KR20180056474A

KR20180056474A - 바실러스 오리지콜라 yc7011이 생산하는 식물 병해충 방제 효과를 나타내는 기주 저항성 유도 신규 물질

Info

Publication number: KR20180056474A
Application number: KR1020160154297A
Authority: KR
Inventors: 정영륜; 하룬오라시드 엠디; 김근곤; 이정은
Original assignee: (주) 제일그린산업
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2018-05-29
Also published as: WO2018093199A3; WO2018093199A9; WO2018093199A2; KR101922410B1

Abstract

식물 내생세균 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011 배양액과 그로부터 분리한 물질을 식물의 근권 및 종자에 처리하면 식물의 저항성이 유도되어 식물병과 해충에 대한 방제 효과를 나타내며 식물의 생육 촉진 효과를 보인다. 또한 식물 및 인체 병원 진균에 대한 생장 억제 효과를 가지고 있다. 따라서 본 발명은 바실러스 오리지콜라 YC7011의 대사 산물로서 저항성 유도로 인한 식물 병해충 방제와 생육 촉진 효과 및 항진균 효과를 가진 6가지 저항성 유도 신규 고리형 리포펩타이드와 3가지 기지 물질(Bacillopeptin A, B, C)을 제공한다. 바실러스 오리지콜라 YC7011을 대량 배양하여 배양액의 분리 정제를 통하여 친환경적인 다기능 천연식물보호제뿐만 아니라 다양한 산업 분야에 이용할 수 있는 신규 물질을 제공한다.

Description

바실러스 오리지콜라 YC7011이 생산하는 식물 병해충 방제 효과를 나타내는 기주 저항성 유도 신규 물질{Novel compounds produced by Bacillus oryzicola YC7011 with activities of induced resistance against plant pathogens and insect and plant growth promotion}

본 발명은 바실러스 오리지콜라 (Bacillus oryzicola) YC7011이 생산하는 식물 병해충 방제 및 항균, 식물 생육 촉진 효과를 가진 기주 저항성 유도 신규 물질에 관한 것이다.

본 발명은 2014년 산업통상부에서 지원하는 '산업융합원천기술개발사업'(과제고유번호: 10044909, 과제명: 효과지속형 광범위 프로바이오틱 작물 보호제 개발)의 일환으로 수행된 연구로부터 도출된 것이다.

전 세계적으로 화학농약의 오남용으로 인한 환경오염과 생태계 파괴, 인축독성, 병해충 및 잡초의 저항성 유발 등의 문제가 대두되면서 안전한 먹거리 생산과 환경 오염을 최소화하는 친환경적이고 지속적인 농업 생산체계를 갖추기 위하여 많은 노력을 하고 있다. 국내에서는 2001년부터 4차에 걸쳐서 친환경농업 육성 정책 5개년 계획을 수립하여 기존의 화학농약 및 화학비료의 사용량을 절반 이하로 감축시키고 친환경 인증 생산농가를 늘리고 친환경 농산물 시장의 규모를 확대하는 정책을 추진해 오고 있다. 친환경 농업의 규모가 점차 증가하고 화학농약이나 합성비료를 사용하지 않는 농식품에 대한 소비자의 수요가 증가하면서 친환경 농산물 시장이 꾸준한 상승세를 보이고 있다. 이에 따라 유기합성 농약 및 화학비료의 사용이 줄어들면서 이들의 역할을 대체할 수 있는 친환경적이고 인축 안전성이 뛰어난 병해충 방제용 천연식물보호제의 사용이 증가하고 있다.

천연식물보호제는 크게 천연물 유래 추출물과 농업미생물을 주원료로 한 제품으로 나뉘어지는데, 국내의 경우 전자는 주로 살충제, 후자는 살균제 용도로 개발된 것이 대부분이다. 농업에 유용한 미생물들은 주로 토양이나 식물 근권 및 식물 조직 내에 공생하는 등 자연환경에 널리 분포되어 있으며, 그 종류가 다양하고 여러 가지 대사산물을 분비하기 때문에 천연식물보호제로 개발되어 친환경농업에 효과적으로 이용되고 있다. 미생물을 이용한 천연식물보호제는 사용 주성분에 따라 크게 3가지 방법으로 이용 할 수 있는데, 미생물 자체를 이용하는 방법, 미생물 발효에 의해 생산되는 대사 항생 물질을 이용하는 방법, 새로운 농약 합성을 위한 선도 화합물로 미생물 대사 물질을 이용하는 방법 등이 있다. 이 중에서도 미생물 자체를 이용하는 방법이 널리 사용되고 있는데, 식물 병원균을 직접 억제할 수 있는 길항 미생물과 식물 생육을 촉진시키는 근권 세균(PGPR, Plant Growth Promoting Rhizobacteria)이 국내외적으로 가장 많이 제품으로 개발되어 이용되고 있다. 사용 미생물로는 곰팡이인 Trichoderma harzianum, 세균인 Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus pasteurii, Bacillus methylotrophicus, Pseudomonas fluorescens, Paenibacillus spp., Streptomyces spp. Lysobacter spp. 등이 주성분으로 잘 알려져 있다. 이들 미생물들은 식물에 직간접적으로 영양공급, 뿌리생장을 촉진하는 다양한 호르몬 분비 및 항균 물질 분비 등 길항작용을 통하여 식물의 생장을 촉진시키거나 병원균에 감염되기 전에 식물의 방어 기작을 유도하여 식물병을 억제한다고 알려져 있다(비특허논문 1-4)

다양한 유용 미생물들은 많은 작물에 문제를 일으키는 병해충 방제를 위한 천연식물보호제로 사용되고 있지만 벼의 병해충 방제에 대한 연구 결과는 매우 드물다(비특허문헌 2). 벼의 중요한 병방제에 대한 몇 가지 연구를 보면 벼잎집무늬마름병 방제를 위하여 Streptomyces sp.와 Bacillus sp.의 길항작용을 이용하거나 Bacillus vallismortis EXTN-1과 두 길항미생물 Pseudomonas fluorescens mc75와 pc78을 이용한 벼도열병과 벼잎집무늬마름병을 효과적으로 방제한 연구 보고가 있다. 벼키다리병과 벼알마름병을 일으키는 Fusarium moniliforme과 Fusarium fujikuroi를 억제하기 위하여 P. fluorescens와 Bacillus cereus를 이용한 연구 결과가 있다(비특허논문 4-8).

최근에는 벼 근권에서 분리된 새로운 세균 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7007을 벼 종자 또는 뿌리에 처리하면 벼의 세균성 알마름병, 흰잎마름병 및 키다리병에 대한 기주 저항성이 유도 된다고 보고 하였으며, 또한 벼멸구에 대한 벼 저항성도 유도됨을 세계 처음으로 확인 발표하였다(비특허문헌 9-12).

현재까지 미생물을 이용한 천연식물보호제 개발 또는 방제 연구는 거의 대부분이 식물 병원균을 직접 억제하거나 생육 촉진 효과 연구를 바탕으로 이루어져 왔다. 그러나, 이런 미생물을 종자나 근권에 처리하였을 때 작물 해충 방제 효과나 억제 기작에 대한 연구는 세계적으로 거의 없다(비특허문헌 11-12).

