KR102353992B1 - 항균 및 항바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 nibr k9 균주, 동 균주에서 분리된 항균 및 항바이러스 펩타이드, 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균 및 항바이러스용 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주, 및 그 배양액과, 본 균주에서 분리된 항균 또는 항바이러스 펩타이드는 우수한 항균 및 항바이러스 활성을 나타내며, 유해 세균 및 바이러스에 의해 발생하는 다양한 감염증에 적용이 가능하다.
또한, 본 발명의 조성물은 의약, 건강기능식품, 또는 사료 보존제 등의 다양한 분야에서 항균 및 항바이러스 목적으로 유용하게 이용가능하다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주, 및 그 배양액과, 본 균주에서 분리된 항균 또는 항바이러스 펩타이드는 우수한 항균 및 항바이러스 활성을 나타내며, 유해 세균 및 바이러스에 의해 발생하는 다양한 감염증에 적용이 가능하다.
또한, 본 발명의 조성물은 의약, 건강기능식품, 또는 사료 보존제 등의 다양한 분야에서 항균 및 항바이러스 목적으로 유용하게 이용가능하다.
Description
본 발명은 항균 및 항바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 NIBR K9 균주, 동 균주에서 분리된 항균 및 항바이러스 펩타이드, 및 이의 용도에 관한 것이다.
생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다. 지금까지 수많은 생리 활성 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 항균 및 항진균 물질에 관한 연구는 생명과학 및 의학 분야에서 매우 중요한 영역이다.
모든 생명체는 생존을 위하여 항균 및 항진균 물질을 생산하는 것으로 알려져 있는데, 항균 및 항진균 물질을 생산하는 미생물에 대해서 많은 연구가 이루어지고 있으며, 항균 및 항진균 물질을 생산하는 미생물 또는 이들에게서 분리된 물질을 이용해 항균제를 개발하려는 연구들이 오래전부터 시도되고 있다.
한편, 유산균(lactic acid bacteria)은 당을 발효시켜 유산을 생성하는 간균으로, 우리 몸을 건강하게 도와주는 유용물질을 생산하고, 면역증강, 항산화, 항균, 항콜레스테롤, 항비만, 발암 및 변이 물질의 생성을 방지하는 기능 등을 갖는 것으로 알려져 있다.
유산균이 생성하는 항균성 대사산물로는 유기산(Organic acids), 과산화수소(hydrogen peroxide), 디아세틸(diacetyl), 베타-하이드록시프로피온알데하이드(b-hydroxypropionaldehyde), 박테리오신(bacteriocins) 등이 보고된 바 있다(Adams and Hall 1988; 1993; Plockova 1997). 그 중 박테리오신은 다른 항생제와 구별되는 항균활성을 갖는 천연물질로서 그람양성균과 그람음성균의 생육에 영향을 미치는 단백질성 항생물질로 알려져 있다(Abdel-Bar 1987, ten Brink 1994). 각종 병원균과 유해미생물에 대한 유산균의 항균작용에 관한 많은 연구가 국내외적으로 계속되고 있으나(Fank 1991, Gilliland and Speck 1977, Lewus 1991, Kim 1997), 아직까지 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을만큼 강력한 항균 활성을 갖는 유산균은 많지 않으며, 유산균의 발효산물 중 어떤 물질이 인체에 유익한 작용을 하는지 명확히 규명되어 있지 않다(Mcfarland and Elmer 1995, Sanders 1999).
또한, 식품에서 유산균은 발효식품의 맛과 발효산물의 특징을 결정하고, 유기산 및 박테리오신 등의 항균활성을 갖는 물질을 생성하여 식품의 저장성에 기여한다. 박테리오신은 다양한 그람 양성균에서 생산되는 항균 활성 단백질 또는 펩타이드이며, 유산균에서 유래한 박테리오신의 경우 식품산업에서 천연보존제(natural preservative)로 이용할 수 있는 응용성과 항생제를 대체할 수 있는 물질로서 관심을 끌고 있다. 클라엔하머(Klaenhammer)는 유산균이 생산하는 박테리오신을 분자구조 및 생리학적 특성에 따라 다음과 같이 분류하였다.
Class I 박테리오신(lantibiotics)은 번역후 변형(post-translational modification) 결과 란티오닌(lanthionine)과 같은 특이 아미노산을 포함한다. Class II 박테리오신은 란티오닌을 함유하지 않는 박테리오신으로 분자량이 작고(<13 kDa), 작은 분자량으로 인하여 3차 구조를 형성하지 않으므로 비교적 열에 안정하고, 일반적으로 20개 정도의 소수성 아미노산으로 이루어진 막전위 헬릭스(transmembrane helix) 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. Class III 박테리오신은 분자량이 크고(>30 kDa), 열에 불안정한 항균활성 단백질이다.
그 예로, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)가 생산하는 니신(nisin)은 Class I 유형에 속하며 비교적 넓은 항균 스펙트럼(antimicrobial spectrum)을 가지고 대부분의 그람 양성균의 증식을 억제한다. 니신(Nisin)은 열에 안정하고 낮은 pH 조건에서도 활성을 나타내며 천연 식품보존제로 사용되고 있다.
또한, 대부분의 박테리오신의 활성은 약산성에서 강하고 염기성 환경에서 불안정한 것으로 알려져 산을 생성하는 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 배양액으로부터 박테리오신의 생산 여부를 알아보기 위해 광범위하게 적용할 수 있는 실험적 방법의 확립에 어려움이 있었다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 우수한 항균 활성을 갖는 유산균 균주를 발굴하기 위해 예의 노력한 결과, 신균주 락토바실러스 플란타룸 NIBR K9 균주가 우수한 항균 활성을 갖는 동시에 항균 활성을 갖는 박테리오신과 항바이러스 활성을 갖는 항바이러스 펩타이드를 분비하는 효능이 있어, 항균제, 항바이러스제, 건강기능식품, 식품보존제, 사료첨가제 등에 유용하게 활용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주와 동 균주에서 유래한 항균 및 항바이러스 펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주, 또는 동 균주에서 유래한 항균 및 항바이러스 펩타이드를 이용한 항균 및 항바이러스 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14385BP로 수탁된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주를 제공한다.
본 발명의 용어 "락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주"는 흰점박이꽃무지(굼벵이)의 장에서 본 발명자들에 의해 새롭게 분리 동정된 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주로서, 본 명세서에서는 "NIBR-K9 균주", "NIBR K9 균주" 또는 "K9 균주"와 혼용하여 사용되며, 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP) 및 이의 배양액은 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명자들은 신규 항균제의 개발을 위해 유산균의 항균 효과에 대해 수년간 조사 분석하였고, 선행등록특허 제10-2052056호의 우수한 항균 활성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 NIBR97 균주를 분리 동정하여 민간에 이전함으로써 산업계의 일부 요구를 충족시킨바 있다. 이후에도 산업 현장에서 우수한 항균 및 항바이러스 활성을 갖는 유산균 균주에 대한 수요는 지속해서 요구되고 있으며, 본 발명자들은 종래 개발하였던 NIBR97 균주의 항균 활성을 뛰어넘는 우수한 균주를 개발하기 위해 불철주야 노력하였다.
