KR101785619B1 - degU의 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents
degU의 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주, 및 이를 포함하는 항균조성물에 관한 것으로, degU의 단일 염기가 변이된 바실러스 속 균주는 그람양성 세균 및 곰팡이에 대하여 야생형에 비하여 현저한 항균 효과가 있으므로 식물 작물용 항균제, 항균 활성을 갖는 발효 식품을 포함한 식품, 및 미생물 감염 질환의 예방, 개선, 치료를 위한 사료, 건강기능식품, 의약외품, 의약품으로 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 degU의 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주, 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 변이된 단백질을 포함하는 항균활성을 가지는 균주의 제조방법에 관한 것이다.
바실러스 균은 포자를 형성하는 그람양성 세균으로써 서브틸린 (subtilin), 서브란신 (sublancin), 설팩틴 (surfactin), 펜지신 (fengycin), 바실라엔 (Bacillaene) 등 다양한 항균물질을 생산하고 있다 (Stein T. 2005. Mol. Microbiol. 56:845-857). 또한, 바실러스 포자는 열, pH, 유기용매, 건조 등 외부환경에 매우 안정한 특성을 가지고 있다. 이러한 특성들은 바실러스 균을 식물 병원균 방제를 위한 미생물제제로 개발하는데 장점으로 작용하고 있으며 시중에서 판매되는 식물병원균 방제용 미생물 제제는 대부분 바실러스 균을 포함하고 있다. 이러한 미생물제제는 환경친화적이기 때문에 생태계 보호를 위해서는 기존의 화학 농약을 대체하는 것이 바람직하다. 그러나 미생물제제는 기존의 화학 농약에 비해 상대적으로 활성이 약하고 고가이기 때문에 널리 쓰이는데 한계로 작용하고 있다. 따라서 항균활성이 증가되어 성능이 향상된 바실러스로 만든 미생물제제는 환경친화적인 생물 농약의 확대 보급에 긍정적인 영향을 미칠 것이다.
바실러스의 주요 항균물질은 NRPS (nonribosomal peptide synthetase) 또는 PKS (polyketide synthase)와 같은 거대 효소에 의해 생성되는데 일반적으로 이들 효소를 코딩하는 항생제 생합성 유전자들은 염색체 내의 한곳에 몰려있어 클러스터를 이루고 있다 (Stein T. 2005. Mol. Microbiol. 56:845-857). 따라서, 항생제 생합성 유전자의 발현을 증대시키면 항생제 생합성 효소의 양이 증가하여 항생제 생산성이 늘어남을 기대할 수 있다.
특정 유전자의 발현을 조절하는 것은 강력한 프로모터를 도입하거나, 특정유전자의 발현을 증대시키는 조절유전자의 발현을 증대시키거나 특정유전자의 발현을 억제하는 조절유전자의 발현을 억제하는 방법을 시도해볼 수 있다. 이러한 방법들은 일반적으로 항생제 내성 유전자를 포함한 외래 DNA의 도입을 수반한다. 그러나, 이러한 외래 DNA가 도입된 재조합미생물은 환경에 적용하기에 적합하지 않다. 따라서 농업용 미생물 균주 개량에는 외래 DNA가 도입되지 않은 친환경적인 방법이 필요하다.
이와 관련된 선행문헌으로서 한국공개특허 제10-2013-0008673호는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) GYL4가 생성하는 항균 물질인 바실로마이신 D1이 식물병원성 진균에 대하여 광범위한 활성이 있음을 기재하고 있다.
또한, 한국등록특허 제10-1574575호는 변이 균주를 제조하는 방법을 이용하여 외부로부터 도입된 다양한 유전자를 세포내에 잔류시키지 않는 친환경적인 변이균주를 제작할 수 있음을 기재하고 있다.
그러나 바실로마이신 D1은 식물병원성 진균에 대한 항균 활성만이 보고되어 있으며, 상기 변이 균주를 제조하는 방법은 친환경적인 변이균주를 제작할 수 있을 뿐, 이를 항균활성이 높아진 변이 균주제작에 이용하는 것으로 보고된 바가 없다. 또한 상기 선행문헌으로는 특정 유전자의 변이가 항생물질 생산을 현저히 증대시킨다는 사실을 예상하기 어렵다.
이에 본 발명자들은, 항균활성이 높아진 바실러스 균주를 제작하고자 예의 연구 노력한 결과, 어떠한 외래 DNA의 도입 없이 친환경적인 방법으로 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘(Histidine)이 류신(Leucine)으로 변이된 바실러스 속 균주를 제작하였을 뿐만 아니라, 상기 변이된 균주가 식물병원성 그람양성 세균과 곰팡이 모두에서 항균 활성이 높음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 항균 활성을 가지는 바실러스 속 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 목적 균주에 목적 유전자를 포함하는 도입벡터와 상기 목적 유전자의 도입 여부를 확인할 수 있게 하는 헬퍼 플라스미드를 도입하여 변이 균주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다. 균주의 상태는 액상상태 또는 건조상태일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 변이된 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "degU"는 바실러스 속에서 전이 성장 단계에서 중요한 역할을 하는 조절 인자 중 하나이다. 상기 degU는 DNA 흡수와 관련된 중성, 알칼리 프로테아제 형성, 편모 형성, 바이오필름 형성 및 DNA 흡수에 관련된 효소의 생산을 포함하는 다양한 세포 기능의 발현의 조절에 관여한다. 즉, 다양한 유전자의 발현을 긍정적으로 또는 부정적으로 조절한다. 특히 포스페이트 (P)가 결합된 DegU (DegU-P)는 세포외로 분비되는 효소의 발현에 필요한 것으로 알려져 있다. 본 발명에 사용된 degU 서열은 5'-GTGACTAAAGTAAACATTGTTATTATCGACGACCATCAGTTATT TCGTGAAGGTGTTAAACGGATATTGGATTTTGAACCTACCTTTGAAGTGGTAGCCGAAGGTGATGACGGGGACGAAGCGGCTCGTATTGTTGAGCACTATCATCCTGATGTTGTGATCATGGATATCAATATGCCAAACGTAAATGGTGTGGAAGCTACAAAACAGCTTGTAGAGCTGTATCCTGAATCTAAAGTAATTATTCTATCAATTCACGATGACGAAAATTATGTAACACATGCCCTGAAAACAGGTGCAAGAGGTTATCTGCTGAAAGAGATGGATGCTGATACATTAATTGAAGCGGTTAAAGTAGTGGCTGAGGGCGGATCTTACCTCCATCCGAAGGTTACTCACAACCTCGTTAACGAATTCCGCCGCCTTGCAACAAGCGGAGTTTCTGCACACCCTCAACATGAGGTTTACCCTGAAATCCGCAGACCATTACATATTTTAACTAGGCGGGAATGTGAAGTGCTGCAGATGCTTGCAGACGGAAAAAGCAACCGCGGTATTGGTGAATCATTGTTTATCAGTGAGAAAACCGTTAAAAACCATGTCAGCAATATTTTACAAAAAATGAATGTAAACGACCGGACGCAAGCCGTTGTGGTCGCCATTAAAAATGGCTGGGTAGAAATGAGATAG-3'(서열번호 1)이다.
