CN111893048B

CN111893048B - 一种构建杀虫真菌的方法

Info

Publication number: CN111893048B
Application number: CN202010583684.8A
Authority: CN
Inventors: 周燚; 成胜; 江健伟; 孙正祥; 方守国; 龚天芝
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2040-06-24
Also published as: CN111893048A

Abstract

本发明属于微生物学技术领域，提供了一种构建高效杀虫真菌的方法，该方法包括以下步骤：对杀虫细菌进行GFP标记，并筛选出具有较高表达的菌株；将标记过的杀虫细菌导入真菌原生质体内，进行共培养，筛选出转化成功的真菌；提取转化后的真菌DNA，利用杀虫细菌的特异性引物进行PCR扩增所提DNA，采用凝胶电泳验证转化成功的菌株。该方法成功将杀虫细菌导入到杀虫真菌体内，巧妙借助杀虫真菌的侵入系统将杀虫细菌直接送入昆虫血淋巴，改变了杀虫细菌进入昆虫的途径，融合了各自优势，加快了杀虫速度，克服了生物杀虫菌剂杀虫速度慢的瓶颈缺陷，将极大改变生物杀虫菌剂的未来。

Description

一种构建杀虫真菌的方法

技术领域

本发明属于微生物学技术领域，特别涉及一种构建高效杀虫真菌的方法，具体为一种将杀虫细菌导入杀虫真菌的方法。

背景技术

近年来，由于化学杀虫剂的长期施用，对生物和环境都产生了严重危害，使农田生态系统的平衡遭受破坏，并导致害虫的抗药性增强。而各类微生物杀虫剂特异性强，极少杀伤害虫天敌和有益生物，对生态环境十分安全，并由多种因素和成分发挥作用，害虫难以产生抗药性，现已成为植物保护发展的重要方向。

杀虫真菌能直接穿透害虫体壁进入虫体繁殖，消耗虫体营养，使代谢失调或在虫体内产生毒素杀死害虫，因而具有其它昆虫病原无可比拟的独特优越性；同时具有易培养、杀虫谱广、对温血动物无害等特点，如野村菌、绿僵菌等。然而，真菌也具有杀虫效果慢（需要6天以上）、不稳定（贮藏期间活性会下降）、价格偏高等明显弱点，严重妨碍了杀虫真菌在生产实践中的应用和发展。

作为另一种重要的微生物杀虫剂，杀虫细菌是一类利用某些对昆虫有致病或致死作用的细菌。同杀虫真菌一样，细菌杀虫剂也具有一定的特异性和选择性，对人、畜及非目标昆虫安全等优点。但杀虫细菌也有许多目前无法避免的缺点，如：大多数杀虫细菌作用机制是胃毒作用，即被昆虫经口摄入后，通过中肠穿孔进入昆虫体腔和血液，使昆虫因败血症导致中毒死亡，速度较快（需要3天及以上），如苏云金芽孢杆菌、杀螟杆菌、球形芽孢杆菌等。然而，细菌无法主动侵染昆虫，只有通过口腔才能进入健康昆虫体内，这使得杀虫细菌在应用中受到一定局限性，很难达到生产实践要求的预期效果。

早在1970年Mosse通过电镜就在丛枝菌根真菌（ArbuscularMycorrhiza，简称AM）中发现了类细菌体（Bacterium-Like Organisms，BLOs）的存在。Bianciotto等在1996利用16srDNA序列对丛枝菌根真菌（Gigaspora margarita）中的类细菌体进行鉴定，发现其为伯克氏菌（Burkholderia），从而证实了真菌体内可以存在内生细菌。除此而外，Cruz 和Ishii（2012）还从丛枝菌根真菌孢子中发现了3类革兰氏阳性细菌，分别为：芽孢杆菌属（Bacillussp.），苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）和根际类芽孢杆菌（Paenibacillusrhizospherae）。除了在丛枝菌根真菌中发现细菌外，在其他真菌也发现了胞内细菌的存在。Bertaux等(2003)通过对外生菌根真菌Laccaria bicolorS238N进行研究发现其体内存在类芽孢杆菌属细菌(Paenibacillussp.)。由此可见，真菌体内存在内生细菌就像细菌中存在质粒一样的普遍，而且各自能够正常的发挥自身的功能。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种构建高效杀虫真菌的方法，即将杀虫细菌导入相应的杀虫真菌体内后，杀虫真菌仍可以稳定存在并能行使其功能；杀虫细菌以寄生的形式与杀虫真菌相结合，当杀虫真菌在侵染昆虫后，由于昆虫的免疫系统存在，会使杀虫真菌部分消化溶解，从而使杀虫细菌从杀虫真菌中释放到昆虫体内，细菌在昆虫体液中迅速繁殖并杀死昆虫，达到提高杀虫效率的效果。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：