이 과정에서 본 발명자들은 흰점박이꽃무지(굼벵이)의 장내 균총에서 분리된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주의 배양액이 NIBR97 균주와 비교하여 동등 이상의 우수한 항균 활성을 갖는 것을 확인하였다(도 1 참조).
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP) 및 이의 배양액은 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 항균 효과가 검증된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP)의 배양액으로 박테리오파아지 phi6 및 Infuenza A 바이러스에 대한 우수한 항바이러스 활성을 검증한바 있다(도 2 및 도 3 참조). 또한, NIBR97 균주와 비교하여 동등 이상의 내산성 및 내담즙성을 보유하고 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 및 상기 배양액의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효용 스타터(starter)를 제공한다.
본 발명에서 상기 발효용 스타터란 발효에 관여하는 유산균 또는 세균 등을 포함하는 미생물, 이의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 제제 또는 조성물을 의미하며, 발효용 스타터는 발효식품 등의 생산에 첨가하여 발효식품에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 발효용 스타터를 사용하여 발효식품을 제조하는 경우, 상기 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여 발효식품의 품질을 일정하게 조절하거나, 발효의 속도 또는 단계를 조절할 수 있으며, 특정한 목적을 달성한 발효식품을 제조할 수 있다. 또한, 상기 발효용 스타터에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주는 병원성 미생물에 대한 항균 활성이 우수하고, 우수한 항바이러스 활성을 나타내며, 식약처에서 식용곤충으로 인정한 흰점박이꽃무지(굼벵이)의 장에서 분리되어 인체에 무해하므로, 안전한 발효식품 제조에 있어서 발효용 스타터로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP) 또는 상기 발효용 스타터를 이용하여 생산된 발효식품을 제공한다.
상기 발효식품이란, 유산균이나 효소 등 미생물을 하나 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP) 또는 상기 발효용 스타터를 원재료에 접종하는 단계를 포함하는 발효식품 제조방법을 제공한다. 상기 발효식품 제조방법은 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품의 제조방법일 수 있으며, 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP) 또는 발효용 스타터를 접종하여 발효식품의 제조에 활용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주 또는 그 배양액은 그 자체로 항균 및 항바이러스 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
상기 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주 또는 그 배양액은 다양한 세균류 또는 진균류에 대해 항균 활성이 있으며, 구체적으로는 에스체리치아 속 균주, 스타필로코코스 속 균주, 살모넬라 속 균주, 스트렙토코커스 속 균주, 파스퇴렐라 속 균주, 에드워드시엘라 속 균주 등에 항균 활성이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주 또는 그 배양액의 추출물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로 산을 첨가함으로써 염을 형성할 수 있고, 예를 들어 무기산(예: 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산 등), 유기 카르복실산(예: 아세트산, 트리플루오로아세트산과 같은 할로 아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 살리실산), 및 산성 당(글루쿠론산, 갈락투론산, 글루콘산, 아스코르브산), 산성 폴리사카리드(예: 히알우론산, 콘드로이틴 술페이트, 아르기닌산), 콘드로이틴 술페이트와 같은 술폰산 당 에스테르를 포함하는 유기 술폰산(예: 메탄, 술폰산, p-톨루엔 술폰산) 등을 첨가하여 염을 형성할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주 또는 그 배양액은 식용 가능한 흰점박이꽃무지(굼벵이)의 장에서 분리된 유산균의 일종으로 임상투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 NIBR-K9 균주 또는 그 배양액은 실제로 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 NIBR-K9 균주 또는 그 배양액은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 NIBR-K9 균주 또는 그 배양액의 유효용량은 0.01 내지 10 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 또는 그 배양액은 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신균주 NIBR-K9 또는 그 배양액의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 그 배양액, 또는 그 추출물은 우수한 항균 및 항바이러스 활성을 나타내어 병원성 세균 및 바이러스에 대한 질병의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 또는 그 배양액이 갖는 "항균" 및 "항바이러스" 효과는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항균 및 항바이러스용 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.04 중량부, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스용 사료첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 그 배양액, 또는 그 추출물은 우수한 항균 및 항바이러스 활성을 나타내어 병원성 세균 및 바이러스에 대한 질병의 예방 또는 개선을 위한 사료첨가제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 또는 그 배양액이 갖는 "항균" 및 "항바이러스" 효과는 상기에서 설명한 바와 같다.
특히, 본 발명의 사료 첨가제는 축산 현장에서 직접 채취한 고병원성 살모넬라 균주에 대해 강력한 항균 활성을 가지므로, 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 세균성 질환을 예방할 수 있고, 이미 발생한 세균성 질환을 개선시킬 수 있다. 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분 함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며, 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료 또는 섬유질사료가 사용가능하다.
상기 사료첨가제는 추가적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있으며, 예를 들어, 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있다. 또한, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP)에서 유래하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP4와 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP12를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP)에서 유래하고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 항바이러스 펩타이드 AVP2를 제공한다.
본 발명에서 용어, “펩타이드(peptide)”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, 유해 세균 또는 바이러스에 대해 높은 항균력 및 항바이러스 효과를 나타내는 펩타이드를 의미한다.
본 발명에서, 상기 항균 펩타이드 AMP4 및 AMP12는 항균, 및 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하며, 상기 항바이러스 펩타이드 AVP2는 항바이러스 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 펩타이드는 효과적으로 세포 내로 들어가기 위해 내재화 서열 혹은 단백질 변환 도메인에 연결될 수 있다.
최근의 연구 보고에 의하면 다양한 세포 내재화 서열, 예를 들어, HIV 바이러스의 TAT 전이활성 도메인, 안테나페디아(antennapedia) 등을 원형질막을 가로질러 수송할 수 있는 트랜스포탄(transportan)이 알려져 있다. 또한, 폴리아르기닌은 원형질막을 가로질러 펩타이드와 단백질을 훨씬 더 효율적으로 수송함으로써 펩타이드를 세포 내로 수송하는 매력적인 도구로 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 세포 내재화 수송물질 또는 서열을 포함할 수 있다. 세포 내재화 서열은 공지되어 있거나 새롭게 당해 기술 분야에서 발견된 임의의 내재화 서열, 또는 그것의 보존성 변이체일 수 있다. 세포 내재화 수송물질 및 서열의 비-제한적인 예로는 폴리아르기닌(예컨대 R9), 안테나페디아 서열, TAT, HIVTat, 페네트라틴(Penetratin), Antp-3A(Antp 돌연변이체), Buforin II, 트랜스포탄, MAP(모델 양친매성 펩티드), KFGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC(비스-구아니디니움-스퍼미딘-콜레스테롤) 및 BGTC(비스-구아니디니움-트렌-콜레스테롤)가 포함된다.