상기 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 변이된 단백질은 그 예로 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 각 단백질은 상기 각 서열번호로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
아울러, 본 발명의 상기 각 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 각 서열번호로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬 (align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본 발명의 용어 "degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질"은 조절인자 degU의 변이체로서, 본 발명자들은 상기 변이체를 포함하는 균주는 증진된 항균활성을 가지는 것을 확인하였다.
상기 변이 단백질은 MTKVNIVIIDDLQLFREGVKRILDFEPTFEVVAEGDDGDEAARIVEH YHPDVVIMDINMPNVNGVEATKQLVELYPESKVIILSIHDDENYVTHALKTGARGYLLKEMDADTLIEAVKVVAEGGSYLHPKVTHNLVNEFRRLATSGVSAHPQHEVYPEIRRPLHILTRRECEVLQMLADGKSNRGIGESLFISEKTVKNHVSNILQKMNVNDRTQAVVVAIKNGWVEMR(서열번호 13)의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 변이 단백질을 코딩하는 염기서열은 5'-GTGACTAAAGTAAACATTGTTATTAT CGACGACCTTCAGTTATTTCGTGAAGGTGTTAAACGGATATTGGATTTTGAACCTACCTTTGAAGTGGTAGCCGAAGGTGATGACGGGGACGAAGCGGCTCGTATTGTTGAGCACTATCATCCTGATGTTGTGATCATGGATATCAATATGCCAAACGTAAATGGTGTGGAAGCTACAAAACAGCTTGTAGAGCTGTATCCTGAATCTAAAGTAATTATTCTATCAATTCACGATGACGAAAATTATGTAACACATGCCCTGAAAACAGGTGCAAGAGGTTATCTGCTGAAAGAGATGGATGCTGATACATTAATTGAAGCGGTTAAAGTAGTGGCTGAGGGCGGATCTTACCTCCATCCGAAGGTTACTCACAACCTCGTTAACGAATTCCGCCGCCTTGCAACAAGCGGAGTTTCTGCACACCCTCAACATGAGGTTTACCCTGAAATCCGCAGACCATTACATATTTTAACTAGGCGGGAATGTGAAGTGCTGCAGATGCTTGCAGACGGAAAAAGCAACCGCGGTATTGGTGAATCATTGTTTATCAGTGAGAAAACCGTTAAAAACCATGTCAGCAATATTTTACAAAAAATGAATGTAAACGACCGGACGCAAGCCGTTGTGGTCGCCATTAAAAATGGCTGGGTAGAAATGAGATAG-3'(서열번호 12)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에 의하면, degU의 단일염기가 치환된 단백질(서열번호 13)을 포함하는 바실러스 속 균주를 제조하였으며(실시예 1), 이를 통해 기존에 알려진 바실러스 균주의 항균활성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 2).
본 발명의 용어, "바실러스"는 자연계에 널리 분포하는 호기성, 또는 통성 혐기성의 그람 양성 간균 속으로, 바실러스 속에 속하는 미생물에는 여러 종류가 있다.
상기 바실러스 속 균주는, 바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 시리우스 (Bacillus cereus), 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis), 바실러스 아미롤리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezenesis)일 수 있고, 구체적으로 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 테퀼렌시스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은, degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주가 항균 활성을 높인다는 것을 증명하기 위하여 두 가지 바실러스균 바실러스 서브틸리스 KCTC1028 및 바실러스 테퀼렌시스 BOR1 (대한민국 특허 제10-2015-0061418호)를 선정하여 어떠한 외래 DNA가 도입되지 않고 degU의 단일염기가 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주를 제작하였다(실시예 1, 도 1a, 도1b 및 도 2).
본 발명의 용어, "포자"는 세균 등의 번식 세포를 말하며, 본 발명의 목적상 상기 포자는 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주의 번식 세포를 의미한다. 본 발명에서 상기 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주의 포자는 그람양성 세균 및 곰팡이 세균에 대한 항균 활성을 나타내어 항균 활성이 있는 식품, 사료, 의약품, 의약외품, 건강기능식품에 포함되어 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "배양물"은 상기 균주를 배양한 다음 수득한 산물을 의미하며, 균체를 포함한 배양 원액일 수 있으며, 또한 배양 균주, 배양 상등액을 제거하거나 농축한 균체일 수 있다. 상기 배양물의 조성은 통상의 바실러스 배양에 필요한 성분뿐 아니라, 바실러스의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명의 용어, "농축물"은 상기 배양물을 농축한 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "추출물"은 상기 배양물 또는 그의 농축물로부터 추출한 것을 의미하며, 본 발명의 진균류 및 식중독 유발 세균에 특이적 항균 효과를 나타낼 수 있는 추출물인 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "건조물"은 상기 배양물, 그의 농축물, 그의 추출물, 및 그의 분획물을 건조한 것을 의미한다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주는 통상적인 바실러스 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 철, 인 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.
본 발명의 용어, "항균 조성물"은 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스를 배양하는 과정에서 생성되는 기타 부산물을 함께 포함할 수 있다. 또한 항균 조성물은 식품 조성물, 약학 조성물, 화장품 조성물, 의약외품 조성물, 또는 사료 조성물로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 "식품 조성물"에서 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다. 상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 기능성식품, 건강식품, 또는 건강기능식품일 수 있다.
본 발명자들은 신규 분리된 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주가 그람양성 세균과 곰팡이에 대한 증진된 항균효과를 가짐을 확인하였는바, 상기 균주를 이용한 항균 조성물을 모든 식품에 직접적으로 사용할 수 있다.
상기 용어 "약학 조성물"은 사람이나 동물의 질병을 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있는 것을 의미한다. 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 용어 "화장품"은 인체를 청결, 미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부, 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 바르고 문지르거나 뿌리는 등 이와 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 경미한 것을 의미한다.
상기 화장품 조성물의 제형은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이컵 베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스 또는 바디 세정제일 수 있다.
본 발명자들은 신규 분리된 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주가 그람양성 세균과 곰팡이에 대한 증진된 항균효과를 가짐을 확인하였는바, 상기 균주를 이용한 항균 조성물은 피부 점막에 미생물 감염을 예방하는 화장품 조성물에 효과적으로 사용될 수 있다.
상기 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미할 수 있다. 또한, 상기 의약외품은 피부외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 구체적으로는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 또는 연고제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명자들은 신규 분리된 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주가 그람양성 세균과 곰팡이에 대한 증진된 항균효과를 가짐을 확인하였는바, 상기 균주를 이용한 항균 조성물은 미생물 감염 질환의 치료, 경감, 처치 또는 예방을 위한 의약외품에 효과적으로 사용될 수 있다.