천연식물보호제에 많이 사용되는 바실러스(Bacillus sp.) 균주는 항진균, 항세균, 기주 식물의 생육촉진 및 저항성 유도가 가장 특징적이며 내생 포자(endospore)를 형성하여 열에 안정하고 열악한 환경에서도 오랜 기간 생존할 수 있고 제제화가 용이하여 상업적으로 가장 효율적으로 사용되는 미생물이다. 어떤 균주는 식물에 직간접적으로 영양공급, 뿌리생장을 촉진하는 다양한 호르몬 분비 및 여러 길항작용을 통하여 식물의 생장을 촉진시키고 병원균에 감염되기 전에 식물의 방어 기작을 유도한다고 알려져 있다(비특허문헌 2-3, 12). 여러 바실러스 중 Bacillus thuringiensis는 독소를 생산하여 해충을 직접 죽이는 효능을 보여 오래 전부터 잘 알려져 이미 제품으로 많이 개발되어 있다. 그와 달리 식물병 방제 및 식물 생육 촉진 효과를 나타내는 몇 종의 바실러스 균주는 다양한 대사 물질을 생산하는 것으로 보고되어 있다.

다양한 바실러스 균주에서 분리된 항균물질은 이튜린(Iturins), 서펙틴(Surfactins), 펜기신(Fengycins) 등의 고리형 리포펩타이드(cyclic lipopeptides)가 가장 잘 알려져 있으며, 이들은 7가지 아미노산의 고리 형태 구조와 그 고리 형태의 아미노산에 연결되는 지방산 서열과 길이 및 특성 등에 따라 다양한 리포펩타이드 구조가 발표되었다(비특허문헌 14-17). 이튜린 계열의 고리형 리포펩타이드 항균 물질은 B. subtilis 균주들에서 생산되는데, Iturins A-E, Bacillomycines D, F, L, Lc, Mycosubtilin, Bacillopeptins A, B, C 등으로 다양하다. 이튜린 계열의 첫 3개 아미노산(_L-Asx(x=p, n), _D-Tyr, _D-Asn)은 잘 보존되어 있으며, 항균작용에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. Iturin C는 Iturin A의 _L-Asn-1이 _L-Asp-1으로 치환된 구조인데 Iturin A에 있던 항생작용이 Iturin C에는 없다. 또한 Iturin A의 _D-Tyr-2의 페닐기에 메틸화를 시키면 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. Bacillopeptins는 Bacillomycin L과 구조적으로 유사하지만, Bacillomycin L의 _L-Asp와 _L-Gln 대신에 _L-Asn과 _L-Glu으로 연결되어 있다. 또한 Bacillopeptin C는 Bacillopeptin A나 B와 약간의 구조적 차이가 있을 뿐이지만 곰팡이와 효모에 대한 억제 효과는 Bacillopeptin C에서만 볼 수 있다. Mycosubtilin은 Iturin A와 2개의 아미노산(_D-Ser 6. _L-Asn 7)이 바뀐 구조지만 항균 작용은 Iturin A보다 좀 더 강한 활성을 보였다(비특허문헌 14, 17, 19). 최근에는 식물병에 대한 항균 작용을 나타내는 미생물 균주로부터 리포펩타이드를 분리하여 구조를 밝혀 물질을 규명하거나 구조 유전자를 찾아내 유전자 조작을 통하여 이 물질들이 식물에서 어떠한 작용을 하는지 밝히는 연구도 진행되고 있다 (비특허문헌 15, 18-22).

이와 같이 바실러스가 생산하는 다양한 리포펩타이드는 길항작용, 항세균 및 항진균 작용 및 미생물의 근권 정착을 돕는 계면(biosurfactants) 활성 효과와 더불어 기주식물의 저항성 유도 효과가 밝혀진 환경 친화적이고 인체에 무해한 물질로 알려져 있다. 특히 이런 효과에 대한 연구가 활발해 지면서 이 물질들은 천연식물보호제뿐만 아니라 생물공학, 식품 및 의약품 분야 등 다양한 산업 분야에 적용 가능한 것으로 알려지고 있다 (비특허문헌 15). 그러나, 이러한 물질이 해충에 대한 기주 식물의 저항성을 유도한다는 내용은 전혀 보고된 바 없다.

최근 본 발명자가 ㈜제일그린산업 내 폿트실험 중 벼 근권에서 분리한 바실러스 오리지콜라 YC7011은 내생 세균으로 벼의 중요한 병원 세균 및 진균의 생육을 억제할 뿐만 아니라 벼의 병 저항성 유도와 식물생육촉진 효과도 나타내었다. 본 특허에서는 이러한 다기능 미생물 YC7011 균주가 근권 또는 종자 처리에 의하여 해충에 대한 저항성 유도 효과가 있음을 세계 최초로 확인하였기에 효과를 나타내는 활성 물질들을 분리, 정제하여 그 구조를 밝혔다. 또한 이 신규 물질들의 기능을 밝혀 천연식물보호제 및 다양한 분야의 생물 산업에 적용 될 수 있도록 사용방법 개발에 활용할 수 있다.

