CN109476710B - 抗真菌病原体的新蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新蛋白质，其包含从唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1中提取的新基因。进一步提供了由序列SEQ ID No.1序列表示的编码新蛋白质的核苷酸序列，和由序列SEQ ID No.2表示的该新蛋白质的氨基酸序列。从遗传工程改造的Bg_9562基因获得核苷酸序列和氨基酸序列。新的蛋白质以及编码基因适用于广谱抗真菌和食菌活性。

Description

抗真菌病原体的新蛋白质
技术领域
本发明涉及抗真菌病原体的新蛋白质。更具体地，本发明涉及抗真菌病原体的来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli) 菌株NGJ1的新蛋白质，用于防治多种真菌病。
背景技术
细菌无处不在，存在于土壤、水、空气等当中，也存在于包括昆虫、植物和动物的多细胞生物中。它们具有非常活跃的细胞间通信系统，并且有时可以通过形成生物膜而表现为多细胞生物体。为了生存，他们需要与其他共生细菌、真菌等竞争，并且必须生活在植物、动物等内部或与之一起生活(Frey-Klett et al，2011； Reinhold-Hurek and Hurek，2011)。细菌与其他生物的相互作用可以是互利共生(mutualistic)、偏利共生(commensalistic)、拮抗或寄生 (Haas and Défago，2005；Frey-Klett et al，2011)。通常，它们通过合成植物激素等直接促进植物生长，或通过保护它们防御潜在的病原微生物间接帮助植物(Haas and Défago，2005；Lugtenberg and Kamilova， 2009；Beneduzi etal，2012)。
表现出拮抗相互作用的细菌被认为是潜在的生物防治剂。生物防治的机制通常归因于细菌产生抗真菌代谢物(芽孢杆菌素 (bacillaene)、艰难梭菌素(difficidin)、芬枯草菌素(fengycin)、巨型乳糖(macrolactin)、表面活性素等)、几丁质酶、铁载体、毒素等(Huang et al，2005；Tortora et al，2011；Raaijmakers and Mazzola，2012)。有趣的是，在抗真菌细菌中，很少有物种可以以增加真菌生物量为代价而生长并繁殖。这种相互作用被称为细菌性食菌(bacterial mycophagy)(Leveau and Preston，2008)。已报道细菌性食菌的最初直接证据之一是在存在三种常见沙丘土壤侵入真菌即球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)、黄色镰孢(Fusarium culmorum)、和冻土毛霉(Mucor hiemalis)的活跃生长的菌丝体的情况下，没有添加任何营养素的山冈单胞菌(Collimonas)可以在高压灭菌的土壤中生长 (
Figure BDA0001950174540000021
Ogawa et al，2009)。
伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia spp.)是在不同的栖息地中发现的杆状革兰氏阴性细菌。据报道，其中很少对植物和人类具有致病性；然而，还报道了具有促进植物生长、内生和抗真菌菌株的潜在活性的少数几种。最近，已经进行了来自水稻苗的细菌唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1的基因测序(Jha et al，2015)。立枯丝核菌 (Rhizoctoniasolani)是重要的土传真菌病原体之一，其是包括水稻在内的多种作物植物中几种经济上重要的疾病的致病因素(Zheng et al， 2013；Ghosh et al，2014；Hane et al，2014)。它被认为是水稻种植的墓场。然而，值得注意的是，已知包括伯克霍尔德氏菌、放线菌、芽孢杆菌、假单胞菌等在内的几种细菌物种是针对立枯丝核菌(R. solani)的抗真菌型的(Andersen et al，2003；Elshafie et al，2012；Huang et al，2012；Mela et al，2012)。
这些生物防治剂可潜在用于提供环境和生态友好的化学杀菌剂替代品，用于防治各种植物病；但是直接使用它们还有一些限制。一些生物防治细菌产生裂解化合物，如细胞外裂解酶、铁载体、水杨酸、抗生素和挥发性代谢物，如氰化氢(Nagarajkumar et al，2004；Manwar et al，2005；Compant et al，2005；Kishore et al，2005；Sharifi et al，2005；Afsharmanesh et al，2006)作为抗真菌剂。除此之外，许多新的抗真菌蛋白质，例如由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 产生的抑菌蛋白(Baciamin)(Wong et al，2008)、由枯草芽孢杆菌(B. subtilis)菌株B29产生的B29I(Li et al，2009)、由地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)产生的F2蛋白质(Tang-Bing et al，2012)、由大肠杆菌 BL21产生的PPEBL21蛋白质(Yadav et al，2012)和由枯草芽孢杆菌 B25产生的假定蛋白质(gi154685475)(Tan et al，2013)，证明了对各种植物病原体的抑制作用。