상기 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 생균제를 포함할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
이때, 본 발명의 항균조성물을 포함하는 사료 조성물은 부형제, 희석제, 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 신규 분리된 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주가 그람양성 세균과 곰팡이를 억제할 수 있는 증진된 효과가 있음을 확인하였는바, 본 발명은 항균 및 항진균 활성이 있는 사료 조성물을 제공하여, 가축의 식중독을 포함한 미생물 감염 질환을 예방할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 균주는 그람양성 세균 또는 곰팡이 균주에 대해 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "그람양성 세균"은, 마이크로코커스 속 미생물, 포도상구균 속 미생물, 클로스트리움 속 미생물, 디프테리아 균, 방선균, 파상풍 균, 폐렴균, 탄저균 등 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "곰팡이 균주"는, 예를 들어, 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 스템필리움 허바룸 (Stemphylium herbarum), 디아포더 암비구아 (Diaporthe ambigua), 콜레토르리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum) 및 디디멜라 브리오니에 (Didymella bryoniae)등 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 그람양성 세균은 마이크로코커스 속 균주, 구체적으로 마이크로코커스 루테우스 일 수 있고, 곰팡이는 퓨자리움 속 균주, 구체적으로는 퓨자리움 솔라니일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus)"는 그람 양성균으로, 구균의 형태를 가지고 있다. 상기 균주는 토양, 먼지, 물, 공기 및 포유류의 피부에서 발견되며, 인간의 입, 코의 점막 등에 콜로니를 형성한다. 어려운 환경에서도 오랫동안 생존할 수 있는 능력을 가지며 최근 연구결과 적어도 34,000년에서 170,000년 동안 생존해 온 것으로 밝혀졌다. 마이크로코커스 루테우스는 환자에게 오염을 일으키며, 주요 대사과정을 느리게 함으로써 저항을 일으켜 발병을 일으키는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, degU의 단일 염기가 변이된 균주를 그람양성세균인 마이크로코커스 루테우스에 처리한 결과, 생육 저지환이 형성되어 유해균류의 생육을 억제하는 항균 활성이 야생형에 비하여 뛰어남을 확인하였다(도 3).
본 발명의 용어, "퓨자리움 솔라니 (Fusarium solani)"는 토양 속에서 서식하는 사상균의 일종으로 대부분이 토양 속의 유기물을 부식시키면서 부생생활을 한다. 다만, 그 중의 일부가 작물에 기생하여 병을 일으키는 능력을 가진다. 이 곰팡이는 전 세계적으로 분포하고 있으며, 의학적으로 중요한 병원체로 각막염 등의 흔한 질병을 유발한다. 또한, 식물의 뿌리썩음병 및 대두의 Sudden Death Syndrome (SDS)를 유발하는 감염원인으로도 잘 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 야생형 균주들의 배양 상등액은 1배 희석액 (20; 원액)에서도 곰팡이에 대한 생장 저해 효과가 없었던 반면, 본 발명의 1028u 균주는 그 배양 상등액이 4배 (2-2), BOR1u는 8배 (2-3) 희석액에서도 곰팡이에 대한 생장 저해 효과를 가지는 것을 확인하였다(도 4).
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 항균 활성을 가지는 바실러스 속 균주를 제공한다.
상기 바실러스 속 균주는, 바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 시리우스 (Bacillus cereus), 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis), 바실러스 아미롤리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezenesis)일 수 있고, 구체적으로 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 테퀼렌시스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 목적 균주에 목적 유전자를 포함하는 도입벡터와 상기 목적 유전자의 도입 여부를 확인할 수 있게 하는 헬퍼 플라스미드를 도입하여 변이 균주를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 변이 균주 제조방법은 (a) (i) degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (ii) 억제 가능한 제1 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 억제 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트, 및 (iii) 제1 리포터 유전자를 포함하는 도입벡터; 및, (i) 억제 가능한 제2 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 발현 카세트, 및 (ii) 제1 억제 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드를 준비하는 단계; (b) 상기 도입벡터 및 헬퍼 플라스미드를 돌연변이를 유도하고자 하는 목적 균주에 도입하고, 상기 제1 프로모터를 활성화시켜, 목적 균주에 돌연변이가 유도된 형질전환체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환체로부터 헬퍼 플라스미드를 제거하여 변이 균주를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 "목적 균주"란, 목적 유전자가 도입되어, 변이됨으로써, 변이 균주가 될 수 있는 균주, 즉 돌연변이를 유도하고자 하는 최초 시작 균주를 의미한다.
본 발명에서는 목적 균주에 도입벡터와 헬퍼 플라스미드를 도입하고, 1차 단일 교차(single crossover)를 유도하여 상기 도입벡터가 목적 균주의 염색체에 도입된 재조합 균주를 수득하고, 상기 재조합 균주에서 2차 단일 교차를 유도하여 목적 유전자 이외의 도입 벡터에 포함된 성분을 염색체로부터 제거한 형질전환체를 수득하였으며, 상기 형질전환체로부터 헬퍼 플라스미드를 제거하여 변이 균주를 제조하였다. 본 발명에서는 상기 목적 균주의 예로서, 바실러스균 바실러스 서브틸리스 KCTC1028 및 바실러스 테퀼렌시스 BOR1를 사용하였다.
본 발명의 용어 "도입벡터"란, 상기 목적 균주에 목적 유전자를 전달하기 위한 전달 매체가 되는 벡터를 의미한다.
상기 도입벡터는 목적 유전자, 제1 발현 카세트 및 제1 리포터 유전자를 포함하지만, 필요에 따라 다양한 구성요소를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 용어 "헬퍼 플라스미드"란, 상기 목적 균주에 도입된 목적 유전자가 정상적으로 내재 유전자를 변이시키는지의 여부를 확인할 수 있게 하는 플라스미드를 의미한다.
상기 헬퍼 플라스미드는 제2 발현 카세트 및 제1 억제 유전자를 포함하여, 도입벡터에 포함된 제1 발현 카세트가 염색체로 도입되었는지의 여부, 제1 발현 카세트가 발현되는지의 여부를 확인하는데 사용할 수 있다. 아울러, 필요에 따라 복제기원 등의 다양한 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 방법에서 마지막으로 헬퍼 플라스미드를 제거하는 단계는 헬퍼 플라스미드를 상기 형질전환체로부터 제거할 수 있는 한, 상기 단계를 수행하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 상기 형질전환체를 항생제가 포함되지 않은 배지에서 하룻밤동안 배양하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 형질전환체로부터 상기 헬퍼 플라스미드가 제거되었는지의 여부는 이를 제2 발현 카세트에 포함된 제2 리포터 유전자의 발현 여부로서 확인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 상기 제2 리포터 유전자로서 클로람페니콜 내성 유전자를 사용하였고, 항생제가 포함되지 않은 배지에서 하룻밤동안 배양된 형질전환체를 클로람페니콜을 포함하는 배지에서 배양하여 형질전환체가 증식하지 않음을 확인함으로써, 상기 형질전환체로부터 헬퍼 플라스미드가 제거되었음을 알 수 있었다.
본 발명의 용어 "목적 유전자"란, 변이를 유발시키고자 하는 목적 균주에 도입하여 내재 유전자를 변이시킴으로써, 목적 균주의 유전형질을 변이시킬 수 있는 유전자를 의미한다.
상기 목적 유전자는 목적 균주에 포함되지 않은 새로운 유전자가 될 수도 있고, 목적 균주에 포함된 내재 유전자를 변이시킨 변이 유전자가 될 수도 있는데, 구체적으로는 목적 균주의 유전자에 도입하기 위한 변이서열을 포함하는 것이 될 수 있고, 보다 구체적으로는 목적 균주에 포함된 내재 유전자를 변이시킨 변이 유전자가 될 수 있으며, 가장 구체적으로는 목적 균주에 포함된 내재 유전자의 염기서열에 일부 염기서열을 추가, 치환 또는 결실시켜서 수득한 변이 유전자가 될 수 있다. 본 발명에서는 상기 목적 유전자의 예로서, 단일 염기가 치환된 degU 유전자를 사용하였다.