비특허문헌 1: Ryu, C.M. (2013). Promoting plant protection by root-associated microbes. Plant Pathol J 29:123-124. 비특허문헌 2: McSpadden Gardener B. (2010). Biocontrol of plant pathogens and plant growth promotion by Bacillus. In: Recent Developments in Management of Plant Disease, Plant Pathology in the 21st Century. Eds. By U.Gisi, I. Chet and M.L. Gullino, Chapt. 6, pp. 71-79. Springer-Amsterdam. 비특허문헌 3: Lee, S.K., Sohn, H.B., Kim, G.G., and Chung, Y.R. (2006). Enhancement of biological control of Botrytis cinerea on cucumber by foliar sprays and bed potting mixes of Trichoderma harzianum YC459 and its application on tomato in the greenhouse. Plant Pathol J 22(3):283-288. 비특허문헌 4: Sung, K.C. and Chung, Y.R. (1997). Enhanced suppression of rice sheath blight using combination of bacteria which produce chitinases or antibiotics. In: Proceedings of the 4th International Workshop on Plant Growth Promoting Rhizobacteria Present Status and Future Prospects, eds. By A. Ogoshi, K. Kobayashi, Y. Homma, F. Kodama, N. Konodo and S. Akino. pp.370-373. OECD, Paris. 비특허문헌 5: Choi, G.J., Kim, J.C., Park, E.J., Choi, Y.H., Jang, K.S., Lim, H.K., Cho, K.Y. and Lee, S.W. (2006) Biological control activity of two isolates of Pseudomonas fluorescens against rice sheath blight. Plant Pathol J 22:289-294. 비특허문헌 6: Park, K.S., Paul, D. and Yeh, W.H. (2006). Bacillus vallismortis EXTN-1 mediated growth promotion and disease suppression in rice. Plant Pathol J 22:278-282. 비특허문헌 7: Kazempour, M.N. and Elahinia, S.A. (2007). Biological control of Fusarium fujikuroi, the causal agent of bakanae disease by rice associated antagonistic bacteria. Bulg J Agric Sci 13:393-408. 비특허문헌 8: Rosales, A.M. and Mew, T.W. (1997). Suppression of Fusarium moniliforme in rice by rice-associated antagonistic bacteria. Plant Dis. 81:49-52. 비특허문헌 9: Chung, E.J., Hossain, M.T., Khan, A., Kim, K.H., Jeon, C.O., and Chung, Y.R. (2015). Bacillus oryzicola sp. nov., and endophytic bacterium isolated from the roots of rice with antimicrobial, plant growth promoting, and systemic resistance inducing activities in rice. Plant Pathol J 31(2):152-164. 비특허문헌 10: Hossain, M.T., Khan, A., Rashid, M. and Chung, E.J., Chung, Y.R. (2015). Development of a novel endophytic Bacillus species as a microbial inoculant to control seed-borne rice diseases and brown plant hopper. In: 10th International Plant Growth Promoting Rhizobacteria Workshop. Program and Abstract book. p.47. 비특허문헌 11: Zebelo, S., Song, Y., Kloepper, J.W. and Fadamiro, H. (2016). Rhizobacteria activates (+)-?-cadinene synthase genes and induces systemic resistance in cotton against beet armyworm (Spodoptera exigua). Plant Cell and Environment 39:935?943. 비특허문헌 12: Hossain, M.T., Khan, A., Chung, E.J., Rashid, M.H., and Chung, Y.R. (2016). Biological control of rice bakanae by an endophytic Bacillus oryzicola YC7007. Plant Pathol J 32(3):228-241. 비특허문헌 13: Kwon, Y.S., Lee, D.Y., Rakwal, R., Baek, S.B., Lee, J.H., Kwak, Y.S., Seo, J.S., Chung, W.S., Bae, D.W., and Kim, S.G. (2016). Proteomic analyses of the interaction between the plant-growth promoting rhizobacterium Paenibacillus polymyxa E681 and Arabidopsis thaliana. Proteomics 16:122-135. 비특허문헌 14: Govindasamy V., Senthilkumar M., Magheshwaran V., Kumar U., Bose P., Sharma V., and Annapurna K. (2010). Bacillus and Paenibacillus spp.: Potential PGPR for Sustainable Agriculture. Plant Growth and Health Promoting Bacteria. Microbiology Monographs V18:333-364. 비특허문헌 15: Ongena M., and Jacques P. (2008). Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol. Trends Microbiol 16(3):115-125. 비특허문헌 16: Luo C., Liu X., Zhou X., Guo J., Truong J., Wang X., Zhou H., Li X., and Chen Z. (2015). Unusual biosynthesis and structure of Locillomycins from Bacillus subtilis 916. Appl Environ Microbiol 81(19):6601-9. 비특허문헌 17: Kajimura Y., Sugiyama M., and Kaneda M. (1995). Bacillopeptins, New cyclic lipopeptide antibiotics from Bacillus subtilis FR-2. J Antibiot (Tokyo) 48(10):1095-103. 비특허문헌 18: Chen X.H., Koumoutsi A., Scholz R., Eisenreich A., Schneider K., Heinemeyer I., Morgenstern B., Voss B., Hess W.R., Reva O., Junge H., Voigt B., Jungblut P.R., Vater J., Sussmuth R., Liesegang H., Strittmatter A., Gottschalk G., and Borriss R. (2007). Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacteriaum Bacillus amyloloquefaciens FZB42. Nat Biotechnol. 25(9):1007-14. 비특허문헌 19: Thasana N., Prapagdee B., Rangkadilok N., Sallabhan R., Aye S.L., Ruchirawat S., and Loprasert S. (2010). Bacillus subtilis SSE4 produces subtulene A, a new lipopeptide antibiotic possessing an unusual C15 unsaturated b-amino acid. FEBS Lett 584(14):3209-14. 비특허문헌 20: Ma Z., Hu J., Wang X., and Wang S. (2013). NMR spectroscopic and MS/MS spectrometric characterization of a new lipopeptide antibiotic bacillopeptin B1 produced by a marine sediment-derived Bacillus amyloliquefaciens SH-B74. J Antibiot (Tokyo) 67(2):175-178. 비특허문헌 21: Yamamota S., Shiraishi S., and Suzuki S. (2015). Are cyclic lipopeptides produced by Bacillus amyloliquefaciens S13-3 responsible for the plant defence response in strawberry against Colletotrichum gloeosporidides Lett Appl Microbiol 60(4):379-86. 비특허문헌 22: Mukherjee, A.K., and Das, K. (2005). Correlation between diverse cyclic lipopeptides production and regulation of growth and substrate utilization by Bacillus subtilis strains in a particular habitat. FEMS Microbiol Ecol 54(3):479-89.

이에 본 발명은 식물 내생세균 바실러스 오리지콜라 YC7011을 기주 식물의 근권 또는 종자에 처리함으로써 저항성 유도 효과 및 식물생장 촉진 효과가 있음을 확인하였고, 이 균주가 생산하는 물질들을 분리 정제하여 항균 작용과 주요 식물병 및 해충에 대한 저항성을 유도하며 식물의 생장을 촉진시킬 수 있는 신규 물질의 구조를 제공하는 것을 그 목적으로 하고 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 신규 미생물 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011 또는 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011과 유전자 분석(BOX-PCR)결과 동일한 패턴을 가지는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.

또한 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)를 제공한다.

또한 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011 배양액을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.

또한 상기 미생물 제제는 하기의 화학식 1로 표현되는 바실로펩틴 계열의 고리형 구조에 C8~C20의 베타 아미노산 사슬이 결합된 구조를 가지는 유효성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제를 제공한다.

(화학식 1)

또한 상기 유효성분은 하기의 화학식 2~10중 어느 하나의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 미생물 제제를 제공한다.

(화학식 2)

(화학식 3)

(화학식 4)

(화학식5)

(화학식6)

(화학식7)

(화학식8)

(화학식9)

(화학식10)

또한 상기 미생물 제제는 진딧물 방제, 벼멸구 방제, 병원 진균의 생육 억제, 식물 근권의 기주 저항성 유도 또는 식물 생육촉진효과를 가지는 것을 특징으로 하는 미생물 제제를 제공한다.

또한 상기 병원 진균은 벼 키다리병을 일으키는 Fusarium fujikuroi 또는 인체 염증을 일으키는 Candida albicans인 것을 특징으로 하는 미생물 제제를 제공한다.

이러한 본 발명에 따르면, 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011 및 이 균주의 배양액으로부터 분리한 물질들은 기주 식물의 저항성을 유도하여 식물 병해충을 방제하고 생육촉진 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 이러한 다기능 미생물 및 물질을 이용하여 식물 생육 촉진, 식물병원균 억제 및 기주의 병해충 저항성 유도 능력을 동시에 지님에 따라, 다기능 천연식물보호제, 식물 강화제 및 미생물 비료로서의 역할을 동시에 수행할 수 있는 우수한 미생물 제제를 제공할 수 있다.