韩国公开申请KR 200641054涉及通过使用具有抗微生物活性的Bacoliellagladiolis菌株NIAB 131-133的培养液抑制炭疽病的方法，和使用该细菌菌株Bacillariagladiolis NIAB 131-133的培养液抑制致炭疽病真菌(胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides))的方法。所述细菌菌株对抗真菌菌株，但不是水稻植物和相关病特异的。
日本公开申请JP2010047532提供了一种使用伯克霍尔德氏菌属微生物作为植物病防治方法的新方法，其特征在于通过喷洒属于伯克霍尔德氏菌属的微生物并在植物叶子上表现出对植物病原体的抗菌作用，以及一种用于防治伯克霍尔德氏菌属的微生物的植物病防治方法。
然而，尽管进行了广泛的全球努力，迄今为止还没有确定由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病的完全抗病来源。此外，没有开发出针对立枯丝核菌的适当防治措施，其也可用于防治由立枯丝核菌在各种重要作物植物上引起的几种其他疾病。此外，除了立枯丝核菌，植物易于感染几种其他真菌病原体。以环境友好的方式防治它们仍然是一个挑战。因此，开发用于广谱抗真菌化合物的策略将有助于防治多种植物/作物的真菌病。
为克服上述问题，本发明提供了唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株 NGJ1的基因工程基因序列。由细菌过表达和纯化的蛋白质显示出抗立枯丝核菌的抗真菌活性。此外，所述纯化的蛋白质对包括稻瘟病菌、苹果黑星病菌(Venturia inaequalis)、芸苔链格孢(Alternaria brassiceae)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、Dedymella sp.、疫霉菌(Phytophthora sp.)、炭疽菌(Colletotrichum sp.)、Ascochyta rabiei、新壳梭孢(Neofusicoccum sp.)、链格孢(Alternaria sp.)、酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)和白色念珠菌(Candida albicans)的几种农业上重要的病原体表现出广谱的抗真菌活性。
发明内容
在本发明的一个实施方式中，提供了包含从唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1中提取的新基因的新蛋白质。编码该新蛋白质的核苷酸序列由序列SEQ ID No.1表示，新蛋白质的氨基酸序列由序列SEQ ID No.2表示。
在另一个实施方式中，所述核苷酸序列和所述氨基酸序列获自遗传工程改造的Bg_9562基因。在一个实施方式中，编码所述新蛋白质的核苷酸序列与SEQ ID No.1的核苷酸序列或SEQ ID No.2表示的氨基酸序列至少70％相同。在另一个实施方式中，SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少1至90个核苷酸取代、缺失和/或插入。在另一个实施方式中，SEQID NO：2的氨基酸序列具有至少1至30个氨基酸取代、缺失和/或插入。在另一个实施方式中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列改变11个氨基酸取代。
在一个实施方式中，新蛋白质适用于广谱抗真菌活性并用于蛋白质的大规模制备。在另一个实施方式中，新蛋白质的氨基酸序列长为111个氨基酸残基，分子量为～13kDa，pI约为4.65，pH最佳值约为7.4。
在另一个实施方式中，所述蛋白质适于抗真菌和食菌活性，其抑制真菌菌核(sclerotia)的生长并诱导真菌菌丝体中的细胞死亡。在另一个实施方式中，Bg_9562基因的抗真菌活性可用于防治由立枯丝核菌引起的水稻和其他作物的纹枯病。
在另一个实施方式中，提供了制备具有抗真菌活性的SEQ ID No.2的新蛋白质的方法。该方法包括以下步骤：(i)鉴定来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1的具有抗真菌和食菌活性的新蛋白质， (ii)通过人工合成步骤(i)中鉴定的蛋白质并在所鉴定的蛋白质中掺入(incorporate)所需的基因变化以通过基因合成合成基因，来进化(evolve)基因序列和蛋白质序列，(iii)在pET28a表达载体中过表达进化的蛋白质，(iii)通过Ni-NTA亲和层析纯化过表达的蛋白质，(iv)评估所述纯化蛋白质的抗真菌活性和(v)通过反向遗传学技术确立所述蛋白质的抗真菌性质。新蛋白质的重组表达防止真菌菌核的生长，诱导真菌菌丝体中的细胞死亡并治疗一些人/动物疾病。
在另一个实施方式中，提供了来自新肽的组合物。该组合物的组分包含选自杏仁油、菜籽油和芝麻油的油；选自蜂蜡、可可脂和乳木果油的增稠剂，选自醇类如鲸蜡醇的乳化剂；和水。
在另一个实施方式中，编码新肽的组合物适于产生广谱真菌病抗性，其中所述真菌选自由以下组成的组：立枯丝核菌、芸苔链格孢、稻瘟病菌、苹果黑星病菌、尖孢镰孢、Dedymella sp.、疫霉菌、炭疽菌、Ascochyta rabiei、新壳梭孢、链格孢、酿酒酵母和白色念珠菌。
