KR100597317B1

KR100597317B1 - 방선균 속 신규균주 및 이를 함유하는 고추탄저병 방제용미생물농약제제

Info

Publication number: KR100597317B1
Application number: KR1020040068541A
Authority: KR
Inventors: 임융호; 김범준; 이용섭; 조광연; 최경자
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2004-08-30
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2006-07-06
Also published as: KR20060019865A

Abstract

본 발명은 방선균속(Streptomyces sp.) 신규균주 및 상기 균주를 함유하는 미생물농약제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추탄저병 방제에 유용한 항균성물질을 생성하는 방선균 속 신규균주, 상기 균주를 함유하는 고추탄저병 방제용 미생물농약제제 및 상기 미생물농약제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 고추탄저병의 방제방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방선균속(Streptomyces sp.) KACC 91028 균주는, 기존의 화학농약에서 나타날 수 있는 과다사용으로 인한 생태계의 파괴 없이도, 기존 화학농약보다 우수한 고추탄저병 방제효과를 가지므로 생물농약으로서 유용하다.

방선균, 고추탄저병, 방제, 미생물제제

Description

방선균 속 신규균주 및 이를 함유하는 고추탄저병 방제용 미생물농약제제{A Novel Streptomyces sp. and Biopesticide Containing the Strain for Extermination of Anthracnose}

도 1은 신규한 방선균속(Streptomyces sp.) KACC 91028 균주를 Bennet 배지에서 배양하여 주사현미경으로 관찰한 결과이다.

도 2는 신규한 방선균속(Streptomyces sp.) KACC 91028 균의 16S rRNA 유전자 분석결과이다.

도 3은 고추탄저병이 발병된 고추에 방선균속 KACC 91028 균의 배양액을 처리한 결과를 나타내는 사진으로, 오른쪽은 고추탄저병이 발병된 고추에 방선균속 KACC 91028 균의 배양액을 처리한 결과이고, 왼쪽은 처리하지 않은 결과이다.

본 발명은 방선균속(Streptomyces sp.) 신규균주 및 상기 균주를 함유하는 미생물농약제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추탄저병 방제에 유용한 항균성 물질을 생성하는 방선균 속 신규균주, 상기 균주를 함유하는 고추탄저병 방제용 미생물농약제제 및 상기 미생물농약제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 고추탄저병의 방제방법에 관한 것이다.

고추탄저병(anthracnose)은 진균계의 자낭균문에 속하는 콜레토트리쿰 코코드(Colletotrichum coccodes)에 의해 발병되며, 주로 과실에서 발생한다. 이 병원균은 자낭포자와 분생포자를 형성하고 자낭포자는 자낭 내에서 8개씩 생성되며 방추형으로 되어 있다. 분생포자는 타원형으로 되어 있다.

콜레토트리쿰 코코드의 생육온도는 5~35℃ 사이이나 26~28℃ 사이가 적정온도이다. 이 병의 증상은 초기에는 과실에 수침상으로 원형반점이 생기고 병이 진전됨에 따라 원형으로 확대된다. 병이 심하게 진전되면 담황색의 포자덩어리가 형성되어 과실이 말라버리게 된다. 콜레토트리쿰 코코드는 자낭각과 균사로 겨울을 지내고, 병의 전염은 주로 분생포자로 이루어진다. 병의 발생은 7월 초순부터 노지재배된 풋고추에서 시작되어 수확기까지 진전된다. 특히 고온 다습하면 좀 더 심하게 발병한다.

고추탄저병의 약제방제는 델란, 다코닐, 포룸만, 톱신엠, 크린힛 등이 사용되고 있는데 이들은 모두 화학농약이다. 화학농약이 근래에는 소비자들로부터 안전성 문제로 외면 받고 있는 현실을 감안할 때 새로운 방제방법의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 고추탄저병 방제에 효율적인 미생물제제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 방선균속에 속하는 신규균주가 고추탄저병 방제활성을 가진다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 주된 목적은 고추탄저병 방제효과를 나타내는 방선균 속 (Streptomyces sp.) 신규균주를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 함유하는 고추탄저병 방제용 미생물농약제제 및 상기 미생물농약제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 고추탄저병의 방제방법을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추탄저병에 대하여 병원성을 나타내는 방선균 속(Streptomyces sp.) 균주를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기의 균주는 방선균 속(Streptomyces sp.) KACC 91028인 것을 특징으로 할 수 있고, 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 고추탄저병 방제용 미생물농약제제 및 상기 미생물농약제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 고추탄저병의 방제방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 고추탄저병 방제용 미생물농약제제의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 배양은 베넷(Bennet)배지를 사용하여 25~30℃에서 약 10일간 수행하는 것을 특징으로 할 수 있 다.

