KR102240134B1 - 서팩틴을 생산하는 신규 미생물 바실러스 벨레젠시스 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서팩틴 생산능이 우수한 신규 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP, 이를 이용한 서팩틴의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 본 발명의 신규 미생물 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP 균주는 서팩틴 생산능이 우수하므로, 종래에 서팩틴을 생산하는 고초균보다 많은 양의 서팩틴을 생산할 수 있으며, 이에 따라 세정능이 우수하면서도 경제적인 측면에서 바람직한 친환경 세제를 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 서팩틴 생산능이 우수한 신규 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP 및 이를 이용한 서팩틴의 생산방법에 관한 것이다.
계면활성제는 물에 녹기 쉬운 친수성 부분과 기름에 녹기 쉬운 소수성 부분을 가지고 있는 화합물로서, 세척제의 주요 성분이다. 계면활성제는 화학적 방법으로 공장에서 생산한 합성 계면활성제(synthetic surfactants)와 생물들이 살면서 부산물로 생산한 바이오 계면활성제(Biosurfactants)로 구별된다. 합성 계면활성제들은 값이 저렴하고 유화력이 높기 때문에 일상생활에 많이 사용된다. 반면에 바이오 계면활성제들은 일반적으로 유화력이 낮고 생산비가 높아 일상생활에 거의 사용할 수 없다. 바이오 계면활성제로 알려진 서팩틴(surfactin)은 예외적으로 합성 계면활성제들보다 유화력이 탁월하지만 역시 생산비가 비싸기 때문에 일상생활용 세척제로 사용하지 않고 있다.
일상생활에 사용하고 있는 합성세제는 토양과 수질오염의 원인이 되며 식물의 성장을 억제한다. 이와 같은 환경오염 가능성 때문에 바이오 계면활성제에 대한 관심과 사용가치가 매우 높아지고 있다.
바이오 계면활성제란, 효모, 곰팡이, 박테리아 등 미생물에 의해 생산되는 생분해성 계면활성제로서, 화학합성 계면활성제에 비해 무독성으로 생분해가 용이한 친환경적인 물질일 뿐만 아니라, 다양한 온도와 pH에 의해 계면활성제의 물리 화학적 성상을 안정하게 유지할 수 있다.
한편, 태양광패널을 이용한 태양광발전은 무공해 재생 에너지원(renewable energy sources)으로 간주되고 있다. 태양광발전은 태양광패널의 청결상태에 따라서 발전량이 크게 영향을 받는데, 깨끗한 패널에 먼지가 쌓이면 발전량이 >10% 감소한다. 따라서, 전력생산이 감소하지 않도록 세척제를 이용하여 정기적으로 패널을 청소해주는 것이 중요하다.
일반적으로 태양광패널의 세척에 사용하고 있는 합성세제는 토양과 수질오염의 원인이 되며 식물의 성장을 억제한다. 이와 같은 환경오염 가능성 때문에 세척제를 많이 사용하는 태양광발전소 인근 주민들은 농지, 산림, 하천, 마을, 양식장 근처에 태양광발전소 건설을 반대한다. 따라서, 환경오염 가능성이 현저히 낮고 태양광패널의 세척능이 우수한 새로운 바이오 계면활성제의 개발이 필요한 실정이다.
바이오 계면활성제로서 유화력이 우수한 서팩틴은 3개의 non-ribosomal pepetide synthase(NRPS)에 의해서 4 종류의 아미노산(Glu, Asp, Val, Leu) 7개가 결합하여 고리형태로 연결되고 여기에 12-17개의 탄소기둥(carbon backbone)으로 이루어진 지질산이 결합된 지질다중아미노산(lipopolypeptide)이다. 서팩틴은 고초균인 바실러스 스브틸리스(B. subtillis), 바실러스 프밀루스(B. pumilus), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 라이케니포미스(B. licheniformis), 바실러스 모자벤시스(B. mojavensis) 등 (Hmidet et al., 2017)에 의해서 생산된다. 상기 고초균에 의해 생산되는 서팩틴은 고초균의 발효조건이 좋아도 대부분 고초균은 배양하는 동안 리터당 200mg이하의 매우 적은 양의 서팩틴을 생산하여(Chen et al., 2015), 서팩틴을 다양한 분야의 계면활성제로 이용하는데 한계가 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 장수풍뎅이 유충의 분변으로부터 유화능력이 우수한 균주들을 분리하고, 상기 균주들로부터 서팩틴의 생산능이 우수한 신규 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 (KACC81099BP)을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Chen, W.-C., Juan, R.-S., and Wei, Y.-H. (2015). Applications of a lipopeptide biosurfactant, surfactin, produced by microorganisms. Biochemical Engineering J 103, 158-169.
Besemer, J., Lomsadze, A., and Borodovsky, M. (2001). GeneMarkS: a self-training method for prediction of gene starts in microbial genomes. Implications for finding sequence motifs in regulatory regions. Nucleic Acids Research 29, 2607-2618.
Darling, A.C., Mau, B., Blattner, F.R., and Perna, N.T. (2004). Mauve: multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements. Genome research 14, 1394-1403.
Jakinala, P., Lingampally, N., Kyama, A., and Hameeda, B. (2019). Enhancement of atrazine biodegradation by marine isolate Bacillus velezensis MHNK1 in presence of surfactin lipopeptide. Ecotoxicology and environmental safety 182, 109372.