一种构建高效杀虫真菌的方法，具体包括以下步骤：

S1、对杀虫细菌进行GFP标记，且所用质粒带有抗生素素抗性，并筛选出具有较高表达的菌株；

S2、将标记过的杀虫细菌导入真菌原生质体内，然后进行共培养，利用荧光显微镜筛选出转化成功的真菌；

S3、将转化成功的真菌转接到加入抗生素的SNY培养基中培养，采用CTAB法提取转化后的真菌DNA，利用杀虫细菌的特异性引物进行PCR扩增所提DNA，采用凝胶电泳验证转化成功的菌株；

S4、将转化成功的菌株进行杀虫活力测定；

其中，所述特异性引物在杀虫细菌的DNA中只能扩增出一条带，且在真菌的DNA中无法扩增出任何条带；所述杀虫细菌为所有具有杀虫活性的细菌，包括杀线虫细菌；所述杀虫真菌为所有具有杀虫活性的真菌，包括杀线虫真菌。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述杀虫细菌导入真菌原生质体的具体方法如下：

a) 杀虫真菌用SNY培养基培养并制备原生质体；

b) 将GFP标记的杀虫细菌用LB培养基后，离心收集菌体备用；

c) 将上述步骤得到的杀虫真菌原生质体和杀虫细菌分别用电击保护液清洗并调整浓度，使原生质体与杀虫细菌个数比约为1:50~200混合均匀，冰浴后进行电击处理；

d) 将电击处理后的混合液冰浴20~30min，然后采用热激法处理3~4次；

e) 取处理后的混合液转接到加入抗生素的STC培养液中，并在该培养液中加入PEG4000、二甲基亚砜和牛肉膏，18~28℃黑暗条件下复苏培养至出现菌丝悬浊液；

f) 取（e）中培养液稀释涂布于带抗生素的SNY平板上，22~28℃黑暗培养，待出现菌丝后再倒入水琼脂制作双层平板。待菌丝长出上层平板时，挑取单菌丝制片，使用荧光显微镜镜检确定转化成功的目标。制作双层平板的目的在于脱去附着在真菌菌丝表面的细菌。

进一步地，在上述技术方案中，步骤b)所述培养条件为28℃培养48-72h；步骤b)所述冰浴时间为10~20min，电击处理的参数为0.8~2.0kV、25uF、200~400Ω。

进一步地，在上述技术方案中，步骤d）所述热激处理参数为：42℃、90s，0℃、10min；步骤e）所述PEG4000的体积分数为5%，所述二甲基亚砜的体积分数为0.5~2%，所述牛肉膏的质量分数为0.1~1%；

进一步地，在上述技术方案中，所述SNY培养基的配方为：葡萄糖20~40 g/L，蛋白胨5~15 g/L，酵母提取粉5~10 g/L，琼脂15~20 g/L、ddH₂O余量；所述STC培养液的配方为：1.2 mol/L山梨醇，10 mmol/L、pH 7.5 Tris-HCl，50 mmol/L CaCl₂。

进一步地，在上述技术方案中，所述杀虫细菌为苏云金芽孢杆菌，所述杀虫真菌为野村菌；所述特异性引物的序列为:

1520Primer1：AACTAGACCGTGGCTGGAGAGG（SEQ ID No.1）；

1520Primer2：GAACTTCTTGTGACACTTCTGCTTCC（SEQ ID No.2）。

本发明的有益效果为：提供了一种将杀虫细菌导入杀虫真菌体内构建成超级杀虫真菌的新思路及方法，像功能性质粒导入细菌一样，将杀虫细菌导入杀虫真菌体内，使杀虫细菌以内生的形式与杀虫真菌相结合。本方法创造性将杀虫细菌导入昆虫病原真菌体内，巧妙借助真菌的侵入系统将杀虫细菌直接送入昆虫血淋巴，改变了杀虫细菌进入昆虫的途径，融合了各自优势，加快了杀虫速度，克服了目前生物杀虫菌剂杀虫速度慢的瓶颈缺陷，将极大改变生物杀虫菌剂的未来。