본 발명의 균주는 방선균 속(Streptomyces sp.) KACC 91028은 2003년 2월 24일 대한민국 농업생명공학원구원(경기도 수원시 권선구 서둔동 225 (우)441-707)에 방선균 속(Streptomyces sp.) lim 8이라는 균주명과 기탁번호 KACC 91028로 기탁하였다.

본 발명의 미생물제제는 본 발명의 균주 또는 균주의 배양액 또는 배양물을 포함하는 다양한 제제의 형태, 즉 액제, 수화제, 분제, 입제, 유제 등으로 제조할 수 있다. 그 제조방법은 당업계의 일반적인 제조방법에 따른다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 구체적으로 제한되지 않는다는 것은, 당 업계에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 신규한 방선균속(Streptomyces sp.) KACC91028 균의 동정

균주 KACC 91028의 현탁배양을 위하여 방선균배양에 이용되는 Bennet 배지를 이용하였다. 배지조성은 beef extract 1g/L, yeast extract 1g/L, tryptone 2g/L, glycerol 10g/L이며, 배양온도 28℃와 pH 7.2에서 진탕시키며 10일간 배양하였다.

상기 배양된 KACC 91028 균주의 주사현미경 (Scanning Electron Microscope) 관찰결과, 방선균속(Streptomyces sp.)과 매우 유사하였다 (도 1).

신규균 방선균속(Streptomyces sp.) KACC 91028 균의 유전적 분석을 실시하고, 이를 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 다음과 같이 분석하였다. DNA 추출을 위하여 Bennet 배지에 7일간 현탁배양한 후 배양액을 원심분리 하여 cell을 분리한 다음, Genomic DNA Extraction Kit (Intron)를 이용하여 DNA를 추출하였다.

PCR은 반응용액(10mM Tris, pH 8.3; 50mM KCl; 1.5mM MgCl₂; 0.2mM dNTPs; 1 unit Taq DNA polymerase)에 30ng genomic DNA, 0.25μM 16S rRNA 유전자 primer 1쌍(fD1과 rP2)을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 절편은 약 1500bp의 크기를 보였다. PCR(초기 94℃ 5분 1회; 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 2분, 35cycle; 72℃ 10분 1회)을 실시한 후, 증폭된 16S rRNA 유전자 조각을 pGEM-T Easy vector(Promega)에 ligation한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하였다.

형질전환된 대장균은 선발배지(1.5% agar, 50mg/L ampicillin, 100μM IPTG, 50mg/L X-gal)에 도발하여 37℃에서 12시간 배양하였다. 증폭된 16S rRNA 유전자조각이 들어 있는 vector의 삽입은 blue/white colony가 나타난 배지에서 white colony만을 LB배지에 접종하여 배양하였다. 배양액은 plasmid분리를 위하여 원심분리한 후 Alkaline lysis방법을 이용하였다. 분리된 plasmid는 제한효소 EcoRI으로 절단한 후 전기영동을 통하여 증폭된 16S rRNA 유전자조각의 삽입을 확인하였다 (도 2).

증폭된 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1)은 제작된 4개의 sequencing primer (표 1)와 Big dye terminator v.3.0 (Applied Biosystems)를 이용하여 PCR 단편을 direct sequencing reaction을 수행한 후 염기서열분석장치(ABI3100)를 이용하여 분석하였으며, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST를 이용하여 homology를 확인하였다. 그 결과 방선균 스트렙토마이세스 프라보그리세우스 (Streptomyces flavogriseus)와 99%의 상동성을 보였다.