Koren, S., Harhay, G.P., Smith, T.P., Bono, J.L., Harhay, D.M., McVey, S.D., Radune, D., Bergman, N.H., and Phillippy, A.M. (2013). Reducing assembly complexity of microbial genomes with single-molecule sequencing. Genome biology 14, R101.
Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., and Tamura, K. (2018). MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Molecular biology and evolution 35, 1547-1549.
Lagesen, K., Hallin, P., Rodland, E.A., Staerfeldt, H.H., Rognes, T., and Ussery, D.W. (2007). RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. Nucleic acids research 35, 3100-3108.
Schattner, P., Brooks, A.N., and Lowe, T.M. (2005). The tRNAscan-SE, snoscan and snoGPS web servers for the detection of tRNAs and snoRNAs. Nucleic acids research 33, W686-689.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 서팩틴 생산능이 우수한 신규 미생물 균주인 바실러스 벨레젠시스 IM1(KACC81099BP)을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 벨레젠시스 IM1(KACC81099BP)을 이용한 서팩틴의 생산방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 벨레젠시스 IM1(KACC81099BP) 또는 이의 배양액을 이용한 기능성 천연 세제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 벨레젠시스 IM1(KACC81099BP) 또는 이의 배양액을 이용한 태양광 패널 세정용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 벨레젠시스 IM1(KACC81099BP) 또는 이의 배양액을 이용한 항균 및 항진균용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서팩틴(sulfactin)을 생산하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP를 제공한다.
바이오 계면활성제는 효모, 곰팡이, 박테리아 등 미생물에 의해 생산되는 생분해성 계면활성제로서, 친환경적인 물질일 뿐만 아니라 계면활성제의 물리 화학적 성상을 안정하게 유지할 수 있다. 바이오 계면활성제 중 서팩틴은 유화력은 탁월하나 서팩틴을 생산하는 고초균은 배양하는 동안 매우 적은 양의 서팩틴을 생산하기 때문에 생산비가 높아 일상생활용 세정제로 이용하는데 한계가 있다.
본 발명자들은 이러한 서팩틴을 생산하는 고초균들 중에서 서팩틴 생산능이 우수한 균주를 분리 및 동정하기 위하여 장수풍뎅이 유충의 분변으로부터 유화능력이 우수한 균주들을 분리하였다.
본 발명에 따르면, 대한민국 전남지역에서 수득한 장수풍뎅이 유충의 분변으로부터 고초균들을 분리하고, 이들의 유화능력을 비교하여 유화능력이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선별하여, 이에 대한 전장 유전체 염기서열 분석 및 유전자 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 선별된 균주의 전장 유전체 염기서열을 NCBI의 “GenomeProject database"에 등록(GenBank CP041784)하였다. 또한, 선별된 균주를 신규 미생물로서 “바실러스 벨레젠시스 IM1”라 명명하고 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 2019년 7월 19일자로 기탁하였고, 기탁번호 KACC81099BP를 부여 받았다.
본 발명의 신규한 미생물 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP는 서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 16S rDNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 선별된 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP의 전장 유전체의 염기서열을 두 가지 방법으로 결정하였다. Illumina shotgun sequencing 방법으로 1000배를 읽었으며, PacificBioscience long reads sequencing 방법으로 200배수를 읽은 다음 이 시퀀스들을 연결하여 전장유전체를 결정하였다.
본 발명의 신규한 미생물 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP는 바실러스 벨레젠시스 균주(Jakinala et al., 2019)보다 서팩틴 생산능이 2배 이상 높은 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP는 리터당 2g의 서팩틴을 생산하는 것을 확인하였다. 이는, 바실러스 벨레젠시스들 중 서팩틴을 생산하는 것으로 알려진 균주(Jakinala et al., 2019)가 리터당 0.83의 서팩틴을 생산하는 것과 비교하였을 때, 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP의 서팩틴 생산능이 2배 더 높은 것을 알 수 있다(본원발명 실시예 9 및 표 3 참조).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제1항의 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP를 고체배지에 배양하여 콜로니를 형성하는는 단계, (b) 상기 콜로니를 액체배지에 접종하여 서팩틴을 분비 및 생성하여 서팩틴을 수득하는 단계를 포함하는 서팩틴의 생산방법을 제공한다.
상기 서팩틴의 생산방법에서, 상기 (b) 단계에서 서팩틴이 분비 및 생산된 액체배지를 원심분리 하여 서팩틴을 포함한 침전물을 생성하고, 이로부터 서팩틴을 수득할 수 있다. 침전물은 서팩틴을 포함하고 있으므로, 침전물로부터 정제하여 수득한 서팩틴과 동일한 세정효과, 향균 및 항진균 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 서팩틴의 생산방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 콜로니가 접종된 액체배지에 거품을 발생시키고, 발생된 거품으로부터 서팩틴을 수득하는 방법을 이용하여 서팩틴을 생산할 수 있다.