在另一个实施方式中，提供了制备所述组合物的方法。该方法包括以下步骤：(i)通过使用生物反应器的发酵批量生产Bg_9562 蛋白质，(ii)通过基于壳聚糖或非壳聚糖的纳米颗粒封装获得的发酵产物；(iii)将步骤(ii)的封装产物用于开发水基或油基膏/软膏，和(iv)进一步开发步骤(iii)的产物以制备包含淀粉/油的抗真菌膜。
在另一个实施方式中，通过将包含SEQ ID NO：1或2的序列的多肽或组合物施用于受感染的植物、受感染的植物部分或受感染的作物、有真菌感染风险的人和动物，来提供防治植物或作物的真菌病的方法。
在另一个实施方式中，通过使用重组DNA技术在细菌、酵母、昆虫、植物、人或动物的细胞中表达其编码核苷酸来制备蛋白质。
附图说明
图1.唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1对立枯丝核菌的食菌和抗真菌行为。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1在共培养的3dpi(days post inoculation，接种后天数)期间抑制真菌生长(形成抑制区)。随后在8dpi(接种后天数)，发现细菌在整个真菌菌丝体上生长。在 PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板上观察到立枯丝核菌和NGJ1(单独) 的正常生长。在CDA(Czapek Dox琼脂)平板上，立枯丝核菌生长 (虽然很慢)覆盖整个平板，但NGJ1菌株显示出非常缓慢的生长。然而，在与真菌菌丝体对抗时，在CDA平板上的食菌行为(细菌在真菌上扩散和降解真菌菌丝体)非常多产。
图2.克隆和蛋白质纯化。(a)在pET28a表达载体中克隆的 Bg_9562基因的限制性消化构象，(b)通过Ni2+-NTA-琼脂糖层析(L1- 标记，L2-流过，L3-50mM洗涤，L4&L5-100mM咪唑纯化， L6&L7-200mM纯化)纯化过表达的蛋白质，(c)用抗-His-抗体对Bg_9562蛋白质进行Western印迹。
图3.Bg_9562蛋白质对菌核生长模式的影响。(a)用15μg/ml的 Bg_9562蛋白质以及不同的对照(缓冲液对照、50mM洗液和热灭活的蛋白质)处理立枯丝核菌菌核。描绘了处理后48小时在PDA平板上真菌生长的代表性图片。(b)经eBg_9562蛋白质处理的真菌生长抑制。15μg/ml的修饰蛋白质有效地防止立枯丝核菌在PDA平板上生长，而缓冲液处理的菌核显示出适当的生长。描绘了真菌生长在不同时间间隔的代表性图片。(c)用15μg/ml的Bg_9562蛋白质和 eBg_9562蛋白质处理菌核后立枯丝核菌在不同时间间隔的菌丝生长面积。将缓冲液、热灭活的Bg_9562和50mM洗液用作对照(eBg_9562蛋白质是进化的Bg_9562蛋白质)。(d)通过Bradford进行的蛋白质估计表明，与野生Bg_9562相比，eBg_9562蛋白质的产量增加。
图4.MTT测定揭示Bg_9562蛋白质诱导真菌中的细胞死亡应答。 (a)对用15μg/mlBg_9562蛋白质或PBS缓冲液处理后的立枯丝核菌菌核用MTT测定。对照中棕色色素的存在表明活细胞，而蛋白质处理的样品中缺乏颜色形成表明真菌中的细胞死亡。
图5.产生Bg_9562蛋白质制备缺陷的突变体唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(B.gladioli)。(a)将Bg_9562基因的部分基因片段克隆到pK18 mob载体中，图片描述了限制性消化后插入片段的释放(b)pK18 mob-9562质粒被动员到NGJ1基因组中，并在抗生素平板上选择重组体。使用基因特异性通过菌落PCR获得PCR扩增子。
图6.Bg_9562突变体和互补的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株的抗真菌活性。(a)发现Bg_9562的两个独立突变体(NGJ100，NGJ101) 在食菌活性方面存在缺陷，因为它们未能防止真菌生长。值得注意的是，用野生型NGJ1处理可以防止真菌菌核的生长。(b)在证明立枯丝核菌的抗菌/食菌活性方面，互补物NGJ102和NGJ103(表达 Bg_9562基因的全长拷贝于广泛的宿主范围质粒pHM1)优于 (proficient to)野生型NGJ1的水平。图片描绘了不同处理7天后的菌核生长。
具体实施方式
尽管本发明易于进行各种修改和/或替代方法和/或组合，但其具体实施方式已通过实施例和表格的方式显示，并将在下面详细描述。然而，应该理解的是，并不意图将本发明限制于所公开的特定方法和/或组合物，相反，本发明将涵盖落入由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。
已经在适当情况示出了实施例、表格和流程，仅示出了与理解本发明的实施方式相关的那些具体细节，以免使本公开内容被对于从本文描述受益的本领域普通技术人员很容易显而易见的细节不够突出。
以下描述仅是示例性实施方式，并不旨在以任何方式限制本发明的范围、适用性或配置。而是，以下描述提供了用于实现本发明的示例性实施例的方便说明。在不脱离本发明的范围的情况下，可以对所描述的元件的功能和布置进行所描述的实施方式的各种改变。
术语“包括”、“包含”或其任何其他变体旨在涵盖非排他性的包含，使得由“包括......”继续的一个或多个过程或组合物或系统或方法，在没有更多限制的情况下，不排除存在其他过程、子过程、组合物、子组合物、次要或主要组合物或其他元素或其他结构或另外的过程或组合物或附加元素或附加特征或附加特性或附加属性。