附图说明

图1：转化成功的CQ1R⁺菌丝镜检图（A为白光下的菌丝，B为绿色荧光下的菌丝）；

图2：杀虫细菌YBT1520，野村菌CQ1R和转化菌株CQ1R⁺特异性引物PCR电泳图；

图3：野村菌原菌株CQ1R与转化成功的菌株CQ1R⁺杀虫效果比较图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

实验材料：杀虫真菌为野村菌CQ1R，对鳞翅目和鞘翅目害虫高效，由重庆大学提供；杀虫细菌为苏云金芽孢杆菌YBT1520，对鳞翅目害虫高效，由华中农业大学提供。

（1）对杀虫细菌进行GFP标记，所用质粒带有红霉素抗性，具体方法可参考文献“枯草芽胞杆菌PTS-394的GFP标记及其定殖能力”[1]；筛选出的GFP高表达YBT1520菌株对红霉素的抗性可达100μg/mL，记作GFP- YBT1520，并培养GFP-YBT1520至将要产孢阶段。

（2）将苏云金芽孢杆菌GFP-YBT1520菌株导入野村菌CQ1R(后文用CQ1R表示)构建出高效杀虫真菌CQ1R⁺。

a）野村菌CQ1R用SNY培养基培养并制备原生质体，原生质体的制备方法可参考文献“生防真菌寡雄腐霉原生质体的制备及再生”[2]。

b) 苏云金芽孢杆菌GFP-YBT1520菌株用LB培养基28℃培养48-72h，培养至含有部分芽孢、部分细胞，但无长杆状细胞后，离心收集菌体备用。

c) 将步骤a)制备的CQ1R原生质体和步骤b)制备的GFP-YBT1520菌株分别用电击保护液清洗3遍后调整浓度，其中，电击保护液含有质量分数为5% 的PEG4000和5%的葡萄糖；然后使CQ1R原生质体与GFP-YBT1520菌株按1:50~200的个数比混合均匀，冰浴20min后进行电击处理，且电击参数为1.2kV，25uF，250Ω。

d) 将电击处理后的混合液冰浴25 min，然后采用热激法处理4次，热激处理参数为：42℃、90s，0℃、10min。

e) 在STC培养液中加入50μg/mL的红霉素，同时添加体积分数为5%的PEG4000、体积分数为2%的二甲基亚砜以及质量分数为0.5%的牛肉膏；将处理后的混合液转接到该培养液中，于22℃黑暗条件下复苏培养至出现菌丝悬浊液；其中STC培养液的配方为：1.2 mol/L山梨醇（用微孔过滤），10 mmol/L、pH 7. 5 Tris-HCl、50 mmol/L CaCl₂。

f) 将步骤（e）中含有抗生素、PEG4000、二甲基亚砜和牛肉膏的菌丝培养液稀释涂布于带50μg/mL红霉素的SNY平板上，25℃黑暗培养，待出现菌丝后再倒入水琼脂（琼脂含量可以为12~15g/L）制作成双层平板。待菌丝长出上层平板时，挑取单菌丝制片，利用荧光显微镜检测真菌体内是否有GFP标记的苏云金芽孢杆菌，确定转化成功的菌落，检测结果见图1。将转化成功的真菌菌落，记作CQ1R⁺。

SNY培养基的配方为：葡萄糖40g，蛋白胨10 g，酵母提取粉5 g，琼脂15 g、用ddH₂O定容到1 L。

（3）将转化成功的CQ1R⁺转接到SNY培养基中培养，利用CTAB法提取CQ1R⁺的DNA，利用YBT1520的特异性引物进行PCR扩增所提DNA，通过凝胶电泳进一步验证了转化成功的菌株，具体检测结果见图2。

特异性引物的要求为：在YBT1520中允许有部分非特异性结合，但在CQ1R中无法扩增出任何条带。本实施例中所选序列在YBT1520菌株特有质粒cry1Aa上，目的片段长度为981bp。本实施例中的特异性引物序列如下所示：