본 발명의 서팩틴의 생산방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 25℃ 내지 42℃에서 24시간 내지 48시간 동안 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양 온도가 25℃ 미만일 경우 균주의 자라는 속도가 느려지는 문제점이 발생할 수 있고, 배양 온도가 42℃ 초과할 경우 균주가 자라지 않는 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 배양 시간이 24시간 미만일 경우 콜로니가 충분히 자라지 않는 문제점이 발생할 수 있고, 48시간 초과할 경우 균주들의 콜로니가 서로 뭉쳐 플레이트를 완전히 덮고 균주가 늙어지는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명의 서팩틴의 생산방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 25℃ 내지 42℃에서 45시간 내지 72시간 동안 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양 온도가 25℃ 미만일 경우 균주가 충분히 자라지 않아 서팩틴 생산량이 감소하는 문제점이 발생할 수 있고, 배양 온도가 42℃ 초과할 경우 균주의 성장이 멈추는 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 배양 시간이 45시간 미만일 경우 배양액에 포함된 영양분을 충분히 이용하지 못하므로 서팩틴 생산율이 감소하는 문제점이 발생할 수 있고, 72시간 초과할 경우 서팩틴 생산량은 증가하지 않는데 시간과 전력을 낭비하는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명의 서팩틴의 생산방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 액체배지는 수크로오스(Sucrose), 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(peptone), 제2인산칼륨(K2HPO4), 염화나트륨(NaCl), 탄산나트륨(Na2CO3), 황산마그네슘(MgSO4) 및 황산철(FeSO4)을 포함하는 것을 특징으로 하며, 탄소원인 수크로오스 대신 포도당(Glucose)를 사용할 수 있으며, 질소원으로서 펩톤 대신 암모늄을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP 균주 또는 이의 배양액을 유효성분로 포함하는 기능성 천연 세제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주 배양액의 세척 효능 확인한 결과, 동물성 기름, 주방 때를 일반 주방세제로 세척한 경우에는 오염물질이 깨끗이 세척되지 않은데 반해 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주 배양액으로 세척한 경우에는 오염물질이 깨끗하게 세척된 것을 확인할 수 있다(실시예 11 및 도 6 참조). 이러한 결과는, 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주 및 배양액은 기능성 천연 세제 조성물로서 적합함을 보여준다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP 균주 또는 이의 배양액을 유효성분로 포함하는 태양광 패널 세정용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP 균주 및 균주 배양액은 천연 세제로서 우수한 효과를 나타내며, 식물의 성장을 억제하지 않을 뿐만 아니라 오히려 항균 및 항진균 효과를 나타내어 유해균의 성장을 억제할 수 있으므로, 환경 오염 가능성이 낮고 세척력이 우수하며 식물에 유용하므로, 농업 친화적인 태양광 패널 세정용 조성물로서 적합하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주 배양액은 다양한 식물 유해균의 성장을 억제하는 효과를 나타냈으며, 이러한 결과는 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주 및 균주 배양액 항균 및 항진균용 조성물로서 적합함을 시사한다(실시예 12, 도 7 및 도 8 참조).
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 신규 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP 균주는 서팩틴 생산능이 우수하므로, 종래에 서팩틴을 생산하는 고초균 보다 많은 양의 서팩틴을 생산할 수 있으며, 이에 따라 식물의 병을 일으키는 미생물들의 성장을 억제하는 성능이 우수하며, 세정능이 우수하면서도 경제적인 측면에서 바람직한 친환경·친농경 세제를 제조할 수 있다.
도 1은 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP의 계통수를 나타낸다.
도 2 및 도 3은 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP 전장 유전체를 다른 미생물들의 전장 유전체를 비교 분석한 도면이다.
도 4은 서팩틴과 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP가 LB agar 배지위에서 자라는 콜로니의 모습이다.
도 5는 표준 서팩틴과 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP에 의해 생산된 서팩틴을 비교 분석한 것이다.
도 6는 서팩틴과 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP 배양액의 세척능을 확인한 결과이다.
도 7 및 도 8은 서팩틴과 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP 배양액의 항균 및 항진균 효과를 확인한 결과이다.
도 2 및 도 3은 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP 전장 유전체를 다른 미생물들의 전장 유전체를 비교 분석한 도면이다.
도 4은 서팩틴과 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP가 LB agar 배지위에서 자라는 콜로니의 모습이다.
도 5는 표준 서팩틴과 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP에 의해 생산된 서팩틴을 비교 분석한 것이다.
도 6는 서팩틴과 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP 배양액의 세척능을 확인한 결과이다.
도 7 및 도 8은 서팩틴과 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP 배양액의 항균 및 항진균 효과를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 미생물의 분리
장수풍뎅이 유충의 장내세균을 분리하기 위하여 제 3령 유충의 분변을 채취하였다. 유충은 전라남도 곡성군 입면에서 채집하였으며 유충을 발효한 톱밥을 먹이로 공급하면서 유지하였다. 이렇게 사육하면서 생산된 분변을 증류수에 희석하여 LB agar 배지 플레이트에 펴고 섭씨 30℃에서 24시간 배양하였다. 배양을 마친 배지 위에는 100개 이상의 상이한 박테리아들이 나타났으며, 이들을 개별적으로 분리하여 새로운 플레이트에 접종하여 순수 분리하였다.