추가로, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 캡핑 모티브(capping motif), 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 추가의 아미노산 서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 이펙터(effectors), 약물, 프로드럭, 독소, 펩타이드, 전달 분자 등의 커플링 파트너와 연결될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로 산을 첨가함으로써 염을 형성할 수 있고, 예를 들어 무기산(예: 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산 등), 유기 카르복실산(예: 아세트산, 트리플루오로아세트산과 같은 할로 아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 살리실산), 및 산성 당(글루쿠론산, 갈락투론산, 글루콘산, 아스코르브산), 산성 폴리사카리드(예: 히알우론산, 콘드로이틴 술페이트, 아르기닌산), 콘드로이틴 설페이트와 같은 술폰산 당 에스테르를 포함하는 유기 술폰산(예: 메탄, 술폰산, p-톨루엔 술폰산) 등을 첨가하여 염을 형성할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 상세하게는 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등과 같은 화학적 합성 또는 단백질 발현 시스템을 이용한 유전공학적 방법 등으로 제조될 수 있고, 펩타이드의 제조방법과 관련된 통상적인 화학적 합성 방법은 당업계에서 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1 내지 3으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 발현벡터, 및 숙주세포를 이용하여 유전공학적 방법을 통해 생산될 수 있다.
본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in-frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 따라 증가될 수 있다.
발현벡터는 통상의 모든 발현벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pUC18, pIDTSAMRT-AMP 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 이러한 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.
또한, 본 발명에서 용어, "형질전환"은 상기 뉴클레오타이드 절편이 숙주 유기체의 게놈 안으로 이동하여 목적하는 펩타이드를 발현할 수 있도록, 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 것을 말한다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 환원물질로 사용한 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.
숙주는 본 발명의 펩타이드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E.coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 균주, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 같은 바실러스(Bacillus) 속 균주, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 같은 효모, 동물세포, 및 곤충 세포 등이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP)에서 유래하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP4 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP12를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP)에서 유래하고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 항바이러스 펩타이드 AVP2를 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 항균 펩타이드 AMP4 및 AMP12가 우수한 항균 활성이 있으며, 항바이러스 펩타이드 AVP2가 우수한 항바이러스 활성을 갖는 것을 확인한 바 있다(도 9 내지 도 13 참조).
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP4 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP12를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물과, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 항바이러스 펩타이드 AVP2를 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물은 유해 세균 또는 바이러스에 대해 높은 항균력 및 항바이러스 효과를 나타내며, 약학적 조성물, 식품 조성물, 사료 첨가제 조성물 등의 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 성분들을 함유하는 조성과 관련하여 상기 약학적 조성물, 식품 조성물, 사료 첨가제 조성물에 대한 설명에서 충분히 상술한바, 명세서가 지나치게 복잡해지는 것을 피하기 위해 여기서는 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(1) 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 항균 및 항바이러스용 조성물을 제공한다.
(2) 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주, 및 그 배양액과, 본 균주에서 분리된 항균 또는 항바이러스 펩타이드는 우수한 항균 및 항바이러스 활성을 나타내며, 유해 세균 및 바이러스에 의해 발생하는 다양한 감염증에 적용이 가능하다.
(3) 또한, 본 발명의 조성물은 의약, 건강기능식품, 또는 사료 보존제 등의 다양한 분야에서 항균 및 항바이러스 목적으로 유용하게 이용가능하다.
도 1은 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주와 NIBR97 비교 균주의 두 substrain 배양액의 병원성 E. coli 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주를 대상으로 한 항균 활성 분석 결과를 정리한 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주와 NIBR97 비교 균주의 배양액이 갖는 박테리오파아지 phi6에 대한 항바이러스 활성을 분석한 결과를 정리한 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주와 NIBR97 비교 균주의 배양액이 갖는 Infuenza A 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 분석한 결과를 정리한 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주와 NIBR97 비교 균주의 내산성과 내담즙성을 분석한 결과를 정리한 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에 대한 유전체 분석 결과를 정리한 그림이다.
도 6은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 항균 펩타이드 4종을 비교 균주인 NIBR97 균주의 항균 펩타이드와 비교한 표이다.
도 7은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 18종의 후보 항균 펩타이드(AMPs)에 대하여 전사체 분석을 통해 유전자 발현 양상을 정리한 표이다.
도 8은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 항바이러스 펩타이드(AVPs) 5종에 대하여 전사체 분석을 통해 유전자 발현 양상을 정리한 표이다.
도 9는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 후보 항균 펩타이드(AMPs)들을 합성하고 이들의 항균 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래하여 클로닝된 후보 항균 펩타이드 유전자들의 발현에 의한 항균 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래하여 클로닝된 AMP12 항균 펩타이드 유전자의 발현에 의한 항균 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 항바이러스 펩타이드에 의한 항바이러스 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 항바이러스 펩타이드 AVP3의 항균 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주와 NIBR97 비교 균주의 배양액이 갖는 박테리오파아지 phi6에 대한 항바이러스 활성을 분석한 결과를 정리한 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주와 NIBR97 비교 균주의 배양액이 갖는 Infuenza A 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 분석한 결과를 정리한 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주와 NIBR97 비교 균주의 내산성과 내담즙성을 분석한 결과를 정리한 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에 대한 유전체 분석 결과를 정리한 그림이다.
도 6은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 항균 펩타이드 4종을 비교 균주인 NIBR97 균주의 항균 펩타이드와 비교한 표이다.
도 7은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 18종의 후보 항균 펩타이드(AMPs)에 대하여 전사체 분석을 통해 유전자 발현 양상을 정리한 표이다.
도 8은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 항바이러스 펩타이드(AVPs) 5종에 대하여 전사체 분석을 통해 유전자 발현 양상을 정리한 표이다.
도 9는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 후보 항균 펩타이드(AMPs)들을 합성하고 이들의 항균 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래하여 클로닝된 후보 항균 펩타이드 유전자들의 발현에 의한 항균 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래하여 클로닝된 AMP12 항균 펩타이드 유전자의 발현에 의한 항균 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 항바이러스 펩타이드에 의한 항바이러스 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래한 항바이러스 펩타이드 AVP3의 항균 활성 분석 결과를 정리하여 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<실험 재료 및 방법>
1. 항균 및 항바이러스 활성을 갖는 균주 분리 및 배양액 수득
육상 무척추동물인 흰점박이꽃무지(굼벵이)는 굼벵이누리(경남 진주) 및 도다움(경남 진주)에서 사육 중인 유충을 분양받아 시험에 사용하였다.