在本说明书和随后的权利要求中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：
必须注意，如说明书/说明书正文和所附权利要求和实施例中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该/所述”可包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。
范围在本文中可以表示为从“约”为一个特定值，和或“至约”为另一个特定值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和或到其他特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解该特定值形成另一方面。将进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点都是重要的，并且相对于另一个端点是独立的。
之前已经从健康水稻苗中分离出表现真菌活性的细菌唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1(Jha et al，2015)，并且可从Novagen(Merck Life Science Private Limited)商购获得的公开可用的表达载体pET28a 用于本发明中用于表达Bg_9562的新序列。因此，在本发明中充分描述了生物材料。
本发明提供了从唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1获得的能够具有广谱抗真菌活性的新基因和蛋白质，及其在pET28a表达载体中的表达。
如前所述，仍然需要对包括立枯丝核菌、稻瘟病菌、苹果黑星病菌和尖孢镰孢的几种农业上重要的病原体表现出广谱抗真菌活性的基因序列。此外，抗真菌活性对治疗由真菌引起的动物以及人类疾病一定是有用的。
定义：
如本文所用，当在本发明的上下文中使用时，术语“食菌行为”是指生物体消耗真菌的行为。
如本文所用，当在本发明的上下文中使用时，术语“抗真菌行为”是指治疗和预防真菌病，例如运动员脚、癣、念珠菌病(鹅口疮)、严重的全身性感染例如隐球菌性脑膜炎，以及其他针对真菌的疾病。
如本文所用，当在本发明的上下文中使用时，术语“突变体”是指由突变产生或显示突变的效果。
如本文所用，当在本发明的上下文中使用时，术语“插入诱变”是指通过插入一个或多个碱基对DNA的诱变。
如本文所用，当在本发明的上下文中使用时，术语“反向遗传学技术”是指通过分析特定工程化基因序列的表型效应来发现基因功能的技术。
一方面，本发明提供了从唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1中鉴定具有抗真菌和食菌活性的新蛋白质。
另一方面，本发明提供了潜在的抗真菌蛋白质的过表达和纯化。
另一方面，本发明提供了评估新蛋白质的抗真菌活性的方法。本发明的又一方面提供了通过反向遗传学技术确立抗真菌蛋白质的作用。
在一个实施方式中，本发明涉及能够具有广谱抗真菌活性的新的基因和蛋白质。表达来自细菌唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1的该新蛋白质的新基因表现出食用真菌(食菌)性质。编码该新蛋白质的核苷酸序列由序列SEQ ID No.1表示，所述新蛋白质的氨基酸序列由序列SEQ ID No.2表示。
在另一个实施方式中，本发明提供新的遗传工程改造的Bg_9562 基因的核苷酸序列和肽序列，所述基因具有强的抗真菌活性，可进一步抑制真菌菌核的生长、诱导真菌菌丝体中的细胞死亡并治疗人/ 动物的真菌感染。
在一个实施方式中，编码该新蛋白质的核苷酸序列与SEQ ID No.1的核苷酸序列或SEQ ID No.2表示的氨基酸序列至少70％相同。在另一个实施方式中，SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少1至90 个核苷酸的取代、缺失和/或插入。在另一个实施方式中，SEQ IDNO： 2的氨基酸序列具有至少1至30个氨基酸取代、缺失和/或插入。在另一个实施方式中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少2至20个氨基酸取代、缺失和/或插入。在另一个实施方式中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少2至15个氨基酸取代、缺失和/或插入。在另一个实施方式中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少5至15个氨基酸取代、缺失和/或插入。在另一个实施方式中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列改变了11个氨基酸取代。在另一个实施方式中，在SEQ ID no.2的氨基酸序列中取代了至少一个以上的亮氨酸、缬氨酸和/或异亮氨酸残基。
在一个实施方式中，与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌野生型菌株相比，新蛋白质赋予提供改善的抗真菌效力、加宽的抗真菌谱、改善的溶解性、改善的热稳定性和改进的重组制备。在一个实施方式中，新蛋白质适于广谱抗真菌活性并进行大规模蛋白质制备。在另一个实施方式中，氨基酸序列长为111个残基，分子量为～13kDa，pI约为4 并且pH约为7.4。
