집된 토양에서 미생물을 분리하고, 이중 각 배지에서 식물병 억제토양에 특이적으로 존재하는 미생물을 선발하였다. 여기서 다른 균주로 분리된 기준은 각각의 배지에서 형성되는 균총의 배양적 특성 중 특히 균총의 형태 및 색깔 등이었다. 선발된 길항균 중 본 발명에 사용한 균주목록은 하기 표 1과 같다.

균 주	채집지역	분리된 배지	균총의 형태 및 색깔	최적배양 조건
EBCC100002	강원도 횡성	CSA	흰색균사 및 회색 기중균사	ISP2, 28℃
EBCC50001	경기도 양평	TSA	노란색 둥근모양	NA, 30℃
EBCC100001	강원도 홍천	ISP2	노란색 균체 및 회색 기중균사	ISP2, 28℃
EBCC100007	강원도 홍천	NA	퍼지는 흰색균사	ISP2, 28℃
EBCC50003	경기도 광주	CSA	무색의 퍼지는 모양	NA, 30℃

본 발명에서 개발된 유용미생물 선발방법을 통해 가장 효과가 뛰어난 균주는 EBCC100002와 EBCC50001로 기존의 유용미생물 선발방법인 대치배양을 통해서는 크게 효과가 없었다.

이와는 반대로, 본 발명의 방법을 통해서는 효과가 없는 EBCC50003은 대치배양에서는 오히려 결과가 가장 좋은 균주로 확인되었는바, 각각의 균주에 대한 대치배양의 결과를 하기 표 2에 개시한다. 대치배양 방법은 감자한천배지에서 P. ultimum은 2일간, P. capsici, F. oxysporum f.sp. lycopersici는 7일간 28℃의 암상태에서 각각 배양하고, 선발된 후보미생물은 각각의 적정배지 온도조건에서 균총이 완전히 형성될 때까지 배양시킨다. 야채주스 한천배지(V8 juice agar) 중앙을 가로질러 미생물을 접종하고, 양끝에 병원균을 접종하여, 28℃의 암상태에서 배양하였다. 대조구로 미생물을 접종하지 않고 병원균만 접종하여, 양쪽 병원균의 균사가 가운데에서 만났을 때 미생물에 의해 병원균의 균사 억제구역길이를 측정하였다.

균 주	병원균균사 억제구역길이 (mm)
균 주	Pythium ultimum	Phytophthora capsici	Fusarium oxysporumf. sp.lycopersici
EBCC100002	0	4	5
EBCC50001	0	0	3
EBCC100001	0	10	17
EBCC100007	5	8	12
EBCC50003	8	11	23

실시예 2: (미생물로 처리된 토양 혼합물에 의한 오이종자 발아시 P. ultimum 감염억제 확인 모델 시스템 및 길항균 효과검정)

배양용기 안에 물한천배지(water agar: WA)를 분주하고, 121℃에서 15분간 살균한 후 P. ultimum을 접종하여, 28℃의 암상태에서 1일간 배양하였다. 길항균후보 균주는 최적 배양조건에서 배양한 후 원심분리 또는 필터링을 하여 미생물 세포만을 수거한 후 배양용액과 동일한 부피의 살균수돗물로 희석하여 처리되는 토양 부피의 1/2의 부피로 토양 혼합물[원예용토(TKS-1): 질석(vermiculite): 펄라이트(perlite) = 1:1:1(v/v/v)]과 잘 섞은 후 배양용기에 3cm 높이로 담았다. 처리 후 6시간에 발아된 오이종자(품종: 백봉다다기)를 병속의 토양에 파종하였다. 파종 후 3일째 병원균이 처리되지 않은 대조구의 오이종자가 정상적으로 뿌리가 발달되어 성체로 생장하였고, 병원균만을 처리한 대조구에서 병이 발생하여 종자 또는 뿌리가 썩거나 생육이 억제되는 현상과 비교하여, 미생물 세포를 처리한 처리구에서 병이 발생하지 않는 것을 후보 길항 균주로 선발하였다. 오이 모잘록병에 대한 화학농약으로 리도밀(metalaxyl)의 관행농도(1g/ℓ)를 사용하여 기존 농약과의 대조구로 삼았다. 대조구와 본 발명의 처리구의 대략적인 구성을 도 2에 도시하였다.