흰점박이꽃무지 유충 장내의 미생물을 확보하기 위하여 5령 흰점박이 꽃무지 유충을 드라이아이스(Dry ice)에서 급냉한 후, 복부를 절개하여 장을 채취하였다. 채취된 장은 E-tube에 멸균 증류수와 섞은 후 핸드믹스를 이용하여 균질화시키고, MRS 배지에서 100ul 용량으로 스프레딩(Spreading)하여 균주들을 확보하였다.
확보된 균주들은 동일 배지에서 스트리킹(Streaking)하여 단일 균주로 분리하였다. 선발된 각 균주를 5ml MRS 배지에 37℃, 180∼200rpm 조건에서 액체 배양하였다. 상기 MRS 배지에 배양된 각각의 균주를 2,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 수거한 후, 0.22μm syringe filler를 통과시켜 최종 배양여액 및 이의 추출물을 확보하였고, 냉동 보관하여 이후 분석에 사용하였다.
2. 항균 및 항바이러스 활성을 갖는 방어물질 탐색
2-1. 병원균 등 시료 확보
항균 활성 분석을 위해 1차 스크리닝에 사용된 병원성 균주는 경남과학기술대학교 김삼웅 박사로부터 제공받거나, 한국생명공학연구원 KCTC(생물자원센터)에서 분양받아 사용하였다. 그람 음성균인 E. coli(EC; ATCC10536)와 그람 양성균인 Staphylococcus aureus(SA, ATCC6538)를 이용하여 연구를 수행하였다.
2-2. 항균 활성 분석
항균 활성 분석을 위해 microtiter plate 방법으로 MIC(minimal inhibitory concentration) 분석을 수행하였다.
분석 샘플은 스톡(stock)을 제조한 후, 적절한 농도로 희석하여 사용하였고, 선발된 균주는 100ml 삼각 플라스크에 overnight(O/N)으로 배양한 후, 원심 분리를 통해 상등액을 취하고 0.25μm syringe filter로 제균(filtration)하여 항균 활성 분석을 위해 사용하였다.
MIC 분석을 위해 overnight(O/N)으로 전 배양된 균주는 106 CFU/ml 농도로 희석한 후 연구에 사용되었다. MIC 분석에 사용된 균주 배양액은 0, 10, 20, 25, 50, 및 100μl 농도로 사용하였고, 펩타이드의 농도는 0, 25, 50, 100, 250, 500, 및 1,000μg/ml를 사용하였다. 반응액을 Microtiter plate에 첨가한 후 37℃에서 overnight(O/N) 배양하면서 반응성상을 관찰하였고, 각 반응액의 흡광도를 측정하여 항균 활성을 분석하였다.
선발된 균주들의 MIC 측정을 위하여 그람 음성균인 Salmonella typhimurium(ST), E. coli(EC)와 그람 양성균인 Bacillus cereus(BC), Staphylococcus aureus(SA), 그리고 효모인 Candida albicans(CA)를 이용하여 DISC 또는 microtiter plate 방법으로 MIC 분석을 수행하였다.
항균 분석을 위해 overnight (O/N)으로 전배양된 균주는 106 CFU/ml 농도로 맞추어 연구에 사용되었다. 반응액을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하거나, 디스크에 점적 한 후, 37℃에서 O/N 배양하면서 반응성상을 관찰하고 600nm에서 흡광도를 측정하여 항균 활성을 평가하였다.
2-3. 항바이러스 활성 분석
다른 한편으로 항바이러스 활성 분석을 위해 박테리오파아지 phi6(DSM-21518, DSMZ, Germany)를 사용하였으며, 숙주로 슈도모나스 속 균주(Pseudomonas sp. DSM-21482, DSMZ, Germany)를 사용하였다.
박테리오파아지 phi6의 파아지 스톡 제조를 위해 슈도모나스 속 균주를 25℃에서 24시간 액체 배양된 액을 신선한 LB 배지에 1% 농도로 접종하고, 파아지 스톡 0.1% 접종하여 25℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 2,000×g에서 20분간 원심분리하고 상등액을 수거하여 0.2 um 필터로 제균한 후, 파아지 스톡으로 4℃에서 보관하면서 사용하였다.
항바이러스 효능을 분석하기 위해 상기 배양액은 phi6 스톡 용액과 동량으로 혼합한 후, 20℃에서 5분 또는 설정된 시간 동안 방치하였다. 이 반응액은 연속적으로 10배씩 희석하였고, 희석된 액은 사전에 제조된 LB 바텀 아가(LB bottom agar)와 슈도모나스 속 균주가 포함된 소프트 몰튼 아가(soft molten agar)가 중첩되어 있는 페트리 디쉬(petri dish) 위에 점적하였다. 점적된 페트리 디쉬는 25℃에서 24시간 배양한 후 파아지 플라크(phage plaque)를 계수하여 항바이러스 효능을 평가하였다.
3. 균주 동정
항균 활성이 우수한 균주는 게놈 유전자를 분리한 후, 16S rDNA 서열 분석(제노텍, 대전)을 실시하였다. 분석된 16S rDNA는 상동성 분석을 통해 균주의 동정을 위한 자료로 활용하였다.
4. 내산성 및 내담즙성 평가
MRS 액체 배지를 제조하고, 무처리, pH2.0, pH2.5, pH3.0, 및 pH3.5로 조정된 9ml 용액과, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) NIBR-K9 균주 또는 NIRBR97 균주의 배양액 1.0 ml를 혼합하여 잘 현탁한 후, 37℃에서 4시간 반응하였다. 반응액은 적절하게 희석하여 MRS 한천배지에 도말하여 생균수를 측정하였다. 유산균의 생균수 계측은 다음과 같이 계산되었다.
[식 1]
또한, MRS 액체 배지를 제조하고, 무처리, 담즙산(oxgall, Oxoid, Bstingstoke, UK) 농도를 0%, 0.6%, 0.9%, 및 1.2%로 처리된 9ml 용액과 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) NIBR-K9 균주 또는 NIRBR97 균주의 배양액 1.0 ml를 혼합하여 잘 현탁한 후, 37℃에서 4시간 반응하였다. 반응액은 적절하게 희석하여 MRS 한천배지에 도말하여 생균수를 측정하였다. 유산균의 생균수 계측은 다음과 같이 계산되었다.
[식 1]
5. 오믹스(유전체 및 전사체) 정보 분석
5-1. 유전체 정보분석
(유산균 시료에서 게놈 DNA 분리 및 서열 분석 준비)
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa Korea, Seoul, Republic of Korea)을 사용하여 유산균에서 게놈 DNA를 분리하였고, 이 DNA를 DNA-Seq (DNA sequencing)에 사용하였다.
(DNA sequencing)
분리된 DNA는 Covaris S2 ultra sonicator system을 이용하여 fragmentation 단계를 거친 후, Truseq Nano DNA sample prep kit(Illumina, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 350bp의 DNA 단편으로 구성된 라이브러리를 구축하였다. 이러한 최종 산물은 2100 BioAnalyzer를 이용하여 확인하였고, Illumina HiSeq platform (Illumina, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 서열해독을 진행하였다.