在本发明的一个实施方式中，通过插入诱变的Bg_9562基因的突变导致细菌唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1的抗真菌活性和食菌活性的丧失。在另一个实施方式中，Bg_9562基因的抗真菌活性可用于防治由立枯丝核菌引起的水稻和其他作物的纹枯病。
在本发明的另一个实施方式中，插入基因的全长拷贝可以补充缺陷并恢复抗真菌和食菌活性。本发明的另一个方面提供了编码抗真菌蛋白质的Bg_9562基因，该抗真菌蛋白质可以潜在地用于防治真菌病。在本发明的另一个实施方式中，Bg_9562的抗真菌活性特别针对在水稻中引起纹枯病的立枯丝核菌菌核。在本发明的另一个实施方式中，Bg_9562在立枯丝核菌菌核中诱导细胞死亡应答。
在本发明的另一个方面，新的核苷酸序列和肽序列适于防治由立枯丝核菌对水稻(纹枯病)以及其他作物所导致的疾病(大豆/番茄立枯病(damping off)；马铃薯黑痣病(black scurf)；甜菜根腐病(root rot)；黄瓜腹腐病(belly rot)；谷物的斑块(bairpatch))、水稻的真菌病 (纹枯病以及稻瘟病)、植物的真菌病(如表1所示)，并用于治疗人/动物的真菌感染。例如，治疗人/动物的念珠菌病。在本发明的另一方面，新的核苷酸和蛋白质适合用作用于各种应用的喷雾或软膏，用作转基因用于开发广谱真菌病抗性水稻以及其他重要作物、工程化改造水稻以及其他作物抗立枯丝核菌感染的抗病性。另外，转基因可用于提供抗其他真菌病原体感染的抗病性。
表1：用于测试Bg_9562蛋白质的抗真菌活性的真菌列表
Figure BDA0001950174540000101
Figure BDA0001950174540000111
在另一个实施方式中，本发明进一步提供了制备具有抗真菌活性的SEQ ID No.2的新蛋白质的方法。该方法包括以下步骤：(i)鉴定来自唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株的具有抗真菌活性和食菌活性的蛋白质，(ii)通过发现对抗真菌和规模制备关键的残基来分析步骤 (i)中鉴定的蛋白质的基因和蛋白质序列并通过基因合成来人工合成，(iii)在pET28a表达载体中过表达进化的蛋白质，(iii)通过Ni-NTA 亲和层析纯化过表达的蛋白质，(iv)评估纯化的蛋白质的抗真菌活性和(v)通过反向遗传学技术确立抗真菌蛋白质。新蛋白质的重组表达防止真菌菌核生长并诱导真菌菌丝体的细胞死亡。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种包含新的肽的组合物，用于使用和开发基于水或油的软膏或纳米封装的喷雾或抗真菌膜。该组合物的组分包含选自杏仁油、菜籽油和芝麻油的油；选自蜂蜡、可可脂和乳木果油的增稠剂，选自包含醇类如鲸蜡醇的组的乳化剂；和水。
在另一个实施方式中，所述组合物适于开发广谱真菌病抗性，其中所述真菌选自包含下述的组：立枯丝核菌、芸苔链格孢、稻瘟病菌、苹果黑星病菌、尖孢镰孢、Dedymellasp.、疫霉菌、炭疽菌、 Ascochyta rabiei、新壳梭孢、链格孢、酿酒酵母和白色念珠菌。
在另一个实施方式中，提供了制备所述组合物的方法。该方法包括以下步骤：(i)通过使用生物反应器发酵批量制备Bg_9562蛋白质，(ii)通过基于壳聚糖或非壳聚糖的纳米颗粒封装获得的发酵产物；(iii)将步骤(ii)中的封装产物开发水基或油基膏/软膏，和(iv) 进一步开发步骤(iii)中的产物以制备包含淀粉/油的抗真菌膜。
在另一个实施方式中，通过将包含SEQ ID NO：1或2的序列的多肽或权利要求12-13中任一项的组合物施用于有真菌感染风险的受感染的植物、受感染的植物部分或受感染的作物，来提供防治植物或作物的真菌病的方法。该方法还治疗人和动物。在另一个实施方式中，所述植物是谷类、瓜类、蔬菜、根茎类蔬菜或豆类，或制备水果作物。在另一个实施方式中，所述植物或作物选自由水稻、大豆、番茄、马铃薯、甜菜、甘蔗、黄瓜、苹果、芒果、菜豆、烟草、香蕉、豆类和鹰嘴豆组成的组。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含编码新肽的基因的组合物，其用于开发具有广谱抗病性的转基因植物(包括稻)。该组合物用于发展水稻对纹枯病的抗性(由立枯丝核菌引起)。此外，转基因水稻也会对稻瘟病(由稻瘟病菌引起)产生抗性，因为蛋白质也显示出对稻瘟病菌的抗真菌活性(如表1所示)。该组合物还可治疗人/动物的真菌感染。
在另一个实施方式中，提供了防治抗真菌病的方法。该方法包括以下步骤：(i)将纯化的Bg_9562蛋白质喷洒在受感染的植物上，并将纯化的蛋白质的纳米封装形式喷洒到受感染的植物/田地上；(ii) 将抗真菌膏直接施用于疾病病变以防治动物/人真菌感染，并将抗真菌膜用作伤口敷料以防治真菌感染。
在本发明的另一方面，提供了Bg_9562基因突变序列的非天然存在的新的蛋白质或多肽。通过抑制真菌菌核生长和诱导真菌菌丝体中的细胞死亡，新的蛋白质或多肽适于表现出抗真菌活性。更具体地，提供了人工开发的Bg_9562基因的新核苷酸序列及其多肽或蛋白质。
在本发明的另一个实施方式中，提供了防治水稻以及其他作物的纹枯病的方法，防治水稻真菌病的方法，防治植物真菌病的方法，治疗人/动物真菌病的方法。
