CN1405307A - 两真菌与一细菌原生质体融合的特效菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
两真菌与一细菌原生质体融合的特效菌株及其构建方法，是将白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)真核细胞、土著细菌YZ1原核细胞(Pseudomonas)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞，共三个亲株菌的两界细胞的原生质体进行融合，三亲基因在同一个细胞内重组整合，构建出基因工程特效菌。该技术由双亲跨界融合和三亲跨界融合两部分组成。特效菌株同时含有三亲的基因DNA片段，综合了三亲株优势，利于处理废水。原生质体融合不产生新基因，不存在基因污染问题。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种特效菌株及其构建方法，尤其是一种用于降解有机污染物的微生物新菌种的生物构建和应用技术，更具体而言是两真菌与一细菌原生质体融合的特效菌株及其构建方法。
二、背景技术：
就原生质体融合生物技术而言，国际上已有种种原生质体融合专利，但是没有两界三亲菌株的融合技术专利。如用于选择抗生素的菌种，如Imada C，Isolationand characterization of the interspecific fusants from Streptomycetes obtained using aliquor regeneration method，FISHERIES SCI，68(2)：395-402，2002；和Baltz RH，Genetic methods and strategies for secondary metabolite yield improvement inantinomycetes，ANTON TEEUW INT J G 79(3-4)：251-259，2001。未见有专用于处理废水的三种微生物原生质体融合菌种和构建专利，尤其是未见真核原核两界菌株原生质体融合的构建菌种技术。
三、发明内容
本发明目的是：用两界微生物菌株原生质体融合的菌种构建新菌株，将三个菌株的基因和优势，通过体内重组与整合，构建在一个菌株细胞内，用于废水处理。
一种特效菌株及其构建方法，亲株1白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)真核细胞，亲株2土著细菌YZ1(Pseudomonas)原核细胞，亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞中，2个真菌亲株的真核细胞原生质体制备是用蜗牛酶脱去细胞壁及1个细菌亲株的原核细胞原生质体是用溶菌酶脱去细胞壁，制备生成的原生质体经离心收集、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合。第一次融合：等量的亲株1白腐真菌(或亲株3酿酒酵母)细胞和亲株2土著细菌YZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Fhh；而亲株1白腐真菌细胞(或亲株3酿酒酵母)细胞和亲株2土著细菌YZ1细胞，只能分别在SIM1和SIM2上生长；第二次融合：上次得到的等量的Fhh和亲株3酿酒酵母(或亲株1白腐真菌)细胞的原生质体混合、在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Fhhh1或Fhh。
所述固体鉴别培养基(SIM)为单一抗细菌的抗生素[SIM1＝SM+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm)]和单一抗真菌的抗生素[SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)]以及二种抗生菌同时存在的组合[SIM3＝SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)]
发明的有益效果：
(1)融合构建NJU-Fhhh1特效菌的成本，低于分子克隆，费用在10万元人民币以内；
(2)原生质体融合菌株的遗传性能稳定、重现性好，同时含有三亲株DNA的功能优势；
(3)原生质体融合技术操作较分子克隆简便，可以省去建立基因图谱等操作；
(4)原生质体融合是自然基因在细胞内重组，没有创造新基因，不存在基因污染问题。