(유전체 정보 확보를 위한 생물정보학 분석)
확보된 "sequence reads"는 sickle(v1.33)와 "BWA ver. 0.7.12."를 사용하여 고품질의 "reads"만 필터링하여 얻었고, 이것은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 대해 mapping 및 genome assembly 하는데 사용되었다. 맵핑 이후, "local realignment"는 "GATK ver. 3.1-1"을 사용하여 수행하였고, "duplicates"는 "Picard ver. 1.98(http://picard.sourceforge.net)"을 사용하였다. 서열상의 변이들은 "GATK ver 3.1-1"을 통해 콜링(calling)이 이루어졌으며, 변이에 대한 어노테이션(annotation)은 "SnpEff(v.4.1)"에 의해서 수행되었다.
항균 펩타이드(AMPs)들의 확인을 위해 CAMP (http://www.camp.bicnirrh.res.in/campHelp.php) 사이트에서 기존에 확보된 항균 펩타이드(AMPs)와 서열을 비교하여 유사도(similartiy)가 50% 이상이 되는 펩타이드(peptide)들을 잠재적 항균 펩타이드(AMPs)로 분류하고, 인공 펩타이드(artificial peptide) 합성 및 유전자 클로닝의 대상으로 하였다.
5-2. 전사체 정보 분석
총 RNA 추출은 AccuPrep® Bacterial RNA Extraction Kit(Bioneer)를 사용하여 수행되었다. RNA 순도는 NanoDrop1000 분광계에 Total RNA 추출물 1μl에 의해 측정하였다. Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 기기를 사용하여 측정한 RIN(RNA Integrity Number) 값을 확인하여 total RNA를 검증하였다. Total RNA sequencing libraries 구축을 위해 Nugen Universal Prokaryotic RNA-seq kit(Part Number 0363-32)가 사용되었고, 제조사의 지시에 따라 수행되었다.
Total RNA(300ng)가 선택적 프라이머(selective primers)로 1차 및 2차 가닥 cDNA(first and second strand cDNA)를 합성하기 위해 사용하였다. 프로토콜 오베이션(Protocol Ovation)에 특화된 파라메터(parameters)를 사용한 후에, 마이크로 튜브(microtube)에서 Covaris S220를 이용하여 소니케이션(sonication)에 의해 200bp 절편을 만들었다. cDNA 정제(purification), 엔드 리페어(end repair), 어뎁터 라이게이션(adaptor ligation), 1차 가닥 선택(first strand selection), 및 1차 가닥 정제(first strand purification) 등 모든 단계는 제조사의 공식적인 프로토콜에 따라서 수행하였다.
Strand Selection II 단계에서, rRNA는 애니디플리트 프로브(Anydeplete probe)로 애니디플리트 테크닉(AnyDeplete technique)에 의해 박테리아 종(bacterial species)에 따라 제거하였다. 라이브러리(Libraries)는 PCR에 의해 증폭되었고, 증폭된 양은 캐필러리 전기영동(capillary electrophoresis, Bioanalyzer, Agilent)에 의해 검정되었다. SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 이용하여 QPCR 반응을 수행한 후에, 인데스 택드 라이브러리(index tagged libraries)의 동량이 풀(pool)에 컴바인(combine) 하였다. RNA 서열분석은 Illumina NovaSeq 6000 system 기기를 이용하여 수행되었다.
6. 유전자 조작 및 항균 펩타이드(AMPs)의 인공적 합성
일반적인 유전자 조작은 Sambrook(1989) 등의 방법에 의해 수행되었다. 유전체 및 전사체 정보 분석을 통해 확보된 잠재적 항균 펩타이드(putative AMPs)의 PCR 증폭을 위해 제노텍사에 의뢰하여 프라이머(primer)가 디자인되었고 합성되었다.
합성된 프라이머 세트와 PCR PreMix(AccuPower PCRMix, Bioneer)를 이용하여 각각의 잠재적인 항균 펩타이드(putative AMPs)를 증폭한 후, 겔 추출(gel extraciton)을 수행하였다. 추출된 DNA 절편들은 T-easy vector(Promega, USA)에 결합(ligation)하였고, CaCl2(calcium chloride)를 이용하는 heat-shock 방법으로 E. coli Top10(Invitrogen, Carlsbad, CA) 균주로 형질전환되었다. 클로닝된 잠재적 항균 펩타이드의 확인은 제한효소 절단과 염기분석(nucleotide sequencing, Applied Biosystems, FosterCity, CA)에 의해 수행되었다.
예견된 항균 펩타이드에 대해 상동성을 보유하는 영역의 아미노산 서열을 확보하고, 이들 서열을 펩타이드 합성하였다(코스모진택, 한국).
[표 1]
7. 잠재적 항균 펩타이드의 항균 활성 검증
상기 클로닝된 균주는 24시간 배양 후 상등액을 수거하여 0.2um syringer filter로 여과한 후, 항균 활성 분석을 위해 사용하였다. 합성된 항균 펩타이드는 10mg/ml 농도로 현탁한 후, 항균 활성 분석을 위해 사용하였다. 항균 활성 분석을 위해, 그람 음성균인 E. coli(EC)와 그람 양성균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 이용하여 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 방법으로 MIC(minimal inhibitory concentration) 분석을 수행하였다.
항균 분석을 위해 overnight(O/N)으로 전배양된 균주는 106 CFU/ml 농도로 연구에 사용되었다. 반응액을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하거나 디스크(disc)에 점적한 후, 37℃에서 O/N 배양하면서 반응 성상을 관찰하였다. 관찰 후, 항균 활성이 좋은 항균 펩타이드만 선별하여 다음 실험에 사용하였다.
8. 후보 항바이러스 펩타이드의 합성 및 활성 분석
다른 한편으로 항바이러스 펩타이드(AVPs, antiviral peptides)의 활성 분석을 위해 박테리오파아지 phi6(DSM-21518, DSMZ, Germany)를 사용하였으며, 숙주로 슈도모나스 속 균주(Pseudomonas sp. DSM-21482, DSMZ, Germany)를 사용하였다.
박테리오파아지 phi6의 파아지 스톡 제조를 위해 슈도모나스 속 균주를 25℃에서 24시간 액체 배양된 액을 신선한 LB 배지에 1% 농도로 접종하고, 파아지 스톡 0.1% 접종하여 25℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 2,000×g에서 20분간 원심분리하고 상등액을 수거하여 0.2 um 필터로 제균한 후, 파아지 스톡으로 4℃에서 보관하면서 사용하였다.
