KR20050040156A - 신규한 방선균속 (Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.)에속하는 신규균주 및 그 균주의 배양액을 포함하는농용미생물제제 - Google Patents

신규한 방선균속 (Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.)에속하는 신규균주 및 그 균주의 배양액을 포함하는농용미생물제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 방선균속 (Streptomyces sp.)에 속하는 신규균주 및 그 균주의 배양액을 포함하는 농용미생물제제에 대한 발명으로, 밀녹병에 대한 항균성물질을 개발하기 위하여 토양에서 분리한 방선균으로부터 항균성물질을 조사하여 농용미생물제제로의 이용에 대한 발명이다.

Description

신규한 방선균속 (Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.)에 속하는 신규균주 및 그 균주의 배양액을 포함하는 농용미생물제제{A novel Streptomyces sp. and agricultural microbiological agents comprising the strain broth}
본 발명은 신규한 방선균속 (Streptomyces sp.)에 속하는 신규균주 및 그 균주의 배양액을 포함하는 농용미생물제제에 대한 발명으로, 밀 재배에서 심각한 피해를 주고 있는 밀녹병에 대한 생물농약을 개발하기 위하여 토양에서 분리한 방선균으로부터 항균성물질을 조사하여 농용미생물제제로의 이용에 대한 발명이다.
밀녹병은 Puccinia recondita에 의해 발병하는데 밀 잎 표면에 붉은오렌지색의 포자 덩어리가 나타나게 되어 마치 녹가루처럼 보인다하여 녹병으로 이름 지어졌다. 이 포자는 한 병반에서 많은 수의 포자가 형성되고 바람에 의해 운반되므로 환경이 발병에 적당하여 병이 일어나면 급속하게 확산되는 식물병이다. 이 병은 잎이 습하고 온도가 15℃에서 25℃ 사이에서 잘 발병하므로 우리나라 기후에서 발병이 잘된다. 방제를 위해서 사용되고 있는 약제는 flusilazole과 mancozeb가 있다. 그러나 농약의 지속적인 사용으로 인하여 약제 저항성이 많이 생겼고, 이를 방제하기 위하여 과량의 농약이 사용되고 있다. 그리고 최근에는 농약에 대한 일반인의 인식이 나쁘며 또한 단위면적 당의 소득을 증가하기 위하여 작물 재배시에 농약을 사용하지 않는 무농약 재배 및 유기농 재배 등의 농법이 점차 증가하고 있다. 따라서 미생물 및 천연물을 이용한 생물농약에 대한 요구는 점차 증가하고 있어 이를 위한 새로운 방제 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 새로운 농용미생물제제로 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 밀녹병에 대하여 병원성을 나타내는 가지는 방선균 속 (Streptomyces sp.) 에 속하는 미생물을 제공한다.
본 발명의 균주는 방선균 속(Streptomyces sp.) KACC91010인 것이 바람직하며, 2003년 1월 10일 대한민국 농업생명공학원구원(경기도 수원시 권선구 서둔동 225 (우)441-707)에 방선균 속(Streptomyces sp.) B-67이라는 균주명과 기탁번호 KACC91010로 기탁하였다.
또한 본 발명은 밀녹병에 대하여 병원성을 가지는 방선균 속 (Streptomyces sp.) 에 속하는 균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물농약제제를 제공한다.
본 발명의 미생물농약제제에서 사용된 균주는 방선균 속(Streptomyces sp.) KACC91010인 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 간단히 설명한다.
본 발명은 첫째, 신규한 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균을 제공하고, 둘째, 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 16S rRNA의 유전자 염기배열 구조가 하기와 같은 특이한 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균을 제공하며, - 염기서열의 상동성 : 방선균 스트렙토마이세스 리디쿠스 (Streptomyces lydicus)와 99%의 상동성을 가진다. 셋째, 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 배양액 제조 방법을 제공하며, 넷째, 밀녹병의 방제를 위해서 상기 배양액의 처리를 특징으로 하는 농용미생물제제를 제공한다.
이하 본 발명을 비한정적인 실시 예를 통하여 상세하게 설명한다.
[실시예 1]
[신규한 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 배양을 위한 선택 배지 선정]