본 발명의 용어 "억제가능한 프로모터"란, 프로모터를 활성화시키거나 또는 불활성화시키도록 조절할 수 있는 프로모터를 의미한다. 상기 프로모터는 유도제의 처리에 의하여 프로모터가 활성화되어 이와 작동 가능하게 연결된 유전자를 발현시키거나 또는 억제제에 의하여 프로모터가 불활성화되어 이와 작동 가능하게 연결된 유전자를 발현시키지 않는다.
상기 억제가능한 프로모터는 제1 발현 카세트에 포함된 제1 프로모터와 제2 발현 카세트에 포함된 제2 프로모터가 될 수 있는데, 상기 제1 프로모터는 상시 발현되는 제1 억제유전자에 의하여 활성이 억제되고, 상기 제2 프로모터는 상기 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 억제유전자에 의하여 활성이 억제될 수 있다. 상기 제2 억제유전자에 의하여 억제되지 않는 한 활성화된 상태가 유지되는 제2 프로모터와는 달리, 상기 제1 프로모터는 상시 발현되는 제1 억제유전자에 의하여 불활성화된 상태가 유지되기 때문에, 이를 활성화시키기 위하여는 제1 프로모터의 활성을 증가시킬 수 있는 물질이 처리되어야 한다. 상기 제1 프로모터의 활성을 증가시킬 수 있는 물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 상기 제1 억제유전자의 활성을 억제하면서도 제1 프로모터를 활성화시키는 이중효과를 나타내는 것을 사용함이 바람직하다. 본 발명에서는 상기 제1 프로모터의 예로서 자일로스에 의해 활성화될 수 있는 xylA 프로모터(Pxyl)를 사용하고, 상기 제2 프로모터의 예로서 lacI 유전자의 발현산물에 의하여 활성이 억제될 수 있는 spac 프로모터(Pspac)를 사용하였으며, 상기 xylA 프로모터(Pxyl)의 활성을 증가시킬 수 있는 물질로서는 자일로스를 사용하였다.
본 발명의 용어 "억제 유전자"란, 억제가능한 프로모터를 불활성화시키는데 사용되는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.
상기 억제 유전자는 헬퍼 플라스미드에 포함된 제1 억제 유전자와 제1 발현 카세트에 포함된 제2 억제유전자가 될 수 있는데, 상기 제1 억제 유전자는 상시 발현되도록 구성되어, 제1 발현 카세트에 포함된 제1 프로모터를 불활성화된 상태로 유지하는 역할을 수행하고, 상기 제2 억제 유전자는 상기 제1 프로모터에 의하여 발현되거나 또는 발현되지 않도록 조절되는데, 상기 제2 억제 유전자가 발현되면, 제2 발현 카세트에 포함된 제2 프로모터를 불활성화된 상태로 유지하여 결과적으로는 제2 리포터 유전자의 발현을 억제하는 반면, 상기 제2 억제 유전자가 발현되지 않을 경우에는 제2 리포터 유전자가 지속적으로 발현된다. 본 발명에서는 상기 제1 억제 유전자의 예로서 자일로스를 분해하는 단백질을 코딩하는 xylR 유전자를 사용하고, 상기 제2 억제 유전자의 예로서 spac 프로모터(Pspac)를 불활성화시키는 lacI 유전자를 사용하였다.
본 발명의 용어 "리포터 유전자"란, 세포 내에서 위치나 발현 정도를 쉽게 측정할 수 있는 유전자를 의미한다.
상기 리포터 유전자는 도입벡터에 포함된 제1 리포터 유전자와 제2 발현 카세트에 포함된 제2 리포터 유전자가 될 수 있는데, 상기 제1 리포터 유전자는 도입벡터에 포함되었다가 1차 단일 교차에 의해 목적 균주의 염색체로 도입되며, 2차 단일 교차에 의해 상기 염색체 내에서 제거되기 전까지 상시 발현되고, 상기 제2 리포터 유전자는 제2 발현 카세트에 포함되어 제1 발현 카세트가 활성화되지 않는 한 지속적으로 발현된다. 상기 리포터 유전자는 도입벡터(제1 리포터 유전자)와 헬퍼 플라스미드(제2 리포터 유전자)가 균주내에서 정상적으로 작동하는지의 여부를 표시하는 역할을 수행하는데, 상기 도입벡터와 헬퍼 플라스미드의 작동 여부를 확인할 수 있도록 상기 제1 및 제2 리포터 유전자는 서로 동일하지 않은 유전자를 사용함이 바람직하다. 아울러, 상기 리포터 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 통상적으로 사용되는 형광단백질 유전자 또는 항생제 내성 유전자를 사용할 수 있는데, 상기 리포터 유전자는 형질전환 여부를 판단하는 선별마커로서의 역할도 함께 수행하기 때문에, 구체적으로는 항생제 내성 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "항생제 내성 유전자"란, 항생제에 대하여 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.
상기 항생제 내성 유전자는 제1 발현 카세트에 포함되어, 목적하는 균주에 도입된 후에는 균주의 염색체에 도입되며, 상기 염색체로부터 제거되기 전까지는, 상술한 프로모터 또는 억제 유전자와는 상관없이 독립적으로 발현된다. 상기 항생제 내성 유전자는 종래에 사용되었던 모든 항생제 내성 유전자를 사용할 수 있는데, 구체적으로는 베타락탐계 항생제 내성 유전자인 SHV-12, TEM, 세팔로스포린계 항생제 내성 유전자인 AmpC, 테트라사이클린 내성 유전자인 TetM, TetC, 네오마이신 저항유전자인 neo, 클로람페니콜 내성 유전자인 cat, 스트렙토마이신 내성 유전자인 strA, 반코마이신 내성 유전자인 vanA, vanB, vanC 등을 필요에 따라 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는 상기 제1 리포터 유전자의 예로서 네오마이신 내성 유전자인 neo를 사용하고, 상기 제2 리포터 유전자의 예로서 클로람페니콜 내성 유전자인 cat를 사용하였다.