도 1은 바실러스 오리지콜라 YC7011 균주의 16S rRNA 염기서열,
도 2는 바실러스 오리지콜라 YC7011 균주의 16S rRNA 유전자 서열분석으로 만든 계통수,
도 3은 바실러스 오리지콜라 YC7011 균주와 유사균주와의 유전자 분석(BOX-PCR) 결과,
도 4는 바실러스 오리지콜라 YC7011 균주의 배양액으로부터 물질 분리 및 정제 과정 모식도,
도 5는 1차 분리된 물질 중 분획 F로부터 F2D2의 분리 정제 과정 모식도,
도 6은 1차 분리된 물질 중 분획 G로부터 G4B와 G4C의 분리 정제 과정 모식도,
도 7은 1차 분리 물질 H로부터 Bacillopeptin A(H4E)의 분리 정제 과정 모식도,
도 8은 1차 분리된 물질 중 분획 I로부터 I4B, Bacillopeptin C(I4D), Bacillopeptin B(I4C), I4E와 I4F의 분리 정제 방법,
도 9는 F2D2의 구조식,
도 10은 F2D2의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 CD3OD에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 11은 F2D2의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 12는 F2D2의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 13은 F2D2의 질량 분석을 위해 HR-ESI-TOF-MS를 이용하여 얻어진 그래프,
도 14는 G4B의 구조식,
도 15는 G4B의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 CD3OD에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 16은 G4B의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 17은 G4B의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 18은 G4B의 분광학적 구조 규명을 위해 COSY-NMR 분석 그래프,
도 19는 G4B의 분광학적 구조 규명을 위해 HSQC-NMR 분석 그래프,
도 20은 G4B의 분광학적 구조 규명을 위해 HMBC-NMR 분석 그래프,
도 21은 G4B의 분광학적 구조 규명을 위해 TOCSY-NMR 분석 그래프,
도 22는 G4B의 분광학적 구조 규명을 위해 ROESY-NMR 분석 그래프,
도 23은 G4B의 질량 분석을 위해 HR-ESI-TOF-MS를 이용하여 얻어진 그래프,
도 24는 Bacillopeptin A(H4E)의 구조식,
도 25는 Bacillopeptin A(H4E)의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 CD3OD에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 26은 Bacillopeptin A(H4E)의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 27은 Bacillopeptin A(H4E)의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 28은 Bacillopeptin A(H4E)의 질량 분석을 위해 HR-ESI-TOF-MS를 이용하여 얻어진 그래프,
도 29는 I4E 의 구조식,
도 30은 I4E의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 CD3OD에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 31은 I4E의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 32는 I4E의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 33은 I4E의 질량 분석을 위해 HR-ESI-TOF-MS를 이용하여 얻어진 그래프,
도 34는 Bacillopeptin B(I4C)의 구조식,
도 35는 Bacillopeptin B(I4C)의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 CD3OD에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 36은 Bacillopeptin B(I4C)의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 CD3OD에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 37은 Bacillopeptin B(I4C)의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 38은 Bacillopeptin B(I4C)의 분광학적 구조 규명을 위해 COSY-NMR 분석 그래프,
도 39는 Bacillopeptin B(I4C)의 분광학적 구조 규명을 위해 HSQC-NMR 분석 그래프,
도 40은 Bacillopeptin B(I4C)의 분광학적 구조 규명을 위해 ROSEY-NMR 분석 그래프,
도 41은 Bacillopeptin B(I4C)의 분광학적 구조 규명을 위해 TOCSY-NMR 분석 그래프,
도 42는 Bacillopeptin B(I4C)의 질량 분석을 위해 HR-ESI-TOF-MS를 이용하여 얻어진 그래프,
도 43은 Bacillopeptin C(I4D)의 구조식,
도 44는 Bacillopeptin C(I4D)의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 CD3OD에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 45는 Bacillopeptin C(I4D)의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 46은 Bacillopeptin C(I4D)의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 47은 Bacillopeptin C(I4D)의 질량 분석을 위해 HR-ESI-TOF-MS를 이용하여 얻어진 그래프,
도 48은 G4C 의 구조식,
도 49는 G4C의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 50은 G4C의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 51은 G4C의 질량 분석을 위해 HR-ESI-TOF-MS를 이용하여 얻어진 그래프,
도 52는 I4B 의 구조식,
도 53은 I4B의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 CD3OD에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 54는 I4B의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 55는 I4B의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 56은 I4B의 분광학적 구조 규명을 위해 COSY-NMR 분석 그래프,
도 57은 I4B의 분광학적 구조 규명을 위해 HSQC-NMR 분석 그래프,
도 58은 I4B의 분광학적 구조 규명을 위해 HMBC-NMR 분석 그래프,
도 59는 I4B의 질량 분석을 위해 HR-ESI-TOF-MS를 이용하여 얻어진 그래프,
도 60은 I4F 의 구조식,
도 61은 I4F의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 CD3OD에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 62는 I4F의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 1H-NMR 분석 그래프,
도 63은 I4F의 분광학적 구조 규명을 위해 용매 DMSO-d6에서의 13C-NMR 분석 그래프,
도 64는 I4F의 질량 분석을 위해 HR-ESI-TOF-MS를 이용하여 얻어진 그래프,
도 65는 물질 Bacillopeptin A, B와 신규물질 I4E의 저항성 유도에 의한 벼 알마름병 방제 효과에 대한 사진,
도 66은 YC7011 배양액의 진딧물에 대한 방제 효과 결과 그래프,
도 67은 YC7011 배양액의 벼멸구에 대한 방제 효과 결과 그래프.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명자들은 식물 병원 진균 및 세균의 생육을 광범위하게 억제할 수 있고 동시에 기주 식물인 벼에 특이적으로 작용하여 병 저항성 유도 및 식물생육 촉진 효과를 모두 갖는 다기능 식물 내생세균을 분리, 대량 배양하여 제제화 함으로써 미생물 비료 효능도 가진 새로운 형태의 생물 농약으로 이용될 수 있는 신 균주를 발견하였다.

즉 ㈜제일그린산업 내 폿트실험에서 분리된 세균을 탐색한 결과, 분리된 균주가 상기 효능을 모두 구비한 것을 확인하였고, 이에 대한 16S rRNA 유전자의 염기서열 결정 및 분석과 유전자 분석(BOX-PCR) 실험 등을 수행한 결과, 바실러스 속(Bacillus sp.)에 속하는 미생물로 동정되어 "바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011"로 명명하였다.