실시예 2:
서팩틴을 생산하는 신규한 바실러스 벨레젠시스 균주의 분리
엘렌메이어 플라스크에 상기 실시예 1에서 분리한 각 균주를 접종하고 교반기 위에서 200rpm 속도로 흔들면서 섭씨 30℃를 유지하면서 48시간에서 72시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 미생물을 제거하고 남은 배양액을 drop-collapse 방법으로 테스트하였다. 초기 발견용 drop-collapse 테스트에서는 많은 균주들을 실험하기 위해 원심분리 후에 상층액에 남은 배양액을 그대로 사용하였다. 반면에, 추가적으로 확인하는 실험에서는 상층에 남은 배양액을 0.45마이크로미터 필터를 통과하여 균주와 균주 찌꺼기를 완전히 제거하였다.
다음 단계로, 기름을 발라 놓은 96웰 플레이트의 각 웰에 미생물 배양액을 한 방울 떨어뜨렸다 계면활성제가 포함되지 않은 배양액은 수성으로 기름 위에 물방울형태로 남아 있으나 계면활성제가 포함된 배양액은 기름과 석여 물방울이 사라진다. 상기와 같은 실험을 통하여 기름으로 형성된 막 위에서 배양액 물방울이 기름과 잘 섞이도록 하는 균주들을 선발했다.
1차적으로 선발된 미생물들 중에서 검정 실험을 통하여 배양한 액체의 유화능력이 가장 탁월한 균주를 선별하였다. 이 실험에서는 초기 발견실험에 미네랄오일을 사용하였으며 추가적으로 확인 검증하는 실험에서는 미네랄오일과 콩기름을 사용하였다. 96웰 플레이트의 직경은 8mm이며 깊이는 30mm이다. 각 웰에는 7ul의 오일을 넣고 24시간 실온에 보관하였다. 그 후에 배양액 20ul를 주사바늘을 통하여 조심스럽게 각 웰에 떨어뜨렸다. 컨트롤 실험으로 배양액 대신 증류수를 사용하였다. 배양액을 넣어주고 1분이 경과한 후 배양액 방울이 변하는 정도를 눈으로 가늠하였다. 모든 실험은 최소한 3회 반복하였다.
실시예 3: 신규한 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 동정
상기 실시예 2에서 선별된 균주는 콜로니 형태와 자라는 모습이 고초균으로 추정되었으며, 분자생물학적인 방법으로 동정하기 위해 16S rDNA의 1600개 핵산의 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 결정하기 위하여 균주를 LB agar 플레이트에서 24시간 배양하였다. 배양된 콜로니를 엘리쿼트에 넣고 증류수로 씻은 후 95℃에서 15분간 열처리한 후 원심분리하여 세포찌꺼기를 제거하고 상층액을 PCR 용 템플레이트 DNA로 사용하였다. PCR 증폭을 위해 TAKARA Bacteial 16S rDNA PCR kit를 매뉴얼에 기록된 대로 사용하였다. 간단히 서술하면 타카라 폴리머레이즈로 94℃에서 1분 denaturation이후 94℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 1분 동안 30 사이클 증폭하였으며 마지막으로 72℃에서 3분간 연장반응을 시행했다. 증폭된 16S rDNA는 1% 아가로스겔에서 전기영동으로 확인했으며 PCR purification kit로 DNA를 정제하여 바로 시컨싱 템플레이트로 이용하였다. 앞쪽 프라이머 27F (5'-AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3'), 뒤쪽 프라이머 515R (5'-TTA CCG CGG CKG CTG GCA C-3')를 이용하여 증폭해도 유사한 결과였다. 시컨싱은 키트에 포함된 프라이머들을 사용하였다. 상기 핵산 염기서열을 이용하여 계통수를 만들고 계통수 위에서 IM1 균주의 위치를 확인했다.
서열번호 1(바실러스 벨레젠시스 IM1의 16S rDNA 핵산 염기 서열) |
gtagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccggGaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggctTcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccAaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcCcagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaataggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgCccgcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctCgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaActggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtaGagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagCgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgggtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgt |
실시예 4: 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 전장 유전체 염기서열 해독
균주를 LB broth 에서 24시간 배양한 후 균주의 DNA를 일반적으로 사용하는 대장균 DNA 정제 방법을 이용하여 분리하였다. 간단히 균주를 키운 배양액 1.5ml을 원심분리 방법으로 모았다. 이 균주 펠렛에 600ul 라이시스 버퍼 (9.34 ml TE buffer, 600 ul of 10% SDS 60 μl of proteinase K (20 mg/ml in 10ml water)를 넣고 잘 섞었다. 1시간 동안 37℃에서 숙성한 후 페놀클로로폼으로 DNA를 추출하였다. 이렇게 추출된 DNA는 마크로젠에서 PacBio와 Illumina의 bacterial genome sequencing kits의 프로토콜을 따라서 라이브러리를 만들고 만들어진 라이브러리를 시컨싱하였다. 더 명확하게 균주를 동정하기 위하여 전장유전체를 PacBio 방법으로 200번, Illumina 방법으로 1000번 염기서열을 읽은 후 알려진 알고리듬 (Koren et al., 2013)을 사용하여 전장유전체의 지도를 완성하였다. 전장유전체의 지도는 NCBI의 GenomeProject database"에 등록(GenBank CP041784)하였다.