본 발명의 용어 "제1 발현 카세트"란, 상기 제1 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 억제 유전자를 포함하고, 상기 제2 억제 유전자를 발현시킬 수 있으며, 전체적으로 치환 가능한 일련의 DNA 서열을 의미한다. 본 발명에서는 상기 제2 발현 카세트의 예로서, xylA 프로모터(Pxyl)와 lacI 유전자를 포함하는 발현 카세트를 사용하였는데, 상기 제1 발현 카세트는 1차 단일 교차에 의해 도입벡터에서 목적 균주의 염색체에 도입될 수 있고, 2차 단일 교차에 의해 상기 염색체로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 용어 "제2 발현 카세트"란, 상기 제2 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자를 포함하고, 상기 제2 리포터 유전자를 발현시킬 수 있으며, 전체적으로 치환 가능한 일련의 DNA 서열을 의미한다. 본 발명에서는 상기 제2 발현 카세트의 예로서, spac 프로모터(Pspac)와 cat 유전자를 포함하는 발현 카세트를 사용하였는데, 상기 제2 발현 카세트는 헬퍼 플라스미드에 포함되고, 상기 헬퍼 플라스미드를 제거함에 의하여 형질전환체로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 용어 "형질전환체"란, 상기 재조합 균주에서 제1 프로모터를 활성화시켜서 2차 단일 교차를 유도함으로써 제조되고, 목적 유전자 이외의 도입벡터에 포함된 성분이 염색체로부터 제거되며, 헬퍼 플라스미드를 포함하는 균주를 의미한다. 아울러, 상기 형질전환체는 제1 프로모터를 활성화시키는 조건하에서 제2 리포터 유전자의 발현여부를 확인함으로써 그의 제조여부를 판정할 수 있는데, 구체적으로, 제1 프로모터를 활성화시키는 조건하에서 제2 리포터 유전자가 발현될 경우에는 형질전환체가 제조되었다고 판정할 수 있고, 발현되지 않는 경우에는 반대로 판정할 수 있다. 상기 염색체에서 목적 유전자를 제외한 도입벡터의 성분이 제거되지 않으면, 제1 프로모터를 활성화시키는 조건하에서 지속적으로 제2 억제 유전자가 발현되므로, 이에 의하여 제2 리포터 유전자가 발현되지 않으나, 상기 형질전환체는 목적 유전자를 제외한 도입벡터의 성분이 염색체로부터 모두 제거되었으므로, 제1 프로모터를 활성화시키는 조건하에서도 제2 억제 유전자가 발현되지 않아, 제2 리포터 유전자가 발현될 수 있으므로, 상기와 같이 판정할 수 있다.
복제기원이 포함되지 않은 도입벡터는 목적 균주에 염색체에 도입되지 않은 한, 증식하는 목적 균주내에 잔류할 수 없기 때문에 결과적으로는 제1 리포터 유전자가 발현되지 않으나, 염색체에 도입벡터가 도입된 재조합 균주에서는 도입벡터에 포함된 제1 리포터 유전자가 상기 발현되므로, 상기와 같이 판정할 수 있다.
본 발명의 용어 "변이 균주"란, 상기 형질전환체에서 헬퍼 플라스미드를 제거함으로써 제조되고, 목적 유전자 이외의 외부에서 도입된 성분 또는 외래 유전자가 모두 제거된 균주를 의미한다. 본 발명에서 제공하는 변이 균주는 본 발명에서 제공하는 변이 균주 제조방법을 통해 최종적으로 얻어지는 산물로서, 외부에서 도입된 성분이 모두 제거된 상태로 목적 균주에 돌연변이가 유도된 균주라고 할 수 있다.
상기 재조합 균주 및 형질전환체는 본 발명의 변이 균주 제조방법의 (b) 단계를 통하여 수득할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 변이 균주 제조방법의 (b) 단계는 하기의 구체적인 단계를 포함할 수 있다: (b1) 상기 도입벡터 및 헬퍼 플라스미드를 목적 균주에 도입하여 도입벡터와 목적 균주의 염색체 간의 1차 단일 교차(single crossover)를 유도하는 단계; (b2) 제1 리포터 유전자의 발현을 확인하여 상기 1차 단일 교차가 유도된 재조합 균주를 선별하는 단계; (b3) 상기 제1 프로모터를 활성화시켜 상기 재조합 균주의 염색체 내의 2차 단일 교차를 유도하는 단계; 및, (b4) 제2 리포터 유전자의 발현을 확인하여 상기 2차 단일 교차가 유도된 형질전환체를 선별하는 단계.
상기와 같이, 목적 균주에 도입벡터와 헬퍼 플라스미드를 도입하면 이에 의하여 제1 단일 교차가 유도되어, 재조합 균주를 수득할 수 있고, 상기 재조합 균주에서 제1 프로모터를 활성화시키면 이에 의하여 제2 단일 교차가 유도되어 형질전환체를 수득할 수 있으므로, 상기 재조합 균주와 형질전환체의 제조에는 단일 교차가 필수적인 역할을 수행함을 알 수 있다.
본 발명의 신규 분리한 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주는 병원성 곰팡이, 효모 등 1종 이상의 서로 다른 종류의 진균류 및 세균에 대하여 야생형 균주에 비하여 항균 효과가 현저하게 증가 되었으므로 식물 작물용 항균제, 항균 활성을 갖는 식품, 및 미생물 감염 질환의 예방, 개선, 치료를 위한 사료, 건강기능식품, 의약외품, 의약품으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 변이 균주 제조방법을 사용하면, 염색체 내에 목적하는 변이를 유발시킬 수 있을 뿐만 아니라 외부에서 도입된 성분이 모두 제거되어 상기 변이가 유발된 형질전환체를 그대로 다른 연구에 사용할 수 있으므로, 보다 효과적인 항균활성을 갖는 변이 균주의 연구에 활용될 수 있다.
도 1a는 degU와 단일염기가 치환된 degU 유전자 N말단 염기서열을 나타내며, 도 1b는 효모용 벡터인 YEp352에 degU의 염기 서열을 포함하는 바실러스 속 유전자를 클로닝하는 것을 나타낸 것이다. 별(*) 표시는 돌연변이가 일어난 위치를 나타낸다. 화살표는 프라이머 결합위치를 나타낸다.
도 2는 외래 DNA 도입없이 친환경적인 방법으로 바실러스 염색체 내 단일염기가 치환된 degU 유전자를 포함하는 바실러스 속 균주로 만드는 것을 나타낸 것이다.
도 3은 야생형 균주와 단일염기가 치환된 degU 유전자를 포함하는 바실러스 속 균주의 그람양성 세균에 대한 항균활성을 비교한 것이다.
도 4는 야생형 균주와 단일염기가 치환된 degU 유전자를 포함하는 바실러스 속 균주의 곰팡이에 대한 항진균 활성을 비교한 것이다. 숫자는 배양 상등액의 2-n 희석 배수를 나타낸다.
도 2는 외래 DNA 도입없이 친환경적인 방법으로 바실러스 염색체 내 단일염기가 치환된 degU 유전자를 포함하는 바실러스 속 균주로 만드는 것을 나타낸 것이다.
도 3은 야생형 균주와 단일염기가 치환된 degU 유전자를 포함하는 바실러스 속 균주의 그람양성 세균에 대한 항균활성을 비교한 것이다.
도 4는 야생형 균주와 단일염기가 치환된 degU 유전자를 포함하는 바실러스 속 균주의 곰팡이에 대한 항진균 활성을 비교한 것이다. 숫자는 배양 상등액의 2-n 희석 배수를 나타낸다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주 제작
본 발명의 일 실시예에 따라 항균활성이 높아진 균주를 제작하였다.
실시예 1-1. 다른 Yeast 이용한 유전자 재조합
본 발명자들은 항균활성이 높아진 균주를 제작하고자 degU의 단일염기를 치환하여 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 코딩하는 염기서열을 제작하였다.
본 발명의 실시예에서 사용된 degU의 염기서열은 다음과 같다.