在本发明的另一个方面，用于开发用于各种应用的喷雾或软膏的方法，转基因用作开发抗真菌病原体的抗病性的方法，防治水稻纹枯病的方法，以及用于开发广谱的真菌病抗性植物的其他重要作物。
在另一个实施方式中，通过使用重组DNA技术在细菌、酵母、植物、人和动物的细胞中在同源或异源系统中表达其编码核苷酸来产生蛋白质。
实施例：
以下描述仅是示例性实施方式，并不旨在以任何方式限制本发明的范围、适用性或配置。相反，以下描述提供用于实现本发明的示例性实施例的方便说明，可以是在不脱离本发明的范围的情况下，可以对所述元件的功能和布置进行对所描述的实施例的各种改变。
实施例1：鉴定涉及唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1的抗真菌和食菌活性的蛋白质
本实施例提供了将源自健康水稻苗的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1鉴定(如Jha et al 2015所述)为有效的抗真菌和食菌细菌。最初，高达3dpi(温育后数天)，所述细菌显示出抗真菌活性并防止其附近真菌的生长。在对抗的8dpi(温育后数天)期间，细菌开始在真菌上觅食并显示出食菌活性(如图1所示)。有趣的是，在最低培养基CDA(Czapek Dox琼脂)平板上，食菌行为(细菌在真菌上扩散和降解真菌菌丝体)非常多产。
发明人已经发现唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1的一些蛋白质具有靶向宿主的潜在信号，并且进一步表征了这种蛋白质之一 (Bg_9562)可能编码噬菌体尾部蛋白质。研究了鉴定蛋白质在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1对立枯丝核菌的食菌和抗真菌行为方面的作用。
修饰Bg_9562的一些被选定的核苷酸序列以人工合成具有 333bp的SEQ ID No.1的进化基因(eBg_9562)序列。
Bg_9562(核苷酸序列)：原始
Figure BDA0001950174540000141
SEQ ID No.1(进化的-Bg_9562的核苷酸序列)
Figure BDA0001950174540000142
提供了由111个氨基酸组成的具有SEQ ID No.2的上述新蛋白质的进一步新的肽序列。
Bg_9562(氨基酸序列)：原始
Figure BDA0001950174540000143
SEQ ID No.2(进化的-Bg_9562的氨基酸序列)
Figure BDA0001950174540000144
从亲本蛋白质突出显示的变化适用于进化的Bg_9562的大规模制备、改善的溶解度和抗真菌活性。
实施例2：潜在的抗真菌蛋白质的过表达和纯化
使用如表2所公开的具有SEQ ID No.3的基因特异性正向引物和具有SEQ ID No.4的反向引物，从唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1 基因组DNA中PCR扩增Bg_9562基因(333bp)的完整CDS，并进一步克隆到pET28a细菌表达载体(Novagen/Merck Life SciencePrivate Limited)中以获得pET28a-9562(如图2a所示)。已将NdeI 和HindIII的限制性位点分别加入正向和反向引物序列中。
在序列验证后，将pET28a-9562转化到大肠杆菌(BL21菌株， DE3-密码子+)中以制备重组蛋白质。用蛋白质Ni2+-NTA-琼脂糖层析纯化蛋白质并在SDS PAGE上分析(如图2b所示)。进一步将其电印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并用针对抗His-抗体产生的小鼠多克隆抗体(1∶1000稀释度)进行探测。～13KDa条带的存在表明所需蛋白质的过表达和纯化(如图2c所示)。
表2：引物序列
Figure BDA0001950174540000151
*引物使用IDT(Integrated DNA technologies，Inc，USA； https：//eu.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)的PrimerQuest Tool设计并由EurofinsGenomics India Pvt.Ltd.，Bangalore，India合成。为了克隆目的，在所选引物的5′末端掺入合适的限制性位点(标记为下划线)，以使它们成为性质上是合成的引物。
实施例3：评估纯化蛋白质的抗真菌活性
通过用不同浓度(5、10和15μl/ml)的纯化蛋白质处理立枯丝核菌菌株BRS1菌核来测定具有SEQ ID No.2的蛋白质的抗真菌活性。作为对照，用三种不同的溶液——10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS) pH 7.4、50mM洗液(蛋白质溶出中使用的一种组分)和热灭活的 Bg_9562蛋白质(通过在沸水中温育40分钟)处理所述菌核。处理后，将所述菌核放置在PDA(HIMEDIA，印度)平板，在28℃温育进一步生长。结果(如图3a所示)总结，15μg/ml的蛋白质有效防止立枯丝核菌的生长，而在不同对照的情况下观察到适当的真菌生长。eBg_9562蛋白质处理对真菌生长的抑制总结在图3b中。 eBg_9562处理的菌核未能生长，而对照菌核表现出适当的生长。此外，在不同的时间间隔(例如24h、48h和72h)，测量了Bg_9562 以及与各种对照处理样品一起处理的eBg_9562蛋白质在PDA平板上的菌丝体区域的菌核生长，并且数据总结在图3c中。总体而言，数据清楚地表明，与Bg_9562相比，eBg_9562在预防真菌生长方面更有效。进一步，表3表示了显示经各种处理的真菌生长抑制的比较的制表数据(在图3c中指出)。