처 리	오이 식물 생존률 (%)
처 리	1차 실험	2차 실험	3차 실험
병원균 무접종 대조구	100	100	100
병원균 접종 대조구	0	0	16.5
리도밀 대조구	100	100	100
EBCC100002	100	89	100
EBCC50001	100	67	100
EBCC100001	56	18	0
EBCC100007	44	0	0
EBCC50003	11	0	0

실시예 3: (EBCC100002와 EBCC50001의 P. ultimum의 방제를 위한 최소효과농도 결정실험)

실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 실시하되, 방선균 EBCC100002는 배양액을 거름종이(Whatman No.1)로 걸러서 얻어진 균체 무게에 대한 물의 희석량을 조절하여 다양한 농도로 처리하였다. 세균 EBCC50001은 원심분리(1500g, 15분)하여 세포만을 수거하여 다양한 농도로 처리하였다. EBCC100002는 균체 농도 20g/ℓ에서, EBCC50001는 1011 C.F.U./㎖에서 100% 방제가를 보였다. 그 결과를 도 3에 도시한다.

실시예 4: (EBCC100002와 EBCC50001의 P. capsici에 의한 고추역병 발병억제 실험)

EBCC100002와 EBCC50001을 최적배양조건에서 배양한 후 원심분리 또는 필터링을 하여 미생물 세포만을 수거하였다. 수거된 세포를 배양용액과 동일한 부피의 살균수돗물로 희석하여 처리되는 토양 부피의 1/2의 부피로 토양혼합물[원예용토: 질석: 펄라이트 = 1:1:1(v/v/v)]과 잘 섞은 후, 본 발명의 배양용기에 담고 발아된 고추종자(품종: 마니따)를 파종한 후 14일간 생육시켰다. 고추 역병균(P. capsici)은 귀리 한천배지(oatmeal agar)에서 28℃로 7일간 배양하고, 48시간 동안 형광등 아래서 광처리 후, 살균수를 붓고 4℃에서 30분간 저온처리를 하였다. 상온에서 1시간 후 유주포자낭에서 나온 유주포자 수를 해모시토미터(haemocytometer)를 이용하여 토양 1g 당 10 개의 포자농도로 희석하여, 고추 식물에 접종하였다. 접종 7일 후부터 병원균만을 접종한 대조구에서 병이 발생하고 EBCC100002와 EBCC50001의 처리구에서는 유의한 수준으로 병발생이 억제됨을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 도시한다.

실시예 5: (EBCC100002와 EBCC50001의 F. oxysporum f.sp. lycopersici에 의한 토마토 시틀음병 발병억제 실험)

EBCC100002와 EBCC50001을 최적배양조건에서 배양한 후 원심분리 또는 필터링을 하여 미생물 세포만을 수거하였다. 수거된 세포를 배양용액과 동일한 부피의 살균수돗물로 희석하여 처리되는 토양 부피의 1/2의 부피로 토양혼합물[원예용토: 질석 : 펄라이트 = 1:1:1(v/v/v)]과 잘 섞은 후 배양용기에 담고, 발아된 토마토 종자(품종: 선명)를 파종해서 10일간 생육시켰다. 병원균 접종원인 F. oxysporum f.sp. lycopersici는 감자 한천배지(PDA) 상에서 7일 배양한 후, 5mm의 배지조각(agar block)을 5㎖의 감자 액체배지(PDB)에 접종하여 3일간 배양하였다. 후막포자를 배양하기 위한 배지로 셀러리(celery)를 물과 1:4(v/v) 비율로 100℃에서 30분간 끓인 후 두 겹의 거즈(cheese cloth)로 거르고, 습열고압 살균(121℃, 15분)을 한 후 사용하였다. F. oxysporum f.sp. lycopersici이 배양된 감자 액체배지(PDB) 5㎖을 셀레리 추출액 100㎖ 접종하고, 형광등 아래에서 28℃로 10일간 배양하여 접종원으로 사용하였다. 미생물이 처리된 토양 혼합물에서 10일간 생육된 토마토 식물에 셀러리에서 배양된 후막포자 접종원을 토양 부피의 1/2로 섞어서 용기에 이앙하였다. 접종 14에서 20일 후부터 EBCC100002와 EBCC50001을 처리하지 않은 대조구에서 병이 발생하고, EBCC100002와 EBCC50001의 처리구에서는 유의한 수준으로 병발생이 억제되었다.