5'-GTGACTAAAGTAAACATTGTTATTATCGACGACCATCAGTTATTTCGTGAAGGTGTTAAACGGATA TTGGATTTTGAACCTACCTTTGAAGTGGTAGCCGAAGGTGATGACGGGGACGAAGCGGCTCGTATTGTTGAGCACTATCATCCTGATGTTGTGATCATGGATATCAATATGCCAAACGTAAATGGTGTGGAAGCTACAAAACAGCTTGTAGAGCTGTATCCTGAATCTAAAGTAATTATTCTATCAATTCACGATGACGAAAATTATGTAACACATGCCCTGAAAACAGGTGCAAGAGGTTATCTGCTGAAAGAGATGGATGCTGATACATTAATTGAAGCGGTTAAAGTAGTGGCTGAGGGCGGATCTTACCTCCATCCGAAGGTTACTCACAACCTCGTTAACGAATTCCGCCGCCTTGCAACAAGCGGAGTTTCTGCACACCCTCAACATGAGGTTTACCCTGAAATCCGCAGACCATTACATATTTTAACTAGGCGGGAATGTGAAGTGCTGCAGATGCTTGCAGACGGAAAAAGCAACCGCGGTATTGGTGAATCATTGTTTATCAGTGAGAAAACCGTTAAAAACCATGTCAGCAATATTTTACAAAAAATGAATGTAAACGACCGGACGCAAGCCGTTGTGGTCGCCATTAAAAATGGCTGGGTAGAAATGAGATAG-3'(서열번호 1)
degU의 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주를 제작하기 위해서는 먼저 대장균에서 degU 유전자의 클로닝 작업을 수행해야 하는데 DegU는 대장균에 독성을 나타내기 때문에 (Dahl MK. 1992. J. Biol. Chem. 267: 14509-14514) 클로닝이 어렵다는 것이 알려져 있다. 이 문제를 극복하기 위하여 degU가 발현되지 않는 진핵세포인 효모에서 클로닝 작업을 수행하였다. degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주가 항균 활성을 높인다는 것을 증명하기 위하여 두 가지 바실러스균 바실러스 서브틸리스 KCTC1028 및 바실러스 테퀼렌시스 BOR1 (대한민국 특허 제10-2015-0061418호)를 선정하여 어떠한 외래 DNA가 도입되지 않고 degU의 단일염기가 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주를 제작하였다.
구체적으로, 먼저 BOR1 균주의 degU 유전자의 단일 염기를 바꾸어 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주로 만들기 위해 (도 1a), 프라이머 염기서열 내에 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 염기서열을 갖도록 primer R1 및 F2를 제작하였다. 다음 primer F1/R1 및 F2/R2 세트를 이용하여 BOR1 균주의 염색체로부터 두 가지 DNA 단편들을 PCR 증폭한 후 fusion PCR을 통하여 degU 프로모터를 포함한 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 DNA 단편을 획득하였다.
F1: 5'-ACTGGAGCAGGTAGAATTGACGATGAT-3'(서열번호 2)
R1: 5'-CACCTTCACGAAATAACTGAAGGTCGTCGATAATAACAATG-3' (서열번호 3)
F2: 5'-CATTGTTATTATCGACGACCTTCAGTTATTTCGTGAAGGTG-3' (서열번호 4)
R2: 5'-TAGTCTAGAATTATGTTTTTTCACTTCTTCA-3' (서열번호 5)
상기 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 DNA 단편으로부터 프라이머 F3/R3 및 F5/R5 세트를 이용하여 각각 PCR을 수행하여 양쪽 말단이 서로 다른 두 가지 종류의 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 DNA 단편을 확보하였고 pUlac-neo 플라스미드 (Jeong DE et al. 2015. Nucleic Acids Res. 43: e42)를 주형으로 프라이머 F4/R4 세트를 사용하여 lacI-neo DNA 단편을 확보하였다. 효모용 플라스미드 Yep352 (Hill JE. 1986. Yeast 2: 163-167)는 SpeI/BamHI 제한효소로 처리 후, 아가로즈 겔에 전기영동 후 추출하였다.
F3: 5'-ATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACACTAGTCAGGTAGAATTGACGATGAT-3 (서열번호 6)
R3: 5'-CAGGCATGCCATATGTCTAGACCCGGGGCTAGCCTCGAGATTATGTTTTTTCACTTCTT-3 (서열번호 7)
F4: 5'-GGACTGGAAAAGCTTTTATGAAGAAGTGAAAAAACATAATCTCGAGGCTAGCCCCGGGTC-3 (서열번호 8)
R4: 5'-ATTGCTTCTCACGCTGCTGGATCATCGTCAATTCTACCTGAATAAATACGTAACCAACAT-3 (서열번호 9)
F5: 5'-ACCTCTAATAATTGTTAATCATGTTGGTTACGTATTTATTCAGGTAGAATTGACGATGAT-3 (서열번호 10)
R5: 5'-CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCGGATCCATTATGTTTTTTCACTTCTT-3 (서열번호 11)
효모는 여러 DNA 단편들이 특별한 전처리 과정이 없이도 상보적인 부위가 있으면 세포 내에서 연결되는 특성을 가지고 있다(Gibson DG. 2008. PNAS 105: 20404-20409). 이러한 특성을 이용하여 절단된 효모용 벡터와 이에 상보적인 부위를 가진 PCR 산물들을 효모에 도입하면 세포 내에서 원하는 플라스미드가 완성된다. 이를 위해 Clontech사의 Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2의 방법에 따라 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) Y2805 균주의 competent cell을 제작하고, 상기 제한효소 처리된 Yep352와 양쪽 말단이 서로 다른 두 가지 종류의 degU의 단일염기가 변이된 DNA 단편 및 lacI-neo DNA 단편을 효모에 도입하였다.
형질 전환된 효모는 SC-Ura plate (6.7g/L of yeast nitrogen base without amino acid, 0.77 g/L of DO supplement -Ura (Clontech), 20g/L of bacto agar, 2% of glucose)에 도말하여 30℃에서 2 내지 3일 정도 배양하였다. 형성된 단일 콜로니로부터 플라스미드를 추출한 후 PCR과 시퀀싱을 통해서 유전자 재조합 여부를 확인하여 lacI-neo 단편 양쪽에 degU의 단일 염기가 변이된 플라스미드 pYUINU를 확보하였다.
본 발명의 실시예에 따라 단일염기가 변이된 degU의 염기서열(서열번호 12)은 다음과 같다.
5'-GTGACTAAAGTAAACATTGTTATTATCGACGACCTTCAGTTATTTCGTGAAGGTGTTAAACGGATAT TGGATTTTGAACCTACCTTTGAAGTGGTAGCCGAAGGTGATGACGGGGACGAAGCGGCTCGTATTGTTGAGCACTATCATCCTGATGTTGTGATCATGGATATCAATATGCCAAACGTAAATGGTGTGGAAGCTACAAAACAGCTTGTAGAGCTGTATCCTGAATCTAAAGTAATTATTCTATCAATTCACGATGACGAAAATTATGTAACACATGCCCTGAAAACAGGTGCAAGAGGTTATCTGCTGAAAGAGATGGATGCTGATACATTAATTGAAGCGGTTAAAGTAGTGGCTGAGGGCGGATCTTACCTCCATCCGAAGGTTACTCACAACCTCGTTAACGAATTCCGCCGCCTTGCAACAAGCGGAGTTTCTGCACACCCTCAACATGAGGTTTACCCTGAAATCCGCAGACCATTACATATTTTAACTAGGCGGGAATGTGAAGTGCTGCAGATGCTTGCAGACGGAAAAAGCAACCGCGGTATTGGTGAATCATTGTTTATCAGTGAGAAAACCGTTAAAAACCATGTCAGCAATATTTTACAAAAAATGAATGTAAACGACCGGACGCAAGCCGTTGTGGTCGCCATTAAAAATGGCTGGGTAGAAATGAGATAG-3'(서열번호 12)
또한, 상기 단일염기가 변이된 degU의 염기서열로부터 코딩되는 단백질 서열(서열번호 13)은 다음과 같다.