실시예 5: 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 계통수 설립
IM1 균주의 전장유전체 안에는 16S rDNA가 200여 회 반복되어 있었으며, 이들의 염기서열은 9가지로 구별되었다. IM1 외 타 바실러스 균주들의 게놈에 들어있는 rDNA의 시컨스 정보를 NCBI database에서 추출하였다. 타 균주들도 염기서열이 다른 rDNA를 몇 종류씩 보유하고 있으며 염기서열이 다른 시퀀스들을 모두 포함하였다. IM1에 들어 있는 9가지 염기서열을 포함하는 고초균들의 rDNA의 시컨스들을 MEGA software를 이용하여 align하고 계통수를 만들었다(Kumar et al., 2018).
그 결과, IM1에 들어있는 9가지 rDNA는 계통수상에서 4 그룹으로 나뉘어 지며, 이들은 B. velezensis FZB42 균주와 B. velezensis M75 균주들과 섞여서 나타났다 (도 1). Bacillus velegensis 3가지 균주는 서로 뚜렷이 구별되며 다르지만 이 세 균주 사이의 관계를 명확히 정의할 수 없었다. 구체적으로, 도 1의 (a)와 같이 IM1 균주의 전장유전체에 들어 있는 9가지 rDNA 염기서열과 다른 균주에서의 선정한 다수 염기서열을 포함하여 제작된 계통수를 보면 IM1 균주가 M75 균주와 가까운 경우도 있고 FZB42와 더 가까운 경우도 있다. 도 1의 (b)와 같이 IM1과 B. velezensis 다른 두 균주의 관계를 더 잘 보여주기 위해 단순화한 계통수를 보면 이 세 균주들의 관계가 명확하게 구분되지 않는 다는 사실을 쉽게 확인할 수 있다 (괄호안의 숫자는 rDNA개수를 의미함).
그 다음, 도 1의 (c)와 같이 상동 단백질 유전자 185개를 이용하여 계통수를 제작하였으며, 고초균을 대표하는 몇 종의 균주를 선별하여 MEGA software를 이용하여 align하고 계통수를 만들었다(Kumar et al., 2018). 구체적으로 전장유전체에 저장된 모든 단백질들의 아미노산 서열을 다른 바실러스 균주들과 BLAST tool로 비교하여 1) 아미노산 서열이 전체 단백질 길이의 80% 이상 영역이 비슷하며, 2) 이 영역안에 아미노산들이 80% 이상 동일하며, 3) 전장유전체 지도가 가용한 7개 균주와 IM1 균주에 모두 존재하는 185개 유전자를 모두 이용하여 MEGA 프로그램으로 계통수를 재구성하였다.
그 결과, 단백질 유전자 185개를 모아서 만든 계통수에서도 도 1의 (c)에서 확인할 수 있듯이 IM1 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스를 포함한 다른 고초균들보다 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)와 가장 가까운 것으로 나타났다.
실시예 6: 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 생화학적 특성
8 균주들의 전장유전체에 들어있는 유전정보들을 분석을 통해 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 G+C 함량, IM1균주와 동일한 단백질의 수, 리보솜RNA 오페론의 수, t-RNA를 확인하였다. 전장유전체의 G+C 함량은 전장유전체를 어셀블할 때 사용한 알고리듬(Koren et al., 2013)을 사용하여 계산하였으며, 단백질에 대한 정보를 담은 유전자들은 GeneMark.HMM(Besemer et al., 2001) 패키지를 이용하여 4,558개 유전자를 예측하였다. 전장유전체에 산재되어 있는 tRNA는 tRNA-Scan (Schattner et al., 2005)이라는 패키지를 사용하여 발굴하였는데 총 86개가 있는 것으로 확인되었다. 라이보소옴 RNA는 RNAmmer(Lagesen et al., 2007)로 발굴하였으며 총 27 로 확인되었다 (표 2). 그 결과, 하기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 전장유전체의 길이, G+C 함량, IM1균주와 동일한 단백질의 수, 리보솜RNA 오페론의 수, t-RNA 수 모두 IM1 균주는 타 고초균들 보다 바실러스 벨레젠시스와 가장 유사한 것으로 확인되었다.
전장유전체 길이 = Genome size (bp), G+C 함량 (%) = G+C content (%), 단백질 유전자 수 = number of protein-coding sequences (CDS), IM1 유전자와 상동유전자수 = Number of CDS shared with IM1, 자신에게만 있는 유전자수 = unique CDS, not shared with IM1
실시예 7: 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 macro and micro synteny의 비교
서팩틴 생산에 관한 연구에 가장 많이 사용하는 B. subtilis 및 B. velezensis 와 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1 유전자들이 전장유전체에 배치된 유전자들의 상대적인 순서(macro and micro synteny)를 비교하였다.
전장유전체의 구성을 분석하는 과정을 간단히 서술하면 전장유전체를 COG database(http://clovr.org/docs/clusters-of-orthologous-groups-cogs/)에 BLASTp 를 수행하였다. 이때 cellular processes and signaling, information storage and processing, metabolism 와 같이 3종류의 주 그룹으로 나누었다. 또 7종의 바실러스 유전체와 비교하여 orthologous 유전자들을 찾을 때 BLASTp를 사용하였으며 e-value < 1e-5, coverage > 60%, identity > 50% 조건이 맞을 경우 orthologous로 간주하였다.