总之，本发明是两界三个亲株微生物原生质体融合的原创性的生物技术。是应用两界三亲菌株原生质体融合技术构建特效菌处理废水的首例。本发明亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)具有高降解性，亲株2土著细菌YZ1(Pseudomonas)具有高适应性，亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有高絮凝性。融合三亲菌株，通过基因在同一个细胞内的重组整合，获得了特效菌NJU-Fhhh1，集中了三个亲株的高降解性、高适应性、高絮凝性的三高优势，利于高效处理有机废水。使用效果：NJU-Fhhh1降解PTA石化废水的比降解率为0.263h-1，是土著菌的12倍。
四、附图说明
图1为本发明亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)电子显微镜照片
图2为本发明亲株2土著细菌YZ1(Pseudomonas)，电子显微镜照片
图3为本发明亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)电子显微镜照片
图4为本发明三株融合后得到的NJU-Fhhh1菌株电子显微镜照片图
五、具体实施方式
本发明一般由白腐真菌和亲株2土著细菌YZ1细胞的原生质体先行融合后再与酿酒酵母细胞融合较优，即：白腐真菌+土著细菌YZ1＝Fhh(第一次融合)，Fhh+酿酒酵母细胞＝Fhhh(第二次融合)。以下为实施例：A.试剂来源：蜗牛酶和溶菌酶为上海华美公司产品；聚乙二醇(MW＝6000)为日本进口； Giemsa染色剂为美国Sigma公司产品；其余试剂均为国产分析纯化学试剂B.基础液体培养基(MM)：1000ml中：K2HPO4 3g；KH2PO4 1g；NH4NO3 0.5g；Na2SO40.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl2 0.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0；121℃、103kPa、湿热灭菌20min。最适培养温度：35℃；最适pH：7.0。C.固体基础培养基(SM)：SM＝液体培养基(MM)+2％琼脂；D.固体鉴别培养基(SIM)：SIM1＝SM+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm)，SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)，SIM3＝SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)E.真核细胞(亲株1白腐真菌、亲株3酿酒酵母)原生质体制备：
10,000rpm离心收集每毫升108个细胞的菌体、0.5％蜗牛酶、30℃反应40分钟脱去细胞壁、生成原生质体。10,000rpm离心10分钟收集原生质体、pH7.0缓冲液清洗2遍。E.原核细胞(亲株2土著细菌YZ1)原生质体制备：土著细菌YZ1(Pseudomonas)假单胞菌属，是废水处理现场的能与废水共生的假单胞菌属的菌种，如图3中所给出的外形。10,000rpm离心收集每毫升108个细胞的菌体、0.5％溶菌酶、30℃反应40分钟脱去细胞壁、生成原生质体。10,000rpm离心10分钟收集原生质体、pH7.0缓冲液清洗2遍。F.第一次融合：等量的亲株1白腐真菌细胞和亲株2土著细菌YZ1细胞的原生质体混合、35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃诱导融合30分钟，10,000rpm离心10分钟收集融合产物、pH7.0的17％蔗糖高渗缓冲液离心清洗2遍、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Fhh；而亲株1白腐真菌细胞和亲株2土著细菌YZ1细胞，只能分别在SIM1和SIM2上生长。G.第二次融合：等量的Fhh和亲株3酿酒酵母细胞的原生质体混合、35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃诱导融合30分钟，10,000rpm离心10分钟收集融合产物、pH7.0的17％蔗糖高渗缓冲液离心清洗2遍、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Fhhh1或Fhh。H.