MTKVNIVIIDDLQLFREGVKRILDFEPTFEVVAEGDDGDEAARIVEHYHPDVVIMDINMPNVNGVEATKQLVELYPESKVIILSIHDDENYVTHALKTGARGYLLKEMDADTLIEAVKVVAEGGSYLHPKVTHNLVNEFRRLATSGVSAHPQHEVYPEIRRPLHILTRRECEVLQMLADGKSNRGIGESLFISEKTVKNHVSNILQKMNVNDRTQAVVVAIKNGWVEMR(서열번호 13)
실시예 1-2. degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주 제작
상기 실시예 1-1에서 제조된 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주 제작은 어떠한 외래 DNA의 도입없이 친환경적인 방법 (Jeong DE et al. 2015. Nucleic Acids Res. 43: e42)을 사용하여 제작하였다(도 2).
이를 위해 상기 효모시스템을 이용하여 클로닝된 plasmid pYUINU를 주형으로 상기 프라이머 F3/R5를 사용하여 PCR을 통해 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 degU/lacI-neo 단편을 획득한 후 헬퍼 플라스미드 pA-xylR2 (Jeong DE et al. 2015. Nucleic Acids Res. 43: e42)가 미리 도입된 바실러스 테퀼렌시스 BOR1에 도입하였다. degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 DNA 단편의 도입은 PCR과 시퀀싱으로 확인하였다. 이렇게 제작된 균주는 염색체 내에 두 개의 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 DNA 단편을 가지고 있으며 가운데 lacI-neo 단편을 가지고 있다.
상기 바실러스 속 균주는 클로람페니콜 50㎍/ml, 자일로스 1%가 포함된 TSB (Difco) 액체배지에 접종하여 하룻밤 동안 배양 후 클로람페니콜 50㎍/ml, 1% 자일로스가 포함된 TSA 고체배지에 도말하였다. 무작위로 고른 단일 콜로니들 중 네오마이신 배지에서 자라지 못하는 균주를 확보하였다. 확보된 균주는 in vivo 재조합이 일어나 lacI-neo 단편이 제거되고 단일염기가 변이된 degU만 남게 되며 염색체 내에 어떠한 외래 DNA의 도입도 없는 균주이다. 남아있는 헬퍼 플라스미드는 기존에 공지된 방법 (Jeong DE et al. 2015. Nucleic Acids Res. 43: e42)으로 제거하였다. 이렇게 완성된 바실러스 테퀼렌시스 BOR1u는 원균주인 BOR1과 비교하여 염색체 내에서 degU 유전자의 단일염기만 변형된 균주이다.
바실러스 서브틸리스 KCTC1028 균주의 degU 유전자 내 단일염기가 바뀐 1028u는 상기 BOR1u 균주 제작과정과 동일한 방법으로 제작하였다.
실시예 2: 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주의 항균 활성 검정
본 발명자들은 상기 실시예에서 제작한 1028u, BOR1u 균주의 항균 활성을 측정하였다.
구체적으로, 본 발명 방법으로 제작된 1028u, BOR1u 균주와 각각의 야생형(wild type)인 1028, BOR1 균주의 항균활성을 비교하였다. 상기 항균 활성 실험에 사용된 균은 그람양성 세균인 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) KCTC2177와 곰팡이 균주인 퓨자리움 솔라니 (Fusarium solani) KCTC6326으로 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 이용하였다.
실시예 2-1. 그람 양성 세균에 대한 항균 활성 검정
마이크로코커스 루테우스에 대한 항균 활성 검정을 위하여, 1028, 1028u, BOR1, BOR1u 균주들은 TSB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 220 rpm으로 하룻밤 동안 배양한 후 사용하였다. 마이크로코커스 루테우스가 도말된 TSA 고체배지 위에 6mm 페이퍼 디스크를 올린 후 여기에 상기 배양한 각 바실러스 균주를 2㎕씩 접종하였다. 30℃에 하룻밤 동안 배양 후, 각각 1028과 1028u, BOR1과 BOR1u 주변의 마이크로코커스 생장저해 정도를 확인하였다.
그 결과 도 3에 도시된 것과 같이, 본 발명의 degU 균주를 그람양성 세균인 마이크로코커스 루테우스에 처리한 결과, 생육 저지환이 형성되어 유해균류의 생육을 억제하는 항균 활성이 뛰어남을 확인하였다.
실시예 2-2. 곰팡이에 대한 항균 활성 검정
곰팡이에 대한 항진균 활성 검정을 위해 항진균 활성 검정용 배지는 퓨자리움 솔라니 균사체가 왕성하게 자란 PDA 배지에 0.1% tween 20을 처리한 후 곰팡이 포자를 회수하고 이를 PDA (Potato dextrose agar, Difco) 배지와 혼합하여 플레이트에 굳힌 후 준비하였다. 바실러스 균주들은 LB 배지에서 하룻밤 동안 전배양한 후 P3배지 (15g/l 대두박, 10g/l 당밀, 10g/l 감자전분 및 1g/l CaCO3) 50ml에 접종하여 3일 동안 37℃에서 본 배양하였다. 각 배양액은 원심분리하여 상등액을 획득하고 이를 다시 여과하여 균을 제거한 후 실험에 사용하였다. 상기 균주 배양 상등액들은 각각 2배씩 연속 희석하여 20, 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6배 희석액을 PDA/곰팡이 고체배지에 8mm 페이퍼 디스크를 이용하여 80㎕씩 loading하였다. 그 후 30℃에서 1 내지 2일 배양하여 degU의 12번째 아미노산인 히스티딘이 류신으로 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속 균주와 야생형 균주의 배양 상등액이 각각 곰팡이에 대한 생장 저해 효과를 나타내는 농도와 정도를 확인하였다.
그 결과 도 4에 도시된 것과 같이, 야생형 균주들의 배양 상등액은 1배 희석액 (20; 원액)에서도 곰팡이에 대한 생장 저해 효과가 없었던 반면, 본 발명의 1028u 균주는 그 배양 상등액이 4배 (2-2), BOR1u는 8배 (2-3) 희석액에서도 곰팡이에 대한 생장 저해 효과를 가지는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 야생형 균주에 비해 1028u의 경우 최소 8배 이상, BOR1u의 경우 최소 16배 이상 항진균 활성이 증가됨을 나타낸다.