마이크로 및 매크로 신테니를 조사하기 위해 전장유전체를 바로 옆에 배열하여 비교할 때 전장유전체 여러 개를 동시에 배열하여 비교할 수 있는 프로그램인 Multiple genome alignment (Mauve) tool(Darling et al., 2004)을 이용하였다. 이 프로그램은 짧은 삭제 및 삽입 (indel), 지엽적인 전좌 현상(local genomic translocations), 역위(inversions) 등을 나타내 준다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1 은 B. velezensis 와 유사하지만 B. subtilis 와는 매우 다른 것을 확인하였다.
또한, 서팩틴을 생산하는 B. amyloliquefaciens 균주들 중에서 중국에서 발견된 MT45, 고초균 연구에 많이 사용되는 DSM7T, 두 아종의 B. velezensis와 전장유전체의 지도를 비교하면서 유전자 배열순서 (macro and micro synteny)를 비교하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1은 유전자의 배열 순서가 B. amyloliquefaciens 보다 B. velezensis 와 더 비슷한 것을 확인하였다.
아홉 가지로 다른 서열을 보이는 rDNA의 계통수와 단백질 유전자 185개를 모두 이용하여 만든 계통수, 전장유전체의 구성, 유전자 수를 포함한 생화학적 특성, 전장유전체에 배치된 유전자들의 상대적인 순서 (macro and micro synteny) 모두 일관되게 IM1 균주는 B. velezensis 종으로 확인되었다.
실시예 8: 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 형태학적 특성
LB agar 플레이트에서 자란 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 콜로니는 외형적으로 보았을 때(도 4) 동그란 형태로 도움을 형성하며 두 개 이상 콜로니들이 쉽게 합쳐지며, 콜로니 수가 많을 경우에는 플레이트 전체를 고르게 덮는다. 잘 분리된 콜로니들은 납작한 도움을 형성하며 불투명하고 콜로니 주위가 거칠고 작은 톱니바퀴처럼 성장한다.
현미경으로 관찰하였을 때에는 막대형 세포이며, 영양분 부족과 같은 생육환경이 나빠지면 스포어를 형성한다.
실시예 9: 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 서팩틴 생산 확인 (1)
바실러스 벨레젠시스 IM1 균주는 엘비 고체배지(LB agar)에 접종하여 25~37℃ 배양기 안에서 24~48시간 배양하여 바로 액체 배양액에 접종하거나, 4℃에 1달까지 보관하면서 사용한다. 고체배지에서 적당히 자란 콜로니 하나를 하기 표 3의 다섯 가지 액체배지에 접종하여 진탕배양기 안에서 30℃를 유지하며 180-240rpm으로 흔들면서 48시간 동안 배양한다.
액체배양액에 균주를 비교적 정확한 양으로 접종하려면 정량적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 콜로니를 멸균수에 풀어 준 다음 스펙트로 포토메터 (UV-vis Spectrophotometer, Mecasys, Korea)를 이용하여 600nm의 흡광분도 (OD600nm) 0.8~1.5로 희석하여 50ml 배지에 1ml을 접종하는 것과 비슷하다. 균주를 더 접종해도 되며, 서팩틴 생산량은 접종양에 크게 영향을 받지 않는다.
구체적으로, IM1 균주는 250ml 엘렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 50ml 배지를 넣고 진탕 배양기 안에서 30℃를 유지하며 250rpm으로 흔들면서 48시간 배양하였다. 배양이 끝나면 배양액을 깨끗한 튜브에 옮기고 8,000g에서 10분동안 원심분리하고 30ml상등액을 깨끗한 튜브에 옮겼다. 상등액에 6M HCL을 넣어 pH 2.0으로 보정한 후 4℃에서 ~16시간 숙성한 후 12,000g에서 30분 동안 원심분리 하였다. 상등액을 버리고 농축된 남은 침전물을 정제되지 않은 서팩틴이라 한다. 농축된 서팩틴 침전물 중 0.1g을 10ml 100% 메탄올에 녹였다. 서팩틴 성분을 LC-MS 방법을 이용하여 분석하였다. 서팩틴의 양은 HPLC 또는 LC/MS-MS를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
배지 1 | 배지 2 | 배지 3 | 배지 4 | 배지5 | |
Sucrose | - | 15g | - | 15g | |
Glucose | 6g | - | 6g | - | 40 |
Yeast extract | 8g | 8g | 5g | 5g | 5 |
peptone | - | - | 10g | 10g | 10 |
K2HPO4 | 2.5g | 2.5g | 2.5g | 2.5g | 2.5g |
NaCl | 1.5g | 1.5g | 1.5g | 1.5g | 1.5g |
Na2CO3 | 0.5g | 0.5g | 0.5g | 0.5g | 0.5g |
MgSO4 | 1g | 1g | 1g | 1g | 1g |