表3：经各种处理的真菌生长抑制
Figure BDA0001950174540000161
表3描述了在用进化的Bg_9562处理后生长72小时后，真菌显示零生长，而用野生型Bg_9562蛋白质处理的真菌在处理72小时后显示出0.69cm2的生长。特别是各种对照处理不会抑制真菌的生长。因此，本发明提供了具有能够广谱抗真菌活性的新的基因和蛋白质。所述新的基因和蛋白质从唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1获得并在pET28a表达载体中表达。eBg_9562是有效的，并且即使在各种条件下处理72小时后也提供零抗真菌活性(如图3c所示)。通过 Bradford在图3d中的蛋白质估计数据证实，蛋白质的修饰导致蛋白质制备增加。该图显示，eBg_9562的蛋白质浓度接近20mg/L，相比之下，野生Bg_9562产生的蛋白质浓度低于10mg/L。
此外，立枯丝核菌菌核最初在PDB培养基中生长48小时以具有发芽菌丝体，然后用15μg/ml Bg_9652蛋白质和10mM PBS缓冲液 (作为对照)处理。在28℃进一步温育后，按照所述方案(Meshulam et al，1995)对处理过的和对照的菌丝体进行MTT测定。MTT测定结果表明蛋白质处理可以诱导细胞死亡，因为没有有色化合物的形成(如图4a所示)。由于活性代谢，在对照菌丝体的情况下检测到有色化合物的形成(如图4a所示)。
实施例4：通过反向遗传学技术确立抗真菌蛋白质的作用。
为了表明SEQ ID No.2蛋白质确实参与了唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1的抗真菌和食菌行为，我们采用了反向遗传学技术。为此，通过使用如表1中公开的具有SEQ IDNo.5的正向引物和具有 SEQ ID No.6的反向引物将209bp的野生型Bg_9562基因克隆到pK18 mob载体中来获得pGD1质粒(
Figure BDA0001950174540000171
A et al，1994)。通过使用公开的方案(
Figure BDA0001950174540000172
A et al，1990)将所述pGD1动员到唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1中，并且对含有卡那霉素(50μg/μl)的PDA平板进行Δ9562插入突变体(NGJ100和NGJ101)的选择。通过PCR 和测序确认Δ9562插入突变细菌(如图5a&5b所示)。
进一步为了互补，通过使用如表2中公开具有SEQ ID No.7的正向引物和具有SEQID No.8的反向引物从NGJ1基因组扩增全长的所述基因，并克隆到pHM1载体中。将pHM1-9562质粒电穿孔到NGJ100 和NGJ101菌株中，并在KBA平板上选择阳性KanR和SpecR菌落。通过PCR和测序进一步证实含有NGJ100和NGJ101的pHM1-9562 互补质粒(NGJ102和NGJ103)。
之后，测试Bg_9562突变体(NGJ100和NGJ101)和互补的(NGJ102和NGJ103)，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株对立枯丝核菌的抗真菌和食菌活性。突变细菌未能表明抗真菌和食菌活性(如图6a 所示)。用Bg_9562突变体(NGJ100和NGJ101)、互补物(NGJ102 和NGJ103)和野生型NGJ1(WT)的细菌培养物在28℃单独处理真菌菌核4小时，然后在PDA平板上培养7天(如图6b所示)。
实施例5：蛋白质表明广谱抗真菌活性
还测试了纯化蛋白质对各种真菌的影响，包括几种农业上重要的真菌病原体(如表1所示)和如说明书的图3和表3所示的实验数据。
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序列表
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苏尼尔·库马尔·亚达夫
古帕吉·杰哈
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<130> 5467IN001
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<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 333
<212> DNA
<213> 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1（Burkholderia gladioli strain NGJ1）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(333)
<400> 1
atgaacacgg aaaaccagga tccgacgagc accagcgaca acgccgcgaa cacgcacacg 60
ctcgacacgc cgctcgcgcg cggcgagcag acgatcaccc aggtgacgct ggccaagccc 120