따라서 본 발명의 degU 유전자의 단일염기가 변형된 바실러스 균주 및 항균 조성물은 그람양성 세균 및 곰팡이 균과 같은 유해균을 억제하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
<120> A Bacillus species strain comprising a modified degU and
antibacterial and antifungal composition comprising the same
<130> KPA160349-KR
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 1
gtgactaaag taaacattgt tattatcgac gaccatcagt tatttcgtga aggtgttaaa 60
cggatattgg attttgaacc tacctttgaa gtggtagccg aaggtgatga cggggacgaa 120
gcggctcgta ttgttgagca ctatcatcct gatgttgtga tcatggatat caatatgcca 180
aacgtaaatg gtgtggaagc tacaaaacag cttgtagagc tgtatcctga atctaaagta 240
attattctat caattcacga tgacgaaaat tatgtaacac atgccctgaa aacaggtgca 300
agaggttatc tgctgaaaga gatggatgct gatacattaa ttgaagcggt taaagtagtg 360
gctgagggcg gatcttacct ccatccgaag gttactcaca acctcgttaa cgaattccgc 420
cgccttgcaa caagcggagt ttctgcacac cctcaacatg aggtttaccc tgaaatccgc 480
agaccattac atattttaac taggcgggaa tgtgaagtgc tgcagatgct tgcagacgga 540
aaaagcaacc gcggtattgg tgaatcattg tttatcagtg agaaaaccgt taaaaaccat 600
gtcagcaata ttttacaaaa aatgaatgta aacgaccgga cgcaagccgt tgtggtcgcc 660
attaaaaatg gctgggtaga aatgagatag 690
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer F1
<400> 2
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer R1
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<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer F2
<400> 4
cattgttatt atcgacgacc ttcagttatt tcgtgaaggt g 41
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 60
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<220>
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60
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<220>
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<400> 7
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ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgccggatcc attatgtttt ttcacttctt 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> degU 32
<400> 12
gtgactaaag taaacattgt tattatcgac gaccttcagt tatttcgtga aggtgttaaa 60
cggatattgg attttgaacc tacctttgaa gtggtagccg aaggtgatga cggggacgaa 120
gcggctcgta ttgttgagca ctatcatcct gatgttgtga tcatggatat caatatgcca 180
aacgtaaatg gtgtggaagc tacaaaacag cttgtagagc tgtatcctga atctaaagta 240
attattctat caattcacga tgacgaaaat tatgtaacac atgccctgaa aacaggtgca 300
agaggttatc tgctgaaaga gatggatgct gatacattaa ttgaagcggt taaagtagtg 360
gctgagggcg gatcttacct ccatccgaag gttactcaca acctcgttaa cgaattccgc 420
cgccttgcaa caagcggagt ttctgcacac cctcaacatg aggtttaccc tgaaatccgc 480
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gtcagcaata ttttacaaaa aatgaatgta aacgaccgga cgcaagccgt tgtggtcgcc 660
attaaaaatg gctgggtaga aatgagatag 690
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<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DegU32
<400> 13
Met Thr Lys Val Asn Ile Val Ile Ile Asp Asp Leu Gln Leu Phe Arg
1 5 10 15
Glu Gly Val Lys Arg Ile Leu Asp Phe Glu Pro Thr Phe Glu Val Val
20 25 30
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His Pro Asp Val Val Ile Met Asp Ile Asn Met Pro Asn Val Asn Gly
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Ile Ile Leu Ser Ile His Asp Asp Glu Asn Tyr Val Thr His Ala Leu
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Lys Thr Gly Ala Arg Gly Tyr Leu Leu Lys Glu Met Asp Ala Asp Thr
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Pro Lys Val Thr His Asn Leu Val Asn Glu Phe Arg Arg Leu Ala Thr
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Arg Pro Leu His Ile Leu Thr Arg Arg Glu Cys Glu Val Leu Gln Met
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Leu Ala Asp Gly Lys Ser Asn Arg Gly Ile Gly Glu Ser Leu Phe Ile
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195 200 205
Asn Val Asn Asp Arg Thr Gln Ala Val Val Val Ala Ile Lys Asn Gly
210 215 220
Trp Val Glu Met Arg
225
Claims (9)
- 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 변이된 degU 단백질을 포함하는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주, 상기 균주의 포자, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 그람양성 세균 또는 곰팡이 균주에 대해 항균 활성을 가지는 것인, 항균 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 그람양성 세균은 마이크로코커스 속 (Micrococcus sp.)인 것인, 항균 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 곰팡이 균주는 퓨자리움 속 (Fusarium sp .) 인 것인, 항균 조성물.
- 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 변이된 degU 단백질을 포함하는 항균 활성을 가지는 바실러스 속 균주.
- (a) (i) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 변이된 degU 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (ii) 억제 가능한 제1 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 억제 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트, 및 (iii) 제1 리포터 유전자를 포함하는 도입벡터; 및,
(i) 억제 가능한 제2 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자를 포함하는 제2 발현 카세트, 및 (ii) 제1 억제 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드를 준비하는 단계;
(b) 상기 도입벡터 및 헬퍼 플라스미드를 돌연변이를 유도하고자 하는 목적 균주에 도입하고, 상기 제1 프로모터를 활성화시켜, 목적 균주에 돌연변이가 유도된 형질전환체를 수득하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환체로부터 헬퍼 플라스미드를 제거하여 변이 균주를 수득하는 단계를 포함하는,
항균 활성을 가지는 균주의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
상기 제1 억제 유전자의 발현은 상기 제1 프로모터의 활성을 억제시키고, 상기 제2 억제 유전자의 발현은 제2 프로모터의 활성을 억제시키는 것인 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 (b) 단계는
(b1) 상기 도입벡터 및 헬퍼 플라스미드를 목적 균주에 도입하여 도입벡터와 목적 균주의 염색체 간의 1차 단일 교차(single crossover)를 유도하는 단계;
(b2) 제1 리포터 유전자의 발현을 확인하여 상기 1차 단일 교차가 유도된 재조합 균주를 선별하는 단계;
(b3) 상기 제1 프로모터를 활성화시켜 상기 재조합 균주의 염색체 내의 2차 단일 교차를 유도하는 단계; 및,
(b4) 제2 리포터 유전자의 발현을 확인하여 상기 2차 단일 교차가 유도된 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 것인 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160093526A KR101785619B1 (ko) | 2016-07-22 | 2016-07-22 | degU의 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160093526A KR101785619B1 (ko) | 2016-07-22 | 2016-07-22 | degU의 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101785619B1 true KR101785619B1 (ko) | 2017-10-16 |
Family
ID=60296022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160093526A KR101785619B1 (ko) | 2016-07-22 | 2016-07-22 | degU의 변이된 단백질을 포함하는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물 |
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|---|---|
| KR (1) | KR101785619B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210017075A (ko) * | 2019-08-06 | 2021-02-17 | 주식회사 프록스엔렘 | 서팩틴을 생산하는 신규 미생물 바실러스 벨레젠시스 및 이의 용도 |
-
2016
- 2016-07-22 KR KR1020160093526A patent/KR101785619B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BMC Microbiology. Vol. 15, No. 78, 페이지 1-12 (2015.03.31.)* |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210017075A (ko) * | 2019-08-06 | 2021-02-17 | 주식회사 프록스엔렘 | 서팩틴을 생산하는 신규 미생물 바실러스 벨레젠시스 및 이의 용도 |
| KR102240134B1 (ko) | 2019-08-06 | 2021-04-14 | 주식회사 프록스엔렘 | 서팩틴을 생산하는 신규 미생물 바실러스 벨레젠시스 및 이의 용도 |
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