서팩틴 생산량 (g/l로 환산) | <0.1g | <0.1g | 0.2 g | 0.2 g | 2.0g |
그 결과, 표 3에서 확인할 수 있듯이 5번 배지를 이용하였을 때, 서팩틴의 생산량이 ~2.0g으로 가장 높은 것을 확인하였다. 이러한 결과는 바실러스 벨레젠시스들 중 서팩틴을 생산하는 것으로 알려진 균주(Jakinala et al., 2019)가 리터당 0.83g 서팩틴을 생산하는 것과 비교하였을 때 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP는 리터당 2g의 설팰틴을 생산하므로, 바실러스 벨레젠시스 표준 균주보다 서팩틴 생산능이 2배 이상 높아 서팩틴의 생산능이 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 10: 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주의 서팩틴 생산 확인 (2)
IM1 균주는 2 litter 엘렌마이어 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 500ml 5번 배지를 넣고 진탕 배양기 안에서 30℃를 유지하며 250rpm으로 흔들면서 60시간 배양하였다. 배양이 끝나면 배양액을 고속회전용 병에 옮겨 8,000g에서 10분동안 원심분리 하였다. 상등액을 깨끗한 튜브에 옮긴 후 상등액에 6M HCL을 넣어 pH 2.0으로 보정하였다. pH를 보정한 상등액을 4℃에서 ~16시간 숙성한 후 12,000g에서 30분 동안 원심분리 하였다. 2차 상등액을 버리고 남은 농축된 서팩틴 침전물 중 0.1g을 10ml 100% 메탄올에 녹였다. 서팩틴 성분을 LC-MS 방법을 이용하여 분석하고 서팩틴의 양은 HPLC혹은 LC/MS-MS를 이용하여 분석하였다. 농축된 서팩틴 침전물 중 0.1g을 10ml 100% 메탄올에 녹인 후 서팩틴 성분을 LC-MS 방법을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이 시그마 알드리히에서 구입한 표준 서팩틴(standard surfactin)과 바실러스 벨레젠시스 IM1에 의해 생선된 서팩틴을 비교하였을 때, 바실러스 벨레젠시스 IM1에 의해 생선된 서팩틴은 다른 고초균인 B. subtillis가 생산하는 서팩틴과 비슷하게 분자량이 14씩 증가하여 CH2가 하나씩 증가하는 양상을 보였다. 특이한 점은 B. subtillis가 생산한 서팩틴 분자들에 비하여 지질꼬리가 긴 분자들이 짧은 분자들보다 상대적으로 많이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이 현상으로 보아 벨레젠시스는 서브틸리스와 서팩틴 생산하는 기작에 미묘한 차이를 나타낼 수 있음을 유추할 수 있다.
실시예 11: 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주 배양액의 세척 효능 확인
동물성 기름에 대한 유화능 및 세척력을 조사하기 위하여 삼겹살 기름을 사용하였다. 구체적으로, 삼겹살을 프라이팬에 올려 기름을 유출하고, 유출된 기름이 하얗게 응고될 때까지 기다렸다가 열을 가하여 다시 녹였다. 이렇게 녹인 기름에 0.003% 서팩틴을 포함하고 있는 배양액 침전물을 기름과 동일한 양을 넣고 흔들어 섞은 후 미지근한 물을 흘려 보냈다. 대조군으로는 일반 주방세제 중에서 슈거버블을 원액 혹은 5배 희석하여 이용하였다. 그 결과, 주방세제 원액은 유동성이 낮아 처음부터 기름과 섞이지 않았으며 5배 희석한 세제는 상당히 잘 섞였다. 미지근한 물을 흘리면 거품이 많이 발생하며 기름이 함께 흘러내렸다. 그러나 기름이 팬에 남아 있어 시간이 지난 후 기름이 하얀색 점으로 변했다. 이에 비해, 희석한 배양액 침전물은 기름과 쉽게 섞였으며, 미지근한 물을 흘리거나 뜨거운 물을 넣고 흔들어도 거품이 발생하지 않았다. 더욱이, 수도물을 연속적으로 흘리면 기름은 물과 함께 흘러내려 팬에 남지 않았다. 도 6a 에서 확인할 수 있듯이 팬을 말려도 기름 흔적이 전혀 나타나지 않고 깨끗하게 세척되었다. 즉, 동물성 기름, 주방 때를 일반 주방세제로 세척한 경우에는 오염물질이 모두 세척되지 않은데 반해 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주 배양액과 뜨겁거나 미지근한 물을 부어 세척한 경우에는 오염물질이 깨끗하게 세척된 것을 확인할 수 있다.
다음으로, 스테인레스 스틸에 붙어있는 제거하기 어려운 때를 세척하는 능력을 두 가지 대상을 이용하여 시험하였다. 첫번째 대상으로 유리로 만들어진 냄비의 뚜껑가장자리를 끝마무리한 스틸을 사용했다. 대조군 실험으로 거친 스폰지에 슈거버블 주방세제를 듬뿍 묻혀 가장자리를 닦으면 거의 세척이 되지 않아 갈색때가 남아 있다. 이에 반해, 도 6b에서 확인할 수 있듯이 주방세제 대신 본 발명에 따른 희석된 배양액 침전물을 스폰지에 적셔 뚜껑 끝을 닦으면 몇 년 동안 사용하면서 쌓이고 열처리된 때가 깨끗하게 세척되었다. 비슷한 실험을 뚜껑 손잡이를 연결하는 부위에 사용된 스틸에 붙은 찌든 때에 적용하여도 도 6c에서 보는 바와 같이 뛰어난 세척효과 효과를 보인다.