본 발명에서 분리된 미생물 바실러스 오리지콜라는 Dunlap 등의 제안(Dunlap C.A., Kim S. J., Kwon S. W., and Rooney A. P. (2015) Bacillus velezensis is not a later heteotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus methylotrophicus, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum and ?Bacillus oryzicola? are later heterotypic synonyms of Bacillus velezensis based on phylogenomics. Int J Syst Evol Microbiol 66:1212-1217)으로 유사 근연종간에 분류학적인 논쟁이 되고 있다. 미생물을 분류할 때 일반적인 방법인 형태학적, 생리생화학적 분류와 DNA-DNA 교잡으로는 유사 근연종을 명확하게 분류하기에는 제한적이므로 Marques 등의 논문(Marques A S A., Marchaison A., Garden L., and Samson R. (2008). BOX-PCR-based indentification of bacterial species belonging to Pseudomonas syringae -P. viridiflava group. Genetics and Molecular Biology 31(1):106-115)이나 Cherif 등의 논문(Cherif A., Brusetti L., Borin S., Rizzi A., Boudabous A., Khyami-Horani H., and Daffonchio D. (2003) Genetic relationship in the ?Bacillus cereus group? by rep-PCR fingerprinting and sequencing of Bacillus anthracis-specific rep-PCR fragment. J Micro Biol 94:1108-1119)과 같이 유전자 분석(BOX-PCR) 방법을 통하여 유사 근연종들의 분류를 명확히 할 수 있다. 따라서 유전자 분석(BOX-PCR) 결과 동일한 패턴의 미생물은 본 발명의 바실러스 오리지콜라와 동일한 미생물로 취급될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola)는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA를 포함할 수 있다.

또한 본 발명자들은 신규한 바실러스 오리지콜라 YC7011의 배양액으로부터 저항성 유도로 인한 식물 병해충에 대한 방제 효과와 생육촉진 효과를 지닌 물질들을 분리하여 구조를 밝혔으며, 이들 중 기존에 알려진 물질뿐만 아니라 신규 물질을 확인하였다.

본 발명에서 바실러스 오리지콜라 YC7011의 배양액으로부터 얻어진 물질들은 Kajimura 등의 논문 (비특허문헌 17: Kajimura Y., et al, 1995 Bacillopeptins, New cyclic lipopetide Antibiotics from Bacillus subtilis FR-2)에서 발표된 Bacillopeptin A, B, C를 포함하는 Bacillopeptin 계열의 고리형 리포펩타이드이며 분리한 Bacillopeptins 중 신규 물질은 기주 식물로부터 저항성을 유도하여 벼 알마름병 및 벼멸구에 대한 방제 효과를 나타내며 동시에 생육 촉진 효과도 확인하였다. 또한 벼키다리병을 일으키는 식물 병원균 Fusarium fujikuroi 뿐만 아니라 인체에 염증을 유발하는 병원균인 Candida albicans에 대한 생육 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

YC7011 균주의 분리 및 동정

(1)YC7011 균주의 분리

YC7011 균주는 ㈜제일그린산업 기술개발실에서 폿트 실험 중 벼 근권의 뿌리 내부조직에서 분리되었다. 먼저, 식물 내생세균을 분리하기 위하여 뿌리 절단 조각의 표면을 1% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 10분간 담구어 표면을 살균하였다. 이 조각들을 1/10 TSA 배지(Tryptic Soy Broth 3g, 한천 16g/ 증류수 1L)에 올려 놓고, 2-3일 정도 배양하는 동안 세균 생장 여부를 관찰하면서 표면 살균 여부를 확인하였다. 조각의 표면 살균이 확인된 뿌리 조각 1.0g을 취하여 멸균 증류수 9.0㎖을 넣어 10배씩 희석(10^-3)하고 순차적으로 10배씩 추가 희석(10^-4 및 10^-5)하였고, 희석액을 1/10 TSA 배지에 분주한 후 고르게 도말하였다. 도말된 배지를 28℃에서 2-3일 동안 배양 후 단일 집락을 순수하게 분리하였고, 이를 YC7011 균주로 명명하였다.

(2)YC7011 균주의 동정

상기 분리된 YC7011 균주는 그람 양성, 막대 모양의 호기성 세균으로 운동성은 없었다. YC7011 균주는 13℃~60℃, pH4~12.0에서 생장하고 젤라틴 분해, 카복시메칠 셀루로즈 미분해, 아부틴, 전분, 디락토스, 디글루코스, 글리코겐, 엔-마세칠-글루코사민, 젠티오비오스 분해, 나프톨-에이에스-비아이-포스포하이드로라제, 엔-아세칠-베타-글루코스아미니다제 효소 등의 표현형적 특성을 확인하였다.

한편, YC7011 균주의 16S rRNA의 염기서열(1513bp, 도 1 참조)을 결정하고, Genbank 및 EzTaxon-e database server를 이용하여 상동성 검색을 수행한 결과, Bacillus oryzicola YC7010과 100%, Bacillus methylotrophicus KACC13105^T와 99.87% 유사한 것으로 나타났다. 도 2에서는 YC7011 균주의 16S rRNA 유전자 서열 분석으로 만든 계통수를 나타내고 있다. 도 2에서 교점 숫자는 1000 반복에서 나온 부트스트랩 값(bootstrap value)을 나타낸다.

또한, YC7011 균주와 유사 근연종과 좀 더 세부적인 비교를 위하여 Versalovic 등의 논문(Versalovic J., Schneider M., Bruijn F.J. and Lupski J.R. (1994) Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods Mol Cell Biol 5:25-40)을 참고하여 유전자 분석(BOX-PCR)을 수행하였다. 각 균주들에서 추출한 DNA로부터 유전자 분석을 위해 GoTaq Green Master Mix(Promega), 프라이머(primer)는 BOXAR1(5?-CATCGGCAAGGCGACGCTGACG-3?)을 사용하였다. PCR 조건은 초기 변성(initial denaturation)은 95℃에서 7분, 35회 반복되는 과정인 변성(denaturation), 결합(annealing), 연장(extension)은 각각 90℃에서 30초, 40℃에서 1분, 72℃에서 3분, 마지막으로 Final extension은 72에서 10분간 반응시켜 증폭시켰다. 이러한 과정을 거쳐 얻은 PCR 산물은 1% LE agarose gel(Seakem)에 전기영동하여 결과를 얻었다. 도2에 나타낸 것과 같이 YC7011 균주는 YC7007 균주와 YC7010 균주와 같은 패턴을 보이고 Bacillus velezensis KCTC13102과 Bacillus methylotrophicus KACC13105^T와는 다른 패턴을 보였다.

따라서, 본 발명의 미생물은 위에서 얻은 유전적 분석 결과를 바탕으로 Bacillus oryzicola YC7011 균주로 명명하고 2016년 8월 30일자로 생물자원센터(KCTC:Korean Collection for Type Cultures)로부터 수탁번호 KCTC13085BP를 부여받았다.

실시예 1: 바실러스 오리지콜라 YC7011 균주의 배양액으로부터 물질 분리 및 정제

물질 분리 및 정제는 바실러스 오리지콜라 YC7011의 배양 단계와 배양 후 배양액으로부터 물질을 정제하는 단계로 나뉜다. 바실러스 오리지콜라 YC7011의 배양 조건은 1/10 TSB배지(Tryptic Soy Broth 3g / 카세인 분해물 1.7g, 콩 분해물 0.3g, 포도당 0.25g, 염화나트륨 0.5g, 이인산칼륨 0.25g / 증류수 1L)에서 최적온도 28℃, 최적 pH 7.0, 배양 시간 48시간동안 120rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 후 얻어진 배양액 20리터를 메탄올로 농축하여 얻어진 갈색 고체를 물에 녹여 C18 flash column으로 크로마토그라피를 행하였다. 각 분획은 물과 메탄올을 일정 비율로 섞어 전개시켰으며, 그 중 활성 분획을 모아 HPLC와 Silica MPLC를 이용하여 9가지의 물질들을 분리 정제하였다(도4-8).