선발된 균주 KACC91010는 현탁배양을 위하여 방선균배양에 이용되는 Bennet 배지를 이용하였다. 배지의 조성은 Agar 15 g/L, Beef extract 1 g/L, Yeast extract 1 g/L, Tryptone 2 g/L, glycerol 10 g/L로 조성되며, 배양온도는 28℃, pH 7.2에서 진탕시키며 10일간 배양한다.
[실시예 2]
[신규한 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 형태적 관찰]
순수 분리한 신규한 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균주를 Bennet 배지에서 배양하여 주사현미경 (Scanning Electron Microscope)으로 형태를 관찰하였다 (도 1).
[실시예 3]
[신규한 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 16S rRNA 유전자염기서열 분석]
신규균 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 유전적 분석을 실시하고, 이를 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열분석을 다음과 같이수행하였다. DNA 추출을 위하여 Bennet 배지에 7일간 현탁배양한 후 배양액을 원심분리 하여 cell을 분리하였다. DNA 추출은 Genomic DNA Extraction Kit (Intron)를 이용하여 추출하였다. PCR은 반응용액(10 mM Tris, pH 8.3; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 1 unit Taq DNA polymerase)에 0.2ug genomic DNA , 0.25 uM 16S rRNA 유전자 primer 4 쌍이 표 1과 같이 조합하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편의 크기가 A조합은 900 base-pair (bp), B조합은 480 bp, C조합은 1200 bp, D조합은 800 bp가 되도록 하였다. PCR 반응 (초기 94℃ 5분 1회; 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분, 35cycle; 72℃ 5분 1회)한 후 증폭된 16S rRNA 유전자 일부분을 pGEM-T Easy vector (promega)에 ligation한 후, 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균은 선발배지(1.5% agar, 50mg/L ampicillin, 100uM IPTG, 50mg/L X-gal)에 도발하여 37℃에서 12 시간 배양하였다. 증폭된 16S rRNA 유전자조각의 vector로의 삽입은 blue/white colony로 1차 선발하고, 이중 white colony만을 LB배지에 접종하여 배양하였다. 배양액은 plasmid분리를 위하여 원심분리한 후 Alkaline lysis방법을 이용하였다. 분리된 plasmid는 제한효소 EcoR1으로 절단 후 전기영동을 통하여 증폭된 16S rRNA 유전자조각의 삽입을 확인하였다 (도 2). 증폭된 16S rRNA 유전자 염기서열의 확인을 위하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST를 이용하여 homology를 확인하였고 그 결과 방선균 스트렙토마이세스 리디쿠스 (Streptomyces lydicus)와 99%의 상동성을 보였다.
(표 1) 16S rRNA 유전자의 PCR 및 염기서열분석에 사용된 primer
Primer pair 염 기 서 열
A 5'-CAAGCGTTGTCCGGAATTAT(서열정보1)
5'-TTCGGGTGTTACCGACTTTC(서열정보2)
B 5'-CAAGCGTTGTCCGGAATTAT(서열정보3)
5'-ATCTCTGGATGTTTCCGGT(서열정보4)
C 5'-GATACGACTCAGGACCGCAT(서열정보5)
5'-TTCGGGTGTTACCGACTTTC(서열정보6)
D 5'-GATACGACTCAGGACCGCAT(서열정보7)
5'-ATCTCTGGATGTTTCCGGT(서열정보8)
[실시예 4]
[방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균 배양액의 밀녹병 방제 효과]
시험 대상 밀 품종은 Triticum aestivum L, cv Chokwang을 사용하였고, 밀녹병균은 Puccinia recondita Rob ex Desm이다. 밀 종자를 원예용상토(부농사)에 파종하고 25℃의 온실에서 10일 동안 재배하여 준비한 약 2엽기의 밀을 사용하여 방제효과를 조사하였다. 밀 녹병은 활물기생균이므로 밀 유묘에 병원균을 감염시키고 그곳에 형성된 포자를 수확하여 접종원으로 사용하였다. 미생물 배양액의 방제효과를 조사하기 위하여 미생물 배양액에 250 mg/L 농도가 되도록 Tween 20을 첨가하고 밀 폿트에 경엽처리 한 후에 24시간 동안 풍건하였다. 미생물 배양액을 처리한 밀 잎에 위에서 수확한 밀녹병 포자현탁액(0.67 g 포자/L)을 spray하여 접종하였다. 