항바이러스 효능을 분석하기 위해 합성된 후보 항바이러스 펩타이드(AVPs)는 phi6 스톡 용액과 동량으로 혼합한 후, 20℃에서 5분 또는 설정된 시간 동안 방치하였다. 이 반응액은 연속적으로 10배씩 희석하였고, 희석된 액은 사전에 제조된 LB 바텀 아가(LB bottom agar)와 슈도모나스 속 균주가 포함된 소프트 몰튼 아가(soft molten agar)가 중첩되어 있는 페트리 디쉬(petri dish) 위에 점적하였다. 점적된 페트리 디쉬는 25℃에서 24시간 배양한 후 파아지 플라크(phage plaque)를 계수하여 항바이러스 효능을 평가하였다.
9. Influenza A/H3N2 바이러스에 대한 항바이러스 분석
홍콩 독감의 원인 바이러스로 알려진 Influenza A/H3N2 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 검증하였다.
바이러스 활성 테스트를 위해, Influenza A/H3N2 스톡 0.1mL(2-4×105 viruses/μL)를 세포를 제거한 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주(cell-free supernatant)의 배양 상등액 0.9mL을 첨가하고, 25℃에서 각각 10분, 30분, 및 18시간 공배양하였다. 공배양 후, 배양상등액-A/H3N2의 혼합액을 10배수 간격으로 순차적으로 희석하였고, 농도별 희석액으로 MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포(3×104 cells/well)를 감염시켰다.
이후, 세포반수감염용량(CCID50, cell culture infectious dose)과 바이러스 감소(viral reduction)를 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)와 플라그 분석(plaque assays)을 통해 평가하였다.
실험예 1. L. plantarum NIBR-K9 균주 분리 및 항균 활성 분석
흰점박이꽃무지 유충의 장에서 분리된 유산균 10종의 항균 활성을 평가했다. 모든 유산균 균주에서 항균 활성이 나타났지만, K1, K2, K5, 및 K6 균주에 비해, K3, K4, K7, K8, K9, 및 K10 균주가 활성이 더 높은 것을 확인할 수 있었다(그림 미도시). 이와 같은 결과를 토대로, K3, K4, K7, K8, K9, 및 K10 균주를 1차 선발하였다.
1차 항균 분석 결과에 따른 K3, K4, K7, K8, K9, 및 K10 균주의 MIC 농도를 측정하였다. MIC 측정은 야생에서 분리하여 독성이 매우 강한 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) χ3339 균주를 106 CFU/ml으로 희석하여 실험하였다. 유산균 배양액의 상등액은 0, 5, 10, 25, 50, 및 100μl 농도로 첨가하였고, 37℃, 16h, O/N(Over Night) 배양 후, 항균 활성을 관찰하였다.
분석은 ELISA Leader(Multiscan GO, Thermo Scientific Co. Ltd., Rochester, NY, USA)를 이용하여 600nm에서 측정되었다. 측정결과, MIC 농도는 K3 균주가 47㎕로 측정되었고, K4 균주가 48.25㎕로 측정되었으며, K7 균주가 47.75㎕로 측정되었고, K8 균주가 47.83㎕로 측정되었으며, K9 균주가 46.8㎕로 측정되었고, K10 균주가 46.82㎕로 측정되었는바, K9 균주의 MIC 농도가 46.8㎕로 가장 낮게 측정되어 항균 활성이 가장 우수한 것으로 관찰되었다.
동 균주에 대한 16SrDNA sequencing 결과, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주로 동정되었다. 동 균주를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주로 명명하였고, 한국 생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 14385BP로 2020년 11월 23일 기탁하였다.
실험예 2. NIBR-K9 균주와 NIBR97 균주의 항균 및 항바이러스 활성 비교 결과
2-1. 항균 활성
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주의 항균활성을 객관적으로 비교 분석하기 위해, 국립생물자원관에서 등록받은 특허균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR97 균주와 항균활성을 비교분석하였다.
비교 분석을 위해 사용된 NIBR97 균주는 김치에서 유래한 유산균 균주로, 실제 가축 방역 현장에서 고병원성으로 알려진 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) SN107과 국내 닭에서 분리된 살모넬라 겔린아룸(Salmonella Gallinarum) MMP95 균주를 대상으로 우수한 항균 활성이 검증된 균주로, 현재 민간에 기술이전되어 항균 목적으로 현장에서 실사용되고 있는 균주이다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 NIBR-K9 균주와 NIBR97 비교 균주의 두 substrain 배양액의 항균 활성 분석 결과는 도 1에 도시하였다.
[도 1]을 참조하면, 병원성 E. coli 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대한 항균 활성은 본 발명의 NIBR-K9 균주가 NIBR97 균주 보다 더욱 우수한 것으로 평가되었다. 본 발명의 NIBR-K9 균주의 MIC90 농도는 E. coli 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대해 각각 21.8ul과 21.0ul로 나타난 반면에, NIBR97 균주는 각각 26.4ul와 22.0ul로 나타났다.
또한, 본 발명의 NIBR-K9의 항균 활성은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 비해 E. coli 균주에서 보다 우수한 것으로 나타났다.
2-2. 항바이러스 활성
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR97 균주는 항균 펩타이드를 생성하는 우수한 항바이러스 활성이 입증된 균주로, 현재 이와 관련된 특허출원이 진행 중인 상태이다. 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주와 NIBR97 균주의 항바이러스 활성을 분석하여 도 2에 정리하였다.
[도 2]를 참조하여 NIBR-K9 균주와 NIBR97 균주의 배양액이 갖는 박테리오파아지 phi6에 대한 항바이러스 분석 결과를 살펴보면, 5배 희석된 NIBR97 배양액이 투여된 비교예의 시험군은 각각 5분 및 10분 처리시 99.99, 99.999%의 항바이러스 활성을 나타내었고, 10배 희석된 K9 배양액은 각각 5, 20, 및 30분 처리시 85.2%, 99.9%, 및 99.99%의 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다.
희석배수가 높은 NIBR-K9 균주가 희석배수가 낮은 NIBR97 균주와 유사한 항바이러스 활성을 나타내는 상기 결과를 통해 본 발명의 NIBR-K9 균주가 매우 우수한 항바이러스 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
또한, Infuenza A 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 분석하였고, 그 결과를 [도 3]에 정리하여 나타냈다. [도 3]을 참조하면, NIBR-K9 균주와 NIBR97 균주의 배양액을 각각 10분 처리시 NIBR-K9과 NIBR97 균주 배양액들은 각각 >99.999%와 99.594% 감소율을 보였다. 처리시간을 18시간으로 수행한 경우에는 NIBR-K9와 NiBR97 균주의 배양액은 모두 99.999% 이상의 감소율을 보였다.