분리된 활성 물질의 분자량과 분자식을 알기 위하여 정제된 시료를 메탄올에 녹여 HR-ESI-TOF-MS 질량분석법으로 측정하였다. 또한 물질의 구조를 알기 위하여 1D-NMR 또는 2D-NMR(1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC, TOCSY, ROESY)을 이용하여 분석하였다. 상기 분리된 9가지의 물질은 Bacillopeptin A, B, C가 포함된 고리형 Bacillopeptin 계열 구조임을 확인하였다(표 1). 분리된 모든 물질은 Bacillopeptin의 고리 구조 서열(_L-Asn1-_D-Tyr-_D-Asn2-_L-Ser1-_L-Glu-_D-Ser2-_L-Thr-β-AA)과 각 물질마다 다른 베타 아미노산 사슬 구조(C_{10 -} C₁₇)로 이루어져 있으며 확인된 물질의 구조와 구조 분석을 위한 NMR 결과 등은 그림으로 나타내었다(도 4 ~ 도 64). 이들 물질 중 본 발명에서 확인된 신규 물질은 각각 Bacillopeptin D, F, G, H, I, X로 명명하였다(표 1).

분리물질	분자량	분자식	구조유형	화학구조	참고도
F2D2	964.4502	C₄₂H₆₄N₁₀O₁₆	C₁₀-Normal	Bacillopeptin F^*	6
G4B	992.4815	C₄₄H₆₈N₁₀O₁₆	C₁₂-Normal	Bacillopeptin G^*	11
H4E	1020.5128	C₄₆H₇₂N₁₀O₁₆	C₁₄-Normal	Bacillopeptin A¹⁾	21
I4E	1048.5441	C₄₈H₇₆N₁₀O₁₆	C₁₆-Normal	Bacillopeptin X^*	26
I4C	1034.5284	C₄₇H₇₄N₁₀O₁₆	C₁₅-iso	Bacillopeptin B¹⁾	31
I4D	1048.5441	C₄₈H₇₆N₁₀O₁₆	C₁₆-iso	Bacillopeptin C¹⁾	40
G4C	1006.4971	C₄₅H₇₀N₁₀O₁₆	C₁₃-Anteiso	Bacillopeptin D^*	45
I4B	1034.5284	C₄₇H₇₄N₁₀O₁₆	C₁₅- Anteiso	Bacillopeptin I^*	49
I4F	1085.5495	C₄₉H₇₈N₁₀O₁₆	C₁₇-Anteiso	Bacillopeptin H^*	57

* 신규 물질

1) 비특허문헌 17

실시예 2: 바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액 분리 물질의 기주 저항성 유도에 의한 벼멸구 방제 효능 검정

바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액 분리 물질의 기주 저항성 유도에 의한 벼멸구 방제 효능을 검정하기 위하여 하기와 같이 방제 효과를 조사하였다.

벼종자(신동진)를 수돗물에 담구어 가라앉은 종자만을 선별하여 사용하였다. 가라앉은 종자를 2% 차아염소산나트륨(NaOCl)에 5분간 담구어 1차 표면 살균 후 70% 알코올에 다시 5분간 넣어 2차 표면 살균을 하고 멸균증류수로 여러 번 헹구어내었다. 표면 살균된 종자를 멸균증류수에 담구어 30℃에서 3일간 암조건에 두고 매일 물을 갈아주면서 싹을 틔웠다. 싹이 난 종자를 Murashige & Skoog 배지(MS 2.2g/L, agar 8g/L, pH 6.0) 위에 심고 12일간 식물 생육상(28-30℃, 상대습도 80% 이상)에서 재배하였다. 12일간 키운 유묘에 분리된 9종의 순수 물질 100㎍/㎖을 300㎕/주를 각각 처리하였다. 물질 처리 후 5일동안 식물 생육상에 둔 후에 멸균 상토(100g)가 들어있는 포트로 옮겨 심었고, 옮겨 심은 지 2일 후에 각 처리구에 벼멸구(2세대 성충 15마리/주)를 방사한 후 곤충망으로 덮어두었다. 벼멸구를 방사 7일 후에 벼 잎의 피해정도를 확인하였다.

하기 표 2에 각 물질의 저항성 유도에 의한 벼멸구 방제 효과 조사 결과를 나타내었다.

물질	피해정도 (지수:0-9)^*	방제가(%)^**
무처리	8.50±0.50 b	-
F2D2	8.50±0.50 b	-
G4B	8.00±1.00 b	5.88
H4E	2.50±1.66 a	70.59
I4E	1.00±0.00 a	88.24
I4C	1.25±0.63 a	85.29
I4D	6.00±1.29 b	29.41
G4C	8.50±0.50 b	-
I4B	5.00±0.82 b	41.18
I4F	5.25±1.93 b	38.24

* 0:건전, 1-3:경미한 피해, 4-6:중정도 피해, 7-8:피해심함, 9:완전고사

** 방제가(%) = (1-처리구 피해율/무처리구 피해율) x 100

9종의 분리 물질을 벼 유묘에 각각 처리한 후에 벼멸구를 방사한 결과, F2D2와 G4C 물질 처리구를 제외한 7가지 물질 처리구에서 모두 벼의 저항성 유도에 의한 멸구 방제 효과가 나타났다. 이 중에서도 70% 이상의 방제가를 보인 처리구는 H4E(Bacillopeptin A), I4C(Bacillopeptin B)와 I4E 신물질 처리구였으며 각각 70.59%, 85.29%, 88.24%의 방제가를 나타냈다.

상기 결과로 YC7011 균주 배양액에서 분리된 물질을 처리하면 식물 벼 저항성이 유도되어 벼멸구에 대한 방제 효과가 나타났으며 특히 신규 물질 I4E의 저항성 유도 효과가 가장 높았음을 확인하였다.

실시예 3: 바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액 분리 물질의 기주 저항성 유도에 의한 벼 알마름병 방제효능 검정

바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액 분리 물질의 기주 저항성 유도에 의한 벼 알마름병 방제효능을 검정하기 위하여, 하기와 같이 조사하였다.

벼종자(일품벼)를 상수에 담구어 가라앉은 종자를 골라 2% 차아염소산나트륨에 5분간 담구어 1차 표면 살균 한 후, 70% 알코올에 다시 5분간 넣어 2차 표면 살균하였다. 표면 살균된 종자를 멸균증류수로 여러 번 헹구어 내었다. 표면 살균된 종자를 멸균증류수에 담구어 30℃에서 3일간 암조건에 두고 매일 물을 갈아주면서 싹을 틔웠다. 싹이 난 종자를 MS배지(MS 2.2g/L, agar 8g/L, pH 6.0) 위에 심고 5일 동안 식물 생육상(28-30℃, 상대습도 80% 이상)에서 키웠다. 5일간 키운 유묘에 분리된 9종의 순수 물질 100㎍/㎖을 300㎕/주를 각각 처리하고 식물 생육상에서 5일동안 키웠다.