본 발명의 식물병 억제 길항균 선발방법은 종래의 대치배양법과는 달리 실제 포장(field)에서도 우수한 길항작용을 가진 미생물을 간편하고 빠른 방법으로 선발할 수 있으며, 본 발명에서 새로이 확인한 EBCC100002와 EBCC50001은 오이 모잘록병균(P. ultimum), 고추 역병균(P. capsici), 그리고 토마토 시들음병균(F. oxysporum f.sp. lycopersici) 등의 토양유래 식물병의 억제에 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었으므로, 생물농약의 제조에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Claims

(a) 병이 발생된 포장의 토양과 병이 억제된 포장의 토양을 동시에 채집하는 단계;

(b) 병이 발생된 포장의 토양으로부터 채집된 병원균을 선택배지에서 분리하고 적당한 배지에서 배양하여 이를 배양용기의 하단의 배지 위에 접종시키는 단계;

(c) 미생물 분리용 배지 또는 선택성 배지를 사용하여, 병이 억제된 토양에 특이적으로 존재하는 길항균 후보 균주를 선발하는 단계;

(d) 상기 길항균 후보 균주를 배양한 후 미생물 세포(cell)만을 분리하여 토양 혼합물과 혼합한 뒤, 상기 단계(b)의 병원균 배지 상단에 위치시키는 단계;

(e) 토양의 상단에 식물을 파종한 후, 병의 발생 유무로 적정 길항균인지를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병 억제 길항균의 선발방법.
배양용기의 내부에,

(ⅰ) 멸균된 배지에 병원균을 접종시킨 후 배양하여 형성된 병원균 배지,

(ⅱ) 배양 후 분리한 길항균 후보 균주의 세포를 토양 혼합물과 혼합함으로써 형성된, 상기 병원균 배지의 상단에 위치하는 길항균 후보 균주 토양, 및

(ⅲ) 발아된 식물 종자를 파종함으로써 형성된, 상기 길항균 후보 균주 토양의 상단에 위치하는 식물 토양를 포함하는 것으로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 식물병 억제 길항균 확인 모델 시스템.
제 2항에 있어서,

상기 (ⅰ)의 병원균 배지는, 배양용기안에 물한천배지(water agar)를 분주하고 115 내지 121℃에서 10 내지 20분간 살균한 후 병원균을 접종해서 25 내지 30℃의 암상태에서 약 1일간 배양하여 제조하고,

상기 (ⅱ)의 후보 길항균 토양은, 후보 길항균을 최적 배지 배양조건에서 배양하고 원심분리 또는 필터링하여 미생물 세포(cell)만을 수거한 후, 배양용액과 동일한 부피의 살균 수돗물로 희석하여 처리되는 토양 부피의 1/2의 부피로 토양 혼합물과 잘 섞은 뒤 배양용기에 2 내지 4㎝ 높이로 담아 제조하는 것을 특징으로 하는 식물병 억제 길항균 확인 모델 시스템.
토양 식물병을 억제하는 스트렙토마이세스속의 EBCC100002 (수탁번호: 제KFCC-11247호)
토양 식물병을 억제하는 슈도모나스 퓨티다인 EBCC50001 (수탁번호: 제KFCC-11246호).
제 4항에 있어서, 식물병이 오이 모잘록병 (P. ultimum), 고추 역병(P. capsici) 및 토마토 시들음병(F. oxysporum f.sp. lycopersici)등 주요 토양병원균인 것을 특징으로 하는 EBCC100002.
제 5항에 있어서, 식물병이 오이 모잘록병 (P. ultimum), 고추 역병(P. capsici) 및 토마토 시들음병(F. oxysporum f.sp. lycopersici)등 주요 토양병원균인 것을 특징으로 하는 EBCC50001.