상기 실험 결과를 통해, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR97 균주 및 이의 배양액은 NIBR97 균주에 비교하여 더욱 우수한 항바이러스 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 내산성 및 내담즙성 분석
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주는 굼벵이의 장에서 분리된 균주이고, 비교균주로 사용된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR97 균주는 김치에서 분리된 균주로, 이들 균주들은 기원과 서식환경을 달리하는 균주들로 내산성 및 내담즙성에 차이가 있을 것으로 예측되었다.
이들 균주에 대해 내산성 및 내담즙성을 분석하여 [도 4]에 정리하였다.
[도 4]를 참조하면, 내산성에서 비교균주인 NIBR97 균주는 pH 3.0까지는 내성이 유지되었고, 도리어 약간 성장이 유발되는 양상을 나타내었지만, pH 2.5에서 67.5%의 감소가 유발된 후에 pH 2.0에서 99.999% 이상으로 감소되는 경향이 관찰되었다. 이에 반해 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주는 pH 3.5에서 90.2% 까지 약간의 감소 추세를 보였으나, 그 이후부터 pH 2.0까지 유사 범위 내에서 세포 수를 유지하는 것으로 관찰되었다.
내담즙성에서도 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주는 oxgall 1.2% 농도까지 균주의 성장에 영향을 받지 않는 것으로 나타나, 비교균주인 NIBR97 균주에 비해 내담즙성이 우수한 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주는 내산성 및 내담즙성이 매우 우수한 균주임을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 유전체 및 전사체 분석 결과
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에 대한 유전체 분석을 수행한 총 4개의 contig가 존재했다(도 5 참조).
이 중에서 contig 1은 K9 염색체인 것으로 추정된 반면에, 나머지 contig들은 플라스미드 유래 유전자들인 것으로 추정되었다.
이들 유전체 중에서 가상의 단백질(hypothetical protein)들을 별도로 분리하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 기존에 알려진 항균 펩타이드 (AMPs, antimicrobial peptides)들과 상동성 비교를 수행하여 50% 이상의 상동성(positive)을 보이는 유전자들을 확보하였고, 하기 표 2에 항균 펩타이드(AMPs, antimicrobial peptides) 18종을 정리하였다.
[표 2]
상기 [표 2]를 참조하면, NIBR-K9 균주 유래 18종의 항균 펩타이드(AMPs) 중에서, 항균 펩타이드 2, 3, 4, 7, 9, 10, 13, 및 18은 단일 영역에서 기존 항균 펩타이드에 상동성을 보였다. 항균 펩타이드 1, 5, 6, 8, 11, 12, 14, 15, 및 16는 2곳에서 상동성을 보였다(단일 영역으로 굵은 글씨로 나타낸 부위 중에 오버랩(overlape) 또는 연속되는 영역이 존재함). 특이적으로 항균 펩타이드 17은 4곳 이상(bold 영역 중 overlape 또는 연속되는 영역이 존재)의 영역에서 상동성 부위가 관찰되어 다양한 항균 펩타이드가 번역(translation) 이후에 단백분해효소에 의한 분해(protease lysis) 작용에 의해 생성될 가능성이 있는 것으로 추정되었다.
총 18종의 항균 펩타이드 중에서 비교 균주인 NIBR97 균주의 항균 펩타이드와 비교 분석한 결과, 항균 펩타이드 3, 4, 및 7은 변종 항균 펩타이드(variant)인 것으로 나타난 반면에, 항균 펩타이드 12는 종래 항균 펩타이드와 구별되는 신규 항균 펩타이드로 관찰되었다(도 6).
확보된 18종의 후보 항균 펩타이드(AMPs) 들에 대해 전사체 분석을 통해 유전자 발현 양상을 확인해 보았고 이를 [도 7]에 정리하였다.
전사체 분석 결과, 항균 펩타이드 13은 유전자 발현이 실제 일어나지 않는 것으로 나타났으며, 항균 펩타이드 10은 대수증식기 특이적으로 발현되는 것으로 관찰되었다. 또한, 항균 펩타이드 2, 3, 5~9, 11, 14, 및 16~18 등은 모두 정지기에서 발현이 높은 것으로 평가되었다.
반면에 항균 펩타이드 1, 4, 12, 및 15 등은 대수증식기에서 높은 발현이 관찰되었다. 항균 펩타이드 16의 발현량이 가장 높은 것으로 나타났으며, 항균 펩타이드 9와 18은 대수증식기에 비교하여 정지기에 발현이 2배 이상 높은 것으로 나타났다.
다른 한편으로 항바이러스 펩타이드(AVPs, antiviral peptides)와 상동성을 보이는 유전자를 분석해 본 결과, 총 5종의 항바이러스 펩타이드가 확인되었고, 하기 [표 3]에 정리하였다.
[표 3]
전사체 분석 결과, 5종 항바이러스 펩타이드(AVPs)는 모두 발현이 되는 것으로 나타났으며, 항바이러스 펩타이드 1, 3, 및 5는 정지기에서 발현이 높은 반면에, 항바이러스 펩타이드 2와 4는 정지기에서 발현이 높은 것으로 나타났으나, 그 차이는 크지 않는 것으로 나타났다(도 8 참조).
실험예 5. 후보 항균 펩타이드들의 항균 활성 분석
도 9를 참조하여 상기 [표 1]의 합성된 후보 항균 펩타이드들의 항균 활성 분석 결과를 살펴보면, 병원성 E. coli 균주에 대해서는 상대적으로 낮은 항균 활성 값을 나타냈으며, 이들 중에서 항균 펩타이드 7, 항균 펩타이드 16-1, 항균 펩타이드 17-1, 항균 펩타이드 17-2, 항균 펩타이드 18 등이 상대적으로 높은 활성을 보였다. 그리고, AMP16-1 항균 펩타이드가 가장 높은 활성을 보였으며, 그 다음은 AMP18 항균 펩타이드가 높게 나타났다.
병원성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대해서는 일반적으로 항균 활성이 높게 나타난 항균 펩타이드들이 많았으며, 이들 중에서 항균 펩타이드 4, 6, 7, 12-2, 14, 17-1, 17-2, 및 18 등이 상대적으로 높은 항균 활성을 갖는 것으로 나타났다.
가장 높은 항균 활성을 보인 항균 펩타이드는 AMP4 항균 펩타이드였다. 또한, AMP18 항균 펩타이드는 병원성 E. coli와 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대해 다른 항균 펩타이드에 비해 비교적 높은 항균 활성이 관찰되었다. 병원성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대해 MIC90을 분석한 결과, 항균 펩타이드 AMPs 4와 항균 펩타이드 AMPs 18이 각각 3.2mg/ml와 3.5mg/ml의 수준으로 높은 항균 활성 값이 측정되었다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래하여 클로닝된 후보 항균 펩타이드 유전자들의 발현에 의한 항균 활성 분석 결과, 병원성 E. coli 균주에 대해서는 대조구인 T-easy vector에 의해 유도된 E. coli DH5*?* 배양액에 대해 AMP3, 4, 7, 8, 12, 및 18의 항균 펩타이드가 항균 활성이 있는 것으로 평가되었다(도 10 참조).