9종의 물질을 처리한 지 5일 후 벼 알마름병(Bukholderia glumae) 현탁액 (5x10⁷cfu/ml, OD₆₀₀=0.1)을 접종 침에 묻혀 각 잎에 3반복으로 3개 잎에 접종하였다. 병원균 현탁액은 R2A 배지에서 24시간 배양 후 원심분리하여 세균 세포를 10mM MgSO₄ 용액에 현탁시키고 농도를 적절하게 조절하여 사용하였다. 병원균 접종 후 10일 동안 생육상에 둔 후에 병반 괴사 정도를 조사하였다. 발병도는 0~3(0: 병징 없음, 1: 소형 괴사반점, 2: 몇 개 괴사반점이 합쳐져 대형 갈반, 3: 전체 괴사)으로 구분하였고, 방제가는 무처리구에 대한 병 억제 정도를 계산하여 표 2의 계산식으로 산출하였다.

하기 표 3에 분리 물질의 벼 저항성 유도에 의한 벼 알마름병 방제 효과 결과를 나타내었다. 벼 알마름병에 대하여 높은 방제가를 보인 물질 Bacillopeptin A, B와 신규 물질 I4E의 비교 사진은 도 65에 나타내었다.

물질	발병도(score:0-3)	방제가(%)
무처리	1.93±0.05 b	-
F2D2	1.00±0.09 ab	48.19
G4B	1.53±0.20 b	20.73
H4E	0.13±0.05 a	93.26
I4E	0.33±0.27 a	82.90
I4C	0.53±0.11 a	72.54
I4D	1.00±0.09 ab	48.19
G4C	1.07±0.14 ab	44.56
I4B	0.67±0.11 ab	65.28
I4F	0.73±0.30 ab	62.18

표 3을 참조하면, 9종의 물질을 유묘에 처리한지 5일 후 병원균을 접종하여 벼 알마름병 방제 효과를 조사한 결과, H4E(Bacillopeptin A) 처리구는 다른 물질 처리구들 중에 가장 높은 93.26%의 방제가를 나타냈으며, 다음으로 신규 물질 I4E는 82.90%, I4C(Bacillopeptin B)는 72.54%의 방제가를 확인하였다. 분리 물질 처리구에 따라 방제가는 조금씩 다르지만 분리 물질 처리에 의한 벼 저항성이 유도되어 벼 알마름병에 대한 방제 효과가 나타남을 확인하였다.

실시예 4: 바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액 분리 물질 처리에 의한 벼의 생육 촉진 효능 검정

바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액 분리 물질 처리에 의한 벼의 생육 촉진 효능을 검정하기 위하여, 하기와 같이 식물 생육 촉진 효능을 조사하였다.

벼종자(일품벼)를 상수에 담구어 가라앉은 종자만을 사용하였다. 가라앉은 종자를 2% 차아염소산나트륨에 5분간 담구어 1차 표면 살균을 한 후 70% 알코올에 다시 5분간 넣어 2차 표면 살균을 한 후 멸균증류수로 여러 번 헹구어 내었다. 표면 살균된 종자를 멸균증류수에 담구어 30℃에서 3일간 암조건에 두고 매일 물을 갈아주면서 싹을 틔웠다. 싹이 난 종자를 MS배지(MS 2.2g/L, agar 8g/L, pH 6.0) 위에 심고 5일 동안 식물 생육상(28-30℃, 상대습도 80% 이상)에서 키웠다. 5일간 키운 유묘에 분리된 9종의 순수 물질 100㎍/㎖을 200㎕/주를 각각 처리하고 식물 생육상에서 5일동안 키운 후 줄기의 길이와 생중량을 측정하였다.

하기 표 4에 9종의 물질 처리 후 벼 생육 촉진 효과 결과를 나타내었다.

물질	줄기 길이(cm)	생중량(mg/plant)	생중량 증가율(%)
무처리	11.4±0.5 j	48.2±2.33 f	-
F2D2	14.8±0.2 ef	60.4±1.33 cd	25.3
G4B	15.6±0.24 de	63.2±2.06 cd	31.1
H4E	17.2±0.2 c	75.6±1.69 b	56.8
I4E	21.4±0.24 a	85.0±2.24 a	76.3
I4C	19.0±3.74 b	78.0±3.74 b	61.8
I4D	13.8±0.20 gi	59.2±1.77 cde	22.8
G4C	14.4±0.24 fgh	58.8±2.22 cde	22.0
I4B	16.4±0.24 cd	65.0±2.23 c	34.9
I4F	15.6±0.24 de	65.2±2.03 c	35.3

표 4를 참조하면, YC7011로부터 분리한 9종의 물질을 처리한 지 5일 후 벼의줄기의 길이와 생중량을 측정한 결과, 물질에 따라 조금씩 차이는 있지만 무처리구와 BTH처리구와 비교하면 물질 처리에 의한 생육촉진 효과를 확인할 수 있었으며, 신규 물질 I4E의 경우, 다른 물질에 비해 76.3%의 우수한 벼의 생육 촉진 효능이 확인되었다.

실시예 5: 바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액 분리 물질의 식물 및 인체 병원 진균에 대한 억제 효능 조사

바실러스 오리지콜라 YC7011로부터 분리한 9종의 순수 물질의 식물 및 인체 병원성 진균에 대한 억제 효능을 조사하기 위하여 하기와 같이 항균활성을 조사하였다.

9종 물질의 항균 활성은 중요한 식물 병원 진균 1종 Fusarium fujikuroi (벼키다리병균), 인체에 염증을 유발하는 진균 1종 Candida albicans (칸디다)에 대한 대면 생물검정(confrontation bioassay) 방법으로 생장 억제 조사로 확인하였다.

상기 식물 병원 진균과 9종의 물질은 감자한천설탕배지(PDB, Difco) 5g을 포함한 생육배지(16g 한천 / 증류수 1ℓ) 1/5PDA와 R2A에서 평판디스크 측정법(paper disc method)를 이용하여 생장 억제효과를 조사하였다. 종이 디스크(직경 5㎜)를 배양기 가장자리로부터 1㎝ 똑같은 거리에 놓았고, 9종 물질 1,000㎍/㎖를 각각 종이 디스크에 200㎕를 처리하여 충분히 스며들게 한 후 가운데에 PDA 배지에서 4일 동안 자란 병원 진균 균사 디스크(6㎜)를 놓고 28℃℃에서 3~5일간 배양하였다.

인체 병원 진균 억제 조사는 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 Candida albicans를 살균 증류수에 현탁하여(O.D₆₀₀=0.1) 현탁액 0.1㎖를 배지에 도말한 후 9종의 물질(1,000㎍/㎖, 200㎕)이 스며든 종이 디스크를 올려 37℃에서 24시간 배양하여 병균 생장 억제 정도를 측정하였다.

하기 표 5에 9종 물질의 주요 식물 및 인체 병원 진균에 대한 항균활성 조사 결과를 나타내었다.