gatgccggcg cgctgcgcgg cacctcgctg tcggcgctcg tcaacctcga cgtcgacgcg 180
ctgtgcaagg caactccgcg cgctacgagc ccggcggtca ccgcggccga catccgcgcc 240
atggaccccg ccgacgcaat ctcggtcgga ggcatcttcg ccggttttgt tatgccgaag 300
tcgatcaaag cgagcatgga atccccgagc gcg 333
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1（Burkholderia gladioli strain NGJ1）
<220>
<221> PRT
<222> (1)..(111)
<400> 2
Met Asn Thr Glu Asn Gln Asp Pro Thr Ser Thr Ser Asp Asn Ala Ala
1 5 10 15
Asn Thr His Thr Leu Asp Thr Pro Leu Ala Arg Gly Glu Gln Thr Ile
20 25 30
Thr Gln Val Thr Leu Ala Lys Pro Asp Ala Gly Ala Leu Arg Gly Thr
35 40 45
Ser Leu Ser Ala Leu Val Asn Leu Asp Val Asp Ala Leu Cys Lys Ala
50 55 60
Ile Pro Arg Ala Thr Ser Pro Ala Val Thr Ala Ala Asp Ile Arg Ala
65 70 75 80
Met Asp Pro Ala Asp Ala Ile Ser Val Gly Gly Ile Phe Ala Gly Phe
85 90 95
Val Met Pro Lys Ser Ile Lys Ala Ser Met Glu Ser Pro Ser Ala
100 105 110

Claims (11)

1.一种具有广谱抗真菌活性的新蛋白质，其中所述新蛋白质的多肽序列为SEQ IDNo.2，该序列由核苷酸序列SEQ ID No.1编码。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述新蛋白质具有广谱抗真菌活性并且所述蛋白质适合大规模制备。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述SEQ ID NO.2的氨基酸序列长为111个氨基酸残基，分子量至少为～13kDa，pI约为4.65，pH最佳值约为7.4。
4.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质适于广谱抗真菌和食菌活性，其抑制真菌生长并诱导真菌菌丝体中的细胞死亡。
5.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质适于防治作物的真菌病。
6.根据权利要求5所述的蛋白质，其中所述真菌病是由立枯丝核菌引起的水稻的纹枯病。
7.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质使用重组DNA技术在细菌、酵母、昆虫、植物、人或动物的细胞中表达其编码核苷酸来制备。
8.一种制备由序列SEQ ID No.2表示的具有抗真菌活性的新蛋白质的方法，其中该方法包括以下步骤：
(i)鉴定来自野生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌株NGJ1的具有抗真菌活性和食菌活性的由Bg 9562基因编码的蛋白质，
(ii)通过发现与抗真菌活性以及规模制备相关的关键残基来分析鉴定的蛋白质的氨基酸序列，并人工设计基因序列以在步骤(i)中鉴定的蛋白质中掺入所需变化并通过基因合成合成所设计的基因，
(iii)在表达载体中过表达步骤(ii)中的进化的蛋白质以获得重组蛋白质，
(iv)通过层析纯化步骤(iii)中过表达的蛋白质，
(v)评估步骤(iv)的纯化蛋白质的所述抗真菌活性，和
(vi)通过反向遗传学技术确立抗真菌活性的蛋白质作用从而从Bg_9562获得新蛋白质。
9.一种从权利要求1所述的新蛋白质制备的具有抗真菌活性的组合物，其中所述组合物还包含选自杏仁油、菜籽油和芝麻油组成的组的油；选自蜂蜡、可可脂和乳木果油的增稠剂，选自包含醇类如鲸蜡醇的组的乳化剂；和水。
10.根据权利要求9所述的组合物，用于广谱真菌病防治，其中所述真菌选自由以下组成的组：立枯丝核菌、芸苔链格孢、稻瘟病菌、苹果黑星病菌、尖孢镰孢、Dedymella sp.、疫霉菌、炭疽菌、Ascochyta rabiei、新壳梭孢、链格孢、酿酒酵母和白色念珠菌。
11.一种制备具有抗真菌活性的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)通过在生物反应器中发酵批量制备由序列SEQ ID No.2表示的进化的Bg_9562蛋白质；
(ii)在基于壳聚糖或非壳聚糖的纳米颗粒中封装步骤(i)的发酵产物；
(iii)使用步骤(ii)的封装产物开发水基或油基膏/软膏；和
(iv)将步骤(iii)的产物转化为由淀粉/油制成的包含抗真菌肽的膜。
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