접종한 밀은 20℃ 습실상에 넣고 1일 동안 습실처리한 후에 20℃, 상대습도 70%의 항온항습실에서 6일 동안 발병을 유도하며 재배하였다. 실시예 1에 기술한 방법으로 배양한 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 배양액(미생물 세포내 물질이 포함된)을 처리한 결과와 무처리구 (도 3)를 비교하였다. 일반적으로 Puccinia recondita에 의해 밀녹병이 발생하면 잎이 죽게 된다. 도 3을 살펴보면 KACC91010균의 배양액 무처리구(왼쪽)와 처리구(오른쪽) 모두 Puccinia recondita를 접종하여 발병시켰으나, 무처리구는 잎이 모두 죽은 것으로 관찰되고 처리구는 방제효과로 인해 푸르게 살아남은 결과를 보인다.
병의 발생을 억제한 방제가는 다음의 하기 수학식 1에 따라 계산한다.
결과로서, 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 배양액을 처리한 경우 밀녹병 방제효과가 80% 로 나타났다.
본 발명의 미생물제제는 본 발명의 균주의 배양액 또는 배양물을 포함하는 다양한 제제의 형태 즉 액제, 수화제, 분제, 입제, 유제 등으로 제조할 수 있다. 그 제조방법은 당업계의 일반적인 제조방법에 따른다.
본 발명은 신규한 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 배양액을 농용미생물제제로서 밀녹병 방제에 사용할 수 있음을 보여주고 있으며 이는 기존의 화학농약에서 나타날 수 있는 과다사용으로 인한 생태계의 파괴를 막을 수 있다는 효과를 보인다.
도 1은 신규한 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균주를 Bennet 배지에서 배양하여 주사현미경 (Scanning Electron Microscope)으로 관찰한 결과이다.
도 2는 신규한 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 16S rRNA 유전자분석 결과이다.
도 3은 밀녹병이 발병된 밀에 방선균속 (Streptomyces sp.) KACC91010균의 배양액을 처리하지 않은 결과 (왼쪽)와 처리한 결과 (오른쪽)이다.
<110> KONKUK UNIVERSITY Seoul National University Industry Foundation <120> {A novel Streptomyces sp. and agricultural microbiological agents comprising the strain broth <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing base sequence <400> 1 caagcgttgt ccggaattat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing base sequence <400> 2 ttcgggtgtt accgactttc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing base sequence <400> 3 caagcgttgt ccggaattat 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing base sequence <400> 4 atctctggat gtttccggt 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing base sequence <400> 5 gatacgactc aggaccgcat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing base sequence <400> 6 ttcgggtgtt accgactttc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing base sequence <400> 7 gatacgactc aggaccgcat 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing base sequence <400> 8 atctctggat gtttccggt 19

Claims (4)

  1. 밀녹병에 대하여 병원성을 나타내는 가지는 방선균 속 (Streptomyces sp.) 에 속하는 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기의 균주는 방선균 속(Streptomyces sp.) KACC91010인 것을 특징으로 하는 균주
  3. 밀녹병에 대하여 방제효과를 가지는 방선균 속 (Streptomyces sp.) 에 속하는 균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물농약제제.
  4. 제3항에 있어서, 상기의 균주는 방선균 속(Streptomyces sp.) KACC91010인 것을 특징으로 하는 미생물농약제제.
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