물질	식물 병원 진균 Fusarium fujikuroi	인체 병원 진균 Candida albicans
F2D2	-	-
G4B	-	-
H4E	+	-
I4E	++	+
I4C	+	-
I4D	-	-
G4C	-	-
I4B	+	-
I4F	+	+

[주] 억제 거리: -, 0 mm; +, < 3㎜; ++, 4~5㎜

표 5를 참조하면, YC7011 균주 배양액에서 분리한 9종 물질의 식물 병원균에 대한 항균 활성은 H4E, I4E, I4C, I4B와 I4F에서 나타났고, 인체 병원 진균에 대한 항균 활성은 I4E와 I4F 물질에서 생장 억제효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 신규 물질인 I4E는 식물 및 인체 병원 진균에 대하여 억제 활성이 모두 나타났다.

실시예 6: 바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액의 기주 저항성 유도에 의한 진딧물 방제 효능 검정

바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액의 기주 저항성 유도에 의한 진딧물 방제 효능을 검정하기 위하여, YC7011 균주와 바실러스 오리지콜라 YC7007, 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis KCTC13012), 바실러스 메칠로트로피쿠스 (Bacillus methylotrophicus KACC13105), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 프란타룸 (Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum KACC13105) 균주도 함께 하기와 같이 방제효과를 조사하였다.

식물 생육상(28-30℃, 상대습도 80% 이상)에서 4주 동안 키운 애기장대 유묘를 멸균 상토(100g)가 들어있는 포트로 옮겼고, 옮겨 심은지 7일 후에 각 처리구에 위 균주들의 현탁액(2x10⁷ cfu/L) 10ml를 상토에 분주 처리하였다. 균주 현탁액 준비는 1/10TSB 배지에서 28℃로 하루 밤 동안 진탕배양 후 원심분리하여 세균 세포를 10mM MgSO₄ 용액에 현탁시키고 농도를 적절하게 조정하여 수행하였다. 처리 7일후에 처리구 당 8주씩 진딧물(5 마리/주)을 각 처리구에 방사하였고, 진딧물 방사 7일 후에 각 포트당 진딧물의 개체수를 확인하였다.

도 66에 각 균주의 배양액 처리 후 기주 저항성 유도에 의한 진딧물 방제 효과 결과를 나타내었다.

도 66를 참조하면, 각 균주 배양액을 처리한 지 7일 후에 진딧물을 방사한 결과, B. oryzicola YC7007과 YC7011 처리구의 진딧물 수는 무처리구와 B. velezensis KCTC13012, B. methylotrophicus KACC13105, B. amyloliquefaciens subsp. plantarum KACC13105 처리구의 진딧물 수보다 훨씬 적어 통계적으로 유의한 차이를 볼 수 있었다. 따라서 B. oryzicola YC7007과 YC7011 배양액을 애기장대에 처리함으로써 기주 저항성이 유도되어 진딧물 방제 효과가 나타났음을 확인하였다.

실시예 7: 바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액의 기주 저항성 유도에 의한 벼멸구 방제 효능 검정

바실러스 오리지콜라 YC7011 배양액의 기주 저항성 유도에 의한 벼멸구 방제 효능을 검정하기 위하여, YC7011 균주와 바실러스 오리지콜라 YC7007, 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis KCTC13012), 바실러스 메칠로트로피쿠스 (Bacillus methylotrophicus KACC13105), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 프란타룸 (Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum KACC13105) 균주도 함께 하기와 같이 방제효과를 조사하였다.

식물 생육상(28-30℃, 상대습도 80% 이상)에서 10일 동안 키운 벼 유묘를 멸균 상토(100g)가 들어있는 포트로 옮겼고, 옮겨 심은지 2일 후에 각 처리구에 위 균주들의 현탁액(2x10⁷ cfu/L) 10ml를 상토에 분주 처리하였다. 균주 현탁액 준비는 1/10TSB 배지에서 28℃로 하루 밤 동안 진탕배양 후 원심분리하여 세균 세포를 10mM MgSO₄ 용액에 현탁시키고 농도를 적절하게 조정하여 수행하였다. 처리 5일후에 처리구 당 5주씩 벼멸구(15마리/주)을 각 처리구에 방사하였고, 벼멸구 방사 7일 후에 각 포트당 벼 잎의 피해정도를 확인하였다.

도 67에 각 균주의 배양액 처리 후 기주 저항성 유도에 의한 벼멸구 방제 효과 결과를 나타내었다.

도 67을 참조하면, 각 균주 배양액을 처리한 지 5일 후에 벼멸구를 방사한 결과, B. oryzicola YC7007과 YC7011 처리구의 벼멸구에 의한 피해 정도는 무처리구와 B. velezensis KCTC13012, B. methylotrophicus KACC13105, B. amyloliquefaciens subsp. plantarum KACC13105 처리구의 피해 정도보다 월등하게 낮았다. 따라서 B. oryzicola YC7007과 YC7011 배양액을 벼 근권에 처리함으로써 기주 저항성이 유도되어 벼멸구 방제 효과가 나타났음을 확인하였다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13085BP

수탁일자 : 20160830

<110> Jgreen Inc. INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel compounds produced by Bacillus oryzicola YC7011 with activities of induced resistance against plant pathogens and insect and plant growth promotion <130> NP16-06075 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1512 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Bacillus oryzicola <400> 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60 ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120 cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aatactggat ggttgtttga 180 accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420 cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480 gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540 gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600 gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660 gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720 agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840 tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900 aagactaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960 tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacggtcc tagagatagg 1020 acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt 1140 gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200 tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga 1260 aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact 1320 cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1380 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg 1440 aggtaacctt ttaggagcca gccgccgaag gtgggacaga tgattggggt gaagtcgtaa 1500 caaggtgccg ta 1512

Claims

신규 미생물 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011(수탁번호 : KCTC13085BP) 또는 상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011과 유전자 분석(BOX-PCR) 결과 동일한 패턴을 가진 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola).
제1항에 있어서,
상기 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola).
제1항의 바실러스 오리지콜라(Bacillus oryzicola) YC7011 배양액을 포함하는 미생물 제제.
제1항에 있어서,
상기 미생물 제제는 하기의 화학식 1로 표현되는 바실로펩틴 계열의 고리형 구조에 (C8~C20)의 베타 아미노산 사슬이 결합된 구조를 가지는 유효성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
(화학식 1)
제4항에 있어서,
상기 유효성분은 하기의 화학식 2~10중 어느 하나의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
(화학식 2)

(화학식 3)

(화학식 4)

(화학식5)

(화학식6)

(화학식7)

(화학식8)

(화학식9)

(화학식10)
제3항에 있어서,
상기 미생물 제제는 진딧물 방제, 벼멸구 방제, 병원 진균의 생육 억제, 식물 근권의 기주 저항성 유도 또는 식물 생육촉진효과를 가지는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
제6항에 있어서,
상기 병원 진균은 벼 키다리병을 일으키는 Fusarium fujikuroi 또는 인체 염증을 일으키는 Candida albicans인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.