이들 중에서 항균 펩타이드 AMP4가 가장 우수한 것으로 평가되었다. 병원성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대해서는 모든 항균 펩타이드가 항균 활성이 있는 것으로 추정되었다.
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주에서 유래하여 클로닝된 항균 펩타이드 중에서 변이체(variant)나 신규 항균 펩타이드 3, 4, 7, 및 12의 펩타이드들은 모두 항균 활성이 있는 것으로 평가되었고, 이 중에서 신규한 항균 펩타이드인 AMP12는 모든 항균 펩타이드들과 비교하여 병원성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대해 가장 활성이 높은 것으로 나타났다(도 11 참조). 또한, 병원성 E. coli 균주에 대해서도 비교적 우수한 항균효능이 있는 것으로 나타났다.
추가적으로 항균 펩타이드 AMP12는 signal signal P5.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 및 PrediSi (http://www.predisi.de/home.html)들에 의한 시그널 펩타이드(signal peptide) 예측 결과, 아미노산 서열인 “MKKWEKQTMKIAALGAMALTLAGCATAKSSSSQGNNPGKTIKIGVNMELSGSAAGYGEQQKQGIQLAVKKINKSGGIKVGGPRRKFSW” 서열 중에서 23번째인 Gly(signalP5.0) 또는 32번째 Ser(PrediSi)에 의해 절단될 것으로 예측되었다.
실험예 6. 후보 항바이러스 펩타이드의 항바이러스 활성 분석
상기 [표 3]의 서열번호로 표시되는 항바이러스 펩타이드(AVPs)의 효능을 검증하기 위해 우선적으로 각 항바이러스 펩타이드(AVPs) 2.5mg/ml 용량 처리에 따른 박테리오파아지 phi6(DSM-21518, DSMZ, Germany)에 대해 항바이러스 활성을 평가하였다. 양성 대조군으로는 기존에 항바이러스 효능이 잘 알려져 있는 뮤크로포린(mucroporin)을 활용하였다(APD3, http://aps.unmc.edu/AP/main.php). 합성 과정 중에 정상적으로 합성이 완료되지 못한 항바이러스 펩타이드 AVP1은 본 실험에서 생략되었다.
도 12를 참조하여 항바이러스 분석결과를 살펴보면, 항바이러스 펩타이드 AVP2가 가장 강력한 항바이러스 효능이 있는 것으로 평가되었다. 항바이러스 펩타이드 AVP2의 항바이러스 효능은 양성 대조군으로 사용된 뮤크로포린(mucroporin)과 동등한 효과를 나타내는 것으로 관찰되었으며, 1.25mg/ml 농도에서 82.5%의 효능을 보였고, 2.5mg/ml 농도에서 99.999% 이상의 항바이러스 효능이 있는 것으로 관찰되었다. 따라서, 항바이러스 펩타이드 AVP2는 항바이러스 제제로써 활용이 가능한 것으로 판단된다.
또한, 추가적으로 상기 항바이러스 펩타이드들이 동시에 항균활성을 갖는지를 평가하기 위해 병원성 E. coli 균주를 대상으로 하여 항균 활성을 평가해 보았다. 일차적으로 2.5mg/ml 농도에 의해 항균효능을 평가해 본 결과 항바이러스 펩타이드 AVP 2, 3, 및 4가 항균 활성이 있는 것으로 나타났으며, 특히, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 항바이러스 펩타이드 AVP3가 가장 우수한 항균 활성을 갖는 것으로 평가되었다(도 13 참조). 항바이러스 펩타이드 AVP3의 MIC50 값은 2.1mg/ml로 평가되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> National Institute of Biological Resources
<120> Lactobacillus plantarum NIBR K9 Having Anti-Microbial and
Anti-Viral Activity, Anti-Microbial and Anti-Viral Peptides
Isolated from the Same, Uses thereof
<130> PN200067AN
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
Met Pro Tyr Leu Asn Val Thr Lys Gly Ser Trp Asp Lys Val Gly Ser
1 5 10 15
Thr Phe Thr Val Lys Asp Asn Ala Glu Ala Pro Phe Thr Ser Leu Ala
20 25 30
Gly Lys Ser Val Val Asn Ile Ala Met Met Pro Val Gln Gln Gly Pro
35 40 45
Trp Val Tyr Asn Thr Lys Ser Leu Ser Lys Asp Asp Gln Lys Lys Ile
50 55 60
Ala Thr Glu Phe Thr Ser Lys Ser Phe Ala Gln Asn Lys Lys Ile Phe
65 70 75 80
Ser Glu Pro Asn Ala Lys Thr Pro Met Met Phe Pro Lys Lys Ser Glu
85 90 95
Lys Ser Lys Leu Val Asn Val Thr Asp Lys Trp Tyr Ala Pro Thr His
100 105 110
Lys Leu Val Gly Tyr
115
<210> 2
<211> 88
<212> PRT
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 2
Met Lys Lys Trp Glu Lys Gln Thr Met Lys Ile Ala Ala Leu Gly Ala
1 5 10 15
Met Ala Leu Thr Leu Ala Gly Cys Ala Thr Ala Lys Ser Ser Ser Ser
20 25 30
Gln Gly Asn Asn Pro Gly Lys Thr Ile Lys Ile Gly Val Asn Met Glu
35 40 45
Leu Ser Gly Ser Ala Ala Gly Tyr Gly Glu Gln Gln Lys Gln Gly Ile
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85
<210> 3
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<212> PRT
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 3
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Val Phe Pro Ile Ala Val Tyr Asn Thr Ala His Lys Ala Tyr Phe Arg
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Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ser Thr Thr Ala Ile Thr Asn Lys Leu Met
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<212> PRT
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 4
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Arg Met Lys Lys His Ala Glu Ala Asn Lys Lys Pro Pro Val Lys Ala
20 25 30
Thr Ser His Gly Thr Thr Arg Met Thr Val Val Ser Ile Thr
35 40 45
Claims (13)
- 기탁번호 KCTC 14385BP로 수탁되고,
항균 및 항바이러스 활성을 나타내며,
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP4 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP12를 생산하고,
서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 항바이러스 펩타이드 AVP2를 생산하는 것을 특징으로 하는,
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주. - 삭제
- 삭제
- 제1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 및 상기 배양액의 건조물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효용 스타터(starter).
- 제1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP) 또는 제4항의 발효용 스타터를 이용하여 생산된 발효식품.
- 제1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스용 약학적 조성물.
- 제1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스용 건강기능식품 조성물.
- 제1항의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NIBR-K9 균주(기탁번호 KCTC 14385BP), 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스용 사료첨가제 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP4 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항균 펩타이드 AMP12를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물.
- 삭제
- 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 항바이러스 펩타이드 AVP2를 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물.
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