电子扫描显微镜(SEM)形态鉴定：14天连续分离纯化Fhhh和Fhh、及亲株1白腐真菌、亲株2土著细菌YZ1、亲株3酿酒酵母的单菌落，对该5菌 株的纯化单菌落细胞，用SEM放大10万倍摄像，确定NJU-Fhhh1菌株的形态特征既不同于Fhh，也不同于任一亲株菌。如图所示。I.分子遗传学鉴定：由上海生物工程公司合成亲株1白腐真菌的mnp1、mnp2、lip1、lip2基因引物、亲株2土著细菌YZ1的16SrDNA引物、亲株3酿酒酵母的FLO1基因引物，应用该6对引物，同时对Fhhh、Fhh、亲株1、亲株2、亲株3的5个菌株的染色体DNA模板，进行DNA扩增(PCR)反应，鉴定出只有NJU-Fhhh1同时含有三个亲株的基因DNA片断，Fhh只含有两个亲株的基因DNA片断，三亲株只含有各自的基因DNA片断。如图所示。NJU-Fhhh1特效菌株构建方法的流程
(1)亲株1白腐真菌细胞原生质体制备
(2)亲株2土著细菌YZ1细胞原生质体制备
(3)等量混合亲株1真核细胞与亲株2原核细胞的原生质体
(4)聚乙二醇和Ca2+诱导亲株1与亲株2原生质体的首次两界细胞(双亲株)融合
(5)SIM3双抗培养基，初筛获得首次两界细胞的融合产物Fhh
(6)制备两界细胞融合产物Fhh的原生质体
(7)制备亲株3酿酒酵母原生质体(方法同亲株1白腐真菌细胞原生质体制备)
(8)等量混合Fhh与亲株3酿酒酵母的原生质体
(9)聚乙二醇和Ca2+诱导Fhh与亲株3原生质体的第二次两界细胞(三亲株)融合
(10)SIM3双抗培养基初筛获得第二次两界细胞(三亲株)融合产物NJU-Fhhh1或Fhh
(11)纯化分离培养14天，SEM电子扫描显微镜鉴定出NJU-Fhhh1细胞形态不同于Fhh
(12)PCR鉴定NJU-Fhhh1细胞，同时含有亲株1白腐真菌的mnp1、mnp2、lip1、lip2基因、亲株2土著细菌YZ1的16SrDNA、亲株3酿酒酵母的FLO1基因的6个基因DNA片段
(13)纯化、筛选出性能稳定的高效处理废水的NJU-Fhhh1特效菌
(14)进入NJU-Fhhh1特效菌处理废水的应用应用实例名称：三亲株跨界融合构建工程菌Fhhh降解精对苯二甲酸PTA石化废水三亲株名称：白腐真菌PC[真核细胞]、土著菌YZ1[原核细胞]、酿酒酵母SC[真核细胞]
(1)白腐真菌PC真核细胞原生质体制备及条件：10,000rpm离心108细胞菌液10分钟，收集菌体、0.5％蜗牛酶、30℃反应40分钟、10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离心清洗2遍。
(2)PTA石化废水土著细菌YZ1原生质体制备及条件：10,000rpm离心108细胞菌液10分钟，收集菌体细胞、0.5％溶菌酶、30℃反应40分钟、10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离心清洗2遍。
(3)等量混合PC与YZ1的原生质体，
(4)聚乙二醇和Ca2+诱导PC与YZ1双亲跨界融合：35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃诱导融合30分钟，
(5)双亲首次跨界融合产物Fhh初筛：10,000rpm离心10分钟收融合产物Fhh、PH7.0、蔗糖17％高渗缓冲液、离心清洗2遍、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落为Fhh。
(6)Fhh原生质体制备：[操作同于(1)PC]
(7)SC原生质体制备：[操作同于(1)PC]
(8)聚乙二醇和Ca2+诱导：Fhh与SC的三亲株跨界融合：[操作同于(3)的双亲跨界融合]
(9)等量混合Fhh与SC原生质体
(10)第二次跨界融合(三亲)产物Fhhh初筛[操作同于(4)]。能在SIM3双抗培养基的有三亲跨界融合的Fhhh和双亲跨界融合的Fhh。
(11)连续纯化分离培养14天：Fhhh、Fhh、PC、SC、YZ1，SEM电子扫描显微镜，放大10万倍，扫描摄像鉴定出Fhhh形态不同于Fhh，初获Fhhh纯菌株。
(12)分子遗传学鉴定Fhhh：700代以上的Fhhh纯化物，用PCR-DNA扩增技术，鉴定出只有同时含有PC的mnp基因、SC的FLO1基因和YZ1的16SrDNA片断的才是真正的Fhhh，表明Fhhh有遗传稳定性
(13)获得纯化稳定的Fhhh遗传工程菌
(14)进入废水处理应用阶段的技术开发
三亲株跨界融合构建工程菌技术的实例总结
1.PC、YZ1、SC两界三亲株跨界融合构建获得的工程菌为：Fhhh.