1520Primer1：AACTAGACCGTGGCTGGAGAGG（SEQ ID No.1）

1520Primer2：GAACTTCTTGTGACACTTCTGCTTCC（SEQ ID No.2）

（4）转化菌株CQ1R⁺杀虫效果的评价，将转化成功的CQ1R⁺菌株和原始菌株CQ1R分别接种在SMAY培养基上25℃培养产孢，将分生孢子粉用无菌的0.05% Tween-80水溶液配制成5×10⁸个孢子/mL的孢子悬液，空白对照组为0.05% Tween-80水溶液。用镊子将6龄斜纹夜蛾浸没在孢子悬浮液中（注意镊子夹取时的力度）5~8s，浸渍完后放于无菌滤纸上吸干水分，然后将其分别放于人工养虫室（温度25℃，湿度50%）连续观察8天。

结果表明构建菌株CQ1R⁺处理2天，幼虫开始死亡，原始菌株CQ1R处理4天开始出现死亡。处理第6天（如图3），空白对照CK幼虫全部化蛹；原始菌株CQ1R组死亡率15%，其余全部成功化蛹；构建菌株CQ1R⁺组死亡率达80%，死亡虫体大部分全身发黑，与野村菌杀死昆虫状态有差异，说明苏云金芽孢杆菌发挥了重要作用。

所述SMAY培养基的配方为：麦芽糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，琼脂12 g/L。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

参考文献：

[1]刘邮洲,梁雪杰,乔俊卿,张荣胜,陈志谊.枯草芽胞杆菌PTS-394的GFP标记及其定殖能力[J].植物保护学报,2014,41(04):416-422；

[2]彭轶楠,王沛雅,巩晓芳,祝英,杨晖,王治业,周剑平.生防真菌寡雄腐霉原生质体的制备及再生[J].菌物学报,2017,36(06):679-690。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一种构建杀虫真菌的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aactagaccg tggctggaga gg 22

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaacttcttg tgacacttct gcttcc 26

Claims

1.一种构建杀虫真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、对杀虫细菌进行GFP标记，且所用质粒带有抗生素抗性，并筛选出具有较高表达的菌株；

S4、将转化成功的菌株进行杀虫活力测定；

其中，所述特异性引物在杀虫细菌的DNA中只能扩增出一条带，且在杀虫真菌的DNA中无法扩增出任何条带；所述杀虫细菌为苏云金芽孢杆菌，所述杀虫真菌为野村菌；

所述特异性引物的序列如下所示：

1520Primer1：AACTAGACCGTGGCTGGAGAGG（SEQ ID No.1）；

1520Primer2：GAACTTCTTGTGACACTTCTGCTTCC（SEQ ID No.2）；

所述SNY培养基的配方为：葡萄糖20~40 g/L，蛋白胨5~15 g/L，酵母提取粉5 ~10g/L，琼脂15~20 g/L、ddH2O余量。

2.根据权利要求1所述构建杀虫真菌的方法，其特征在于，步骤S2中，所述杀虫细菌导入真菌原生质体的具体方法如下：

a)杀虫真菌用SNY培养基培养并制备原生质体；

b)将GFP标记的杀虫细菌用LB培养基培养后，离心收集菌体备用；

c)将上述步骤得到的杀虫真菌原生质体和杀虫细菌分别用电击保护液清洗并调整浓度，使原生质体与杀虫细菌个数比为1:50~200混合均匀，冰浴后进行电击处理；

d)将电击处理后的混合液冰浴20~30min，然后采用热激法处理3~4次；

e)取处理后的混合液转接到加入抗生素的STC培养液中，并在该培养液中加入PEG4000、二甲基亚砜和牛肉膏，18~28℃黑暗条件下复苏培养至出现菌丝悬浊液；所述STC培养液的配方为：1.2mol/L山梨醇，10 mmol/L、pH 7.5 Tris-HCl，50 mmol/L CaCl₂；

f)取（e）中培养液稀释涂布于带抗生素的SNY平板上，22~28℃黑暗培养，待出现菌丝后再倒入水琼脂制作双层平板，待菌丝长出上层平板时，挑取单菌丝制片，使用荧光显微镜镜检确定转化成功的目标。

3.根据权利要求2所述构建杀虫真菌的方法，其特征在于，步骤b)所述培养条件为28℃培养48-72h；步骤c)所述冰浴时间为10~30min，电击处理的参数为0.8~2.0kV、25uF、200~400Ω。

4.根据权利要求2所述构建杀虫真菌的方法，其特征在于，步骤d）所述热激处理参数为：42℃、90s，0℃、10min；步骤e）所述PEG4000的体积分数为5%，所述二甲基亚砜的体积分数为0.5~2%，所述牛肉膏的质量分数为0.1~1%。