16S rRNA 유전자의 PCR 및 염기서열분석에 사용된 primer

Primer		Primer 염기서열	서열번호
PCR	fD1	5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG	2
PCR	rP2	5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT	3
Sequencing	p510r	5'-TAT TAC CGC GGC TGC TG	4
	p364f	5'-GGC AGC AGT GGG GAA TAT TG	5
	p783f	5'-TAG ATA CCC TGG TAG TCC AC	6
	p1037f	5'-TCG TCA GCT CGT GTC GTG AG	7

실시예 2: 방선균속 KACC 91028 균 배양액의 고추탄저병 방제 효과

시험 대상 고추 품종은 향촌[동부한농화학(주)]을 사용하였으며, 종자를 원예용 상토(부농사)에 파종하고 25±5℃의 온실에서 본엽 4-5엽기 고추가 되도록 재배한 후에 실험에 사용하였다. 고추 탄저병균은 Colletotrichum coccodes 2-25 균주를 사용하였으며, C. coccodes 2-25의 균사조각을 감자즙액배지(potato dextrose broth)에 접종하여 25℃, 암상태에서 7일 동안 진탕배양하였다. 이를 Waring blender로 마쇄하고 오트밀 배지(oatmeal agar)에 접종하여 25℃ 항온기에서 배양하였다. 멸균한 붓으로 오트밀 배지에 자란 C. coccodes의 균총을 긁고 광처리하여 포자를 형성하였으며, 형성된 포자는 증류수로 수확하고 3겹의 가제로 거른 후에 광학현미경하에서 혈구계(hematocytometer)를 사용하여 포자 농도를 측정하고, 포자의 농도를 ml 당 3x10⁵가 되도록 조정하여 접종원으로 사용하였다.

배양한 미생물은 전착제로 Tween 20을 첨가하여 최종농도가 250㎍/ml이 되도록 준비한 후, 4-5엽기의 고추 유묘에 미생물 배양액을 흘러내릴 정도로 살포하였다. 처리한 고추 유묘는 온실에서 1일 동안 재배한 후에 고추 탄저병균의 포자현탁액을 분무접종 하였다. 이때 무처리구는 Tween 20 250㎍/ml 용액을 살포하고 처리구와 동일하게 접종하였다. 접종한 고추 유묘는 25℃ 습실상에서 48시간 동안 습실처리한 후에 항온항습실(25℃, 상대습도 70%)에서 1-2일 동안 발병을 유도하고 고추 유묘의 병반면적율을 조사하였다. 다음과 같은 수학식 1에 따라 방제가를 계산하였다.

<수학식 1>

방제가(%) = [(1- 처리구의 병반면적율)/무처리구의 병반면적율] × 100

실시예 1의 방법으로 배양한 방선균속(Streptomyces sp.) KACC 91028 균의 배양액(미생물 세포내 물질이 포함된)을 처리한 결과와 무처리구를 비교하였다 (도 3). 일반적으로 Colletotrichum coccodes에 의해 고추 탄저병이 발생하면 잎에 둥근 병반이 생긴다. KACC 91028 균의 배양액 처리구(오른쪽)와 무처리구(왼쪽) 모두 Colletotrichum coccodes을 접종하였으나, 도 3에 나타난 바와 같이, 무처리구에서는 잎에 탄저병 병반이 관찰된 반면, 처리구에서는 방제효과로 인해 탄저병이 발생 되지 않았으며, 이때, 방제가는 90%였다. 이 결과로부터 본 발명에 따른 방선균속(Streptomyces sp.) KACC 91028 균주 또는 그 배양액은 고추 등 농작물의 탄저병 방제에 효율적이라는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 고추탄저병 방제에 유용한 방선균 속 신규균주, 상기 균주를 함유하는 고추탄저병 방제용 미생물농약제제 및 상기 미생물농약제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 고추탄저병의 방제방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 방선균속(Streptomyces sp.) KACC 91028 균은 고추탄저병 방제용 농용미생물제제로 유용하므로, 이는 기존의 화학농약에서 나타날 수 있는 과다사용으로 인한 생태계의 파괴를 방지할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

고추탄저병에 대하여 병원성을 나타내는 방선균 속(Streptomyces sp.) KACC 91028 균주.
삭제
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 미생물농약제제.
제4항에 있어서, 고추탄저병 방제용인 것을 특징으로 하는 미생물농약제제.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 고추탄저병 방제용 미생물농약제제의 제조방법.
제6항에 있어서, 배양은 베넷(Bennet)배지를 사용하여 25~30℃에서 10일간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항의 미생물농약제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 농작물 탄저병의 방제방법.
제8항에 있어서, 농작물은 고추인 것을 특징으로 하는 방법.