2.Fhhh能在同时含有100u制霉菌素/ml和100u链霉素/ml培养基上生长，三亲菌株各自不能。
3.Fhhh细胞长轴1.407±0.016μm、短轴1.278±0.017μm、体积1.206±0.030μm3，不同于任一亲株。
4.Fhhh同时含有三亲株基因DNA片段，综合了三亲株的高降解性、高絮凝性、高适应性，具有遗传稳定性
5.Fhhh降解精对苯二甲酸PTA石化废水的比降解率q为0.263h-1，是土著菌YZ1的12倍。
特效菌株Fhhh原生质体跨界融合的双抗生化鉴定及生成、再生、融合率跨界融合过程序 第一次跨界融合 第二次跨界融合
号亲株及跨界融合 亲株 一次 亲株 二次融
子 融合 合子
子菌株简称 PC or SC YZ1 Fhh Fhh SC or PC Fhhh链霉素Sm培养 生长 不生长 - 生长 生长 -基，100u/ml制霉菌素Nt培养 不生长 生长 - 生长 不生长 -基，100u/mlSm+Nt的双抗培养 不生长 不生长 生长 生长 不生长 生长基，100u/ml原生质体生成 90.7/86.8 82.6/87.2 - 83.4/85.4 87.6/86.3 -率，％原生质体再生 5.8/7.1 3.4/2.3 - 3.4/3.5 3.3/3.5 -率，％原生质体跨界融 0.62/0.39 - 1.25/0.57 -合率，×10-6
特效菌株Fhhh及其三亲菌株细胞电子扫描显微镜(SEM)形态学鉴定
1.细胞前处理：菌体细胞样品，经0.2μm聚碳酸酯膜过滤(Gelman Science，AnnArbor.MI USA)，
无菌水 冲洗，3％戊二醛-0.2M钠钾钴素缓冲液浸泡过夜，OsO4固定。钠钾钴素及不同浓度乙醇过洗脱水，液态CO2干燥。喷镀钯合金。
2.电子显微镜扫描测定：电子扫描显微镜，AMR 1000 Scanning ElectronMicroscope，USA。条件：
EHT＝12.00KV，WD＝16mm，Mag＝5.00kx，Detector＝SE1。
3.特效菌株Fhhh及其三亲株SEM的细胞尺寸菌株简称 PC YZ1 SC Fhh Fhhh长(μm) 3.567±0.196 3.310±0.223 3.500±0.242 2.944±0.106 1.407±0.016直径(μm) 0.589±0.017 0.989±0.026 2.926±0.074 0.711±0.018 1.278±0.017体积(μm3) 0.971±0.181 2.542±0.171 15.682±1.085 1.168±0.042 1.206±0.030
本发明特效菌株Fhhh含有三亲菌株基因DNA片段分子遗传学鉴定1.仪器设备：
(1)Incubation shaker：G25-KLC，New Brunswick Scientific.Co，USA
(2)Gel imaging system：TSTC GIS-7000，TSTC Shanghai，China
(3)Electrophoresis instrument：DY-602V，Nanda company，NJU，China
(4)PCRAuthorized Thermal Cycler：Mastercycler Personal.Eppendorf，Germany
2.DNA marker(标准分子量)：26-501bp，pUC19 DNA/Msp1(Hpa II)，MBIFermentas，USA；100-3000bp，GeneRulerTM 100bp DNA Ladder Plus，MBIFermentas，USA。
3.PCR kit：上海生工。
4.PCR模板：The cell walls of SC，PC and Fhhh were fractured with snail enzyme，and YZ1 with lysozyme at 37℃ for 1h.Releasing the Ch-DNA with SDS wasconducted at 60℃ for 0.5h，，then kept on blue ice for 0.5h，centrifuged at10000rpm for 10min.CH3CONH4 was used to remove the protein，95％ of coldalcohol was used to set down Ch-DNA as the PCR template.