페인트나 때가 열처리되면 처리전보다 안정화되어 제거하기 어렵게 된다. 냄비에 있는 스테인을 희석된 배양액이 제거하는 것으로 보아 상당히 안정화된 때를 세척하는 효능이 있는 것으로 보였다. 이 효능을 추가적으로 시험하기 위하여 가스레인지에 싸인 때를 제거하는 실험을 했다. 일반 주방세제를 많이 사용하여 닦아도 닦이지 않는 제거하기 힘든 때였다. 그 결과, 도 6d에서 보는 바와 같이 희석된 배양액을 스폰지에 묻혀 닦으면 까맣게 변했던 열에 장시간 반복적으로 노출된 때가 세척되었다. 유의할 점은 때가 희석된 배양액 침전물에 녹아 나오지는 않았으며 반드시 스폰지를 문질러야 때가 세척되었다.
마지막으로 유리에 붙어있는 때(stain)를 세척하는 능력을 실험적으로 검증하였다. 그 결과, 도 6e에서 보는 바와 같이 유리에 싸인 제거하기 힘든 때도 본원발명에 따른 배양액 희석액에 쉽게 제거되었다.
실시예 12: 바실러스 벨레젠시스 IM1 균주 배양액의 식물 보호 효과
바실러스 벨레젠시스의 식물보호 효능을 식물에 병을 일으키는 5 종류의 진균들(R. solani, F. oxysporum, P. capsici, B. cinerea, C. gioeosporioides)을 아가플레이트에서 배양하여 시험하였다. 감자포도당아가(PDA, Potato dextrose agar) 위에서 배양한 진균들의 일부를 새로 만든 고체배지 중심에 접종하였다. 접종된 진균들은 하루 동안 배지 위에서 자라게 한 다음 본 발명의 신규 미생물 IM1을 배양했던 배지(표 2의 3번 배지) 10㎕를 고체배지 외곽에 떨어뜨렸다. 25℃ 정체 배양기에서 3일까지 배양하면서 진균 콜로니가 자라는 모습을 통해 진균들의 성장에 미치는 영향을 각각 조사하였다. 그 결과, 도 7에서 확인할 수 있듯이 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 IM1은 테스트에 사용한 모든 진균들이 자라지 못하도록 하는 항진균 활성을 보였다.
다음으로, 바실러스 벨리젠시스가 발효하는 동안 생산된 산물이 식물병에 미치는 영향을 확인하였다. 특히, 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides) 및 마그나포르테 포아(Magnaporthe poae)에 대한 영향을 조사하였다. 48시간 배양한 배양액(표 2의 5번 배양액)을 원심분리방법으로 균주를 제거하고 염산을 이용하여 서팩틴과 부수 단백질들을 침전시켰다. 친전물에는 약 10% 서팩틴이 포함되어 있었다. 배양액 친전물을 서팩틴의 농도가 1, 10, 100ppm이 되도록 증류수에 희석하여 아가플이이트를 만들었다. 이 플레이트 위에 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides) 및 마그나포르테 포아(Magnaporthe poae)를 접종하여 그들의 성장을 관찰하였다.
그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이, 골프장 잔디에 병을 일으키는 마그나포르테 포아는 서팩틴의 함량이 1ppm(0.0001%)일 때 64%, 10ppm (0.001%)일 때 73% 억제되었다. 또한, 곡물 식물, 잔디, 콩과식물, 채소식물, 다년생식물과 나무 등에 탄저병을 일으키는 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스의 성장은 10ppm 농도에서 22%, 100ppm농도에서 57% 억제되었다.
<110> ProxEnrem
<120> NOVEL BACILLUS VELEZENSIS PRODUCING SURFACTIN AND USE OF THE SAME
<130> P19-0146
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 937
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bacillus velezensis IM1 KACC81099BP
<400> 1
gtagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 60
ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtc tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 120
cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 180
caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 240
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 300
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 360
agaacaagtg ccgttcaaat aggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 420
aactacgtgc ccgcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 480
cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 540
agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 600
cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 660
actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 720
gccgtaaacg atgggtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 780
cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 840
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 900
gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgt 937
Claims (9)
- 서팩틴(sulfactin)을 생산하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP.
- 제1항에 있어서,
서열번호 1에 기재된 염기서열을 갖는 16S rDNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP.
- 다음 단계를 포함하는 서팩틴의 생산방법:
(a) 제1항의 바실러스 벨레젠시스 IM1 KACC81099BP를 고체배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 단계; 및
(b) 상기 콜로니를 액체배지에 접종하여 서팩틴을 분비 및 생성하여 서팩틴을 수득하는 단계.
- 제3항에 있어서,
상기 (a) 단계는 25℃ 내지 37℃에서 24시간 내지 48시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 서팩틴의 생산방법.
- 제3항에 있어서,
상기 (b) 단계는 28℃ 내지 42℃에서 45시간 내지 60시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 서팩틴의 생산방법.
- 제3항에 있어서,
상기 (b) 단계의 액체배지는 수크로오스(Sucrose), 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(peptone), 제2인산칼륨(K2HPO4), 염화나트륨(NaCl), 탄산나트륨(Na2CO3), 황산마그네슘(MgSO4) 및 황산철 (FeSO4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 서팩틴의 생산방법.
- 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP 균주 또는 이의 배양액을 유효성분로 포함하는 기능성 천연 세제 조성물.
- 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP 균주 또는 이의 배양액을 유효성분로 포함하는 태양광 패널 세정용 조성물.
- 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) IM1 KACC81099BP 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 조성물.
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