5.PCR 6对引物的设计与合成DNA菌株序号 合成引物的DNA序列 参考文献 合成单位
5’-ATG GGA GTA GCG GAA Godfrey，199 上海植生所
1mnp1 GCA-3’ 0(PC) 3’-CGA GTG CGG TGA AGA Godfrey，199 上海植生所
2
GTA-5’ 0
5’-ATG TAG GCA GAC TGC Godfrey，199 上海植生所
3mnp2 AAG-3’ 0(PC) 3’-GAG GTG CTG CTC AAG Godfrey，199
4 上海植生所
GTA-5’ 0
5’-ATG TCG TCG AGA AGC Naidou，1992
5 上海植生所lip1 GTC-3’(PC) 3’-ACA TCG GTC TCG ACG Naidou，1992
6 上海植生所
GTA-5’
5’-ATG AAG CGA CCA CGA Naidou，1992
7 上海植生所lip2 CAG-3’(PC) 3’-CGA CTC TCA CCA CTC Naidou，1992
8 上海植生所
GTA-5’
5’-CGG AAT TCC TCC AAC TAC Teunissen，199
9 上海生工公司FLO1 TG-3’ 3(SC) 3’-CAG AAG CGC AGG CTT AAG Teunissen，199
10 上海生工公司
GC-5’ 3
5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT Griffiths，200
11 上海生工公司16SrDNA T-3’ 0(YZ1) 12 3’-GAC TCG GTC CTA GTT TGG Griffiths，200
上海生工公司
AG-5’ 0
6.特效菌Fhhh同时含有三亲株细胞中基因DNA片段的PCR测定结果基因DNA Fhhh与PC Fhhh与SC Fhhh与YZ1mnp1 2个片段相同 无 无mnp2 1个片段相同 无 无lip1 2个片段相同 无 无lip2 1个片段相同 无 无FLO1 无 1个片段相同 无16SrDNA 无 无 2个片段相同
本发明的微生物保藏资料：2002年7月26日保藏，保藏编号是CGMCCNo.0783三亲株跨界融合特效菌是白腐真菌(phanerochaete chrysoporium)酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、土著细菌(YZ1)三者原生质体融合产物。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所。
Claims (9)
1、一种由两真菌与一细菌原生质体融合的特效菌株，其特征是以亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)，亲株2土著细菌YZ1(Pseudomonas)，亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞原生质体和原核细胞原生质体制备后融合。先制备原生质体，并经离心后收集、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合。第一次融合：等量的亲株1白腐真菌或亲株3酿酒酵母细胞的原生质体与亲株2土著细菌YZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物；第二次融合：上次得到的等量的Fhh与亲株3酿酒酵母或白腐真菌细胞的原生质体混合、在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Fhhh1或Fhh。
2、一种由两真菌与一细菌原生质体融合的特效菌株构建方法，其特征是由亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)，亲株2土著细菌YZ1(Pseudomonas)，亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞和原核细胞先进行原生质体的制备：用蜗牛酶和溶菌酶分别脱去真菌和细菌细胞壁、生成原生质体并经离心收集、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合，第一次融合：等量的亲株1白腐真菌PC或酿酒酵母细胞SC和亲株2土著细菌YZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后；第二次融合：上次得到的等量的Fhh和亲株3酿酒酵母SC或白腐真菌PC细胞的原生质体混合、在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Fhhh1或Fhh。
3、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是第一次融合原生质体分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上，以30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Fhh；第一次双亲跨界融合的产物Fhh再进行第二次融合。
4、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是所述固体鉴别培养基(SIM)为抗细菌的抗生素和抗真菌的抗生素以及二种抗生菌的组合。
5、由权利要求4所述的特效菌株构建方法，其特征是所述抗生素为抗细菌的抗生素和抗真菌的抗生素，即抗细菌的链霉素和抗真菌的制霉菌素。SIM1＝SM+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm)，SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)，SIM3＝SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)。
6、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是白腐真菌PC真核细胞原生质体制备及条件：10,000rpm离心108细胞菌液10分钟，收集菌体、0.5％蜗牛酶、30℃反应40分钟、10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离心清洗2遍。
7、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是以PTA石化废水土著细菌YZ1(Pseudomonas)属于假单胞菌属，土著细菌YZ1原生质体制备及条件：10,000rpm离心108细胞菌液10分钟，收集菌体细胞、0.5％溶菌酶、30℃反应40分钟、10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离心清洗2遍。
8、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是聚乙二醇和Ca2+诱导PC或SC与YZ1双亲跨界融合：35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃诱导融合30分钟，并经双亲首次跨界融合产物Fhh初筛：10,000rpm离心10分钟收融合产物Fhh、PH7.0、蔗糖17％高渗缓冲液、离心清洗2遍、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落为Fhh。
9、由权利要求8所述的特效菌株构建方法，其特征是先制备Fhh原生质体和SC或PC原生质体，经聚乙二醇和Ca2+诱导：Fhh与SC或PC的三亲株跨界融合：等量混合Fhh与SC或PC原生质体，第二次跨界融合(三亲)产物Fhhh初筛，能在SIM3双抗培养基的有三亲跨界融合的Fhhh和双亲跨界融合的Fhh。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |