CN107849103B - 新抗微生物肽、它们的变体和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新型抗微生物肽及其变体。本发明还涉及杀死微生物或抑制微生物生长的方法以及本文公开的肽作为药物、饲料添加剂、防腐剂或表面活性剂的用途。
Description
发明领域
本发明涉及抗微生物肽或其变体，涉及杀死微生物或抑制微生物生长的方法，以及涉及本文所述的肽作为药物、饲料添加剂、防腐剂或表面活性剂的用途。
背景技术
在药物化合物中，抗生素对人类的期望寿命产生了巨大的影响。然而，微生物发展抗性的能力几乎是无限的。多药耐药性已经成为许多人类病原体的一个非常普遍和危险的特征，并且耐药性正在全球蔓延。
内寄生菌是广泛的次级代谢产物的有希望的生产者，在生物医学、制药和医疗行业具有潜在的应用。典型地用于研究内寄生菌的功能多样性的方法学是基于强调快速生长的菌株的分离，因此不代表完整的生物多样性。诸如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、限制性片段长度多态性(RFLP)或克隆和直接测序的方法用于分析植物中不可培养的真菌菌落的多样性，但是这样的方法不适于功能研究。内寄生菌的常见问题是，它们在体外仅在某段时间产生代谢产物，然后变得无活性，失去生存力或产生生物活性次级代谢产物的能力。对其它微生物的这种培养问题早已成为开发新方法的驱动力之一以获取巨大微生物财富。
抗微生物肽(AMP)在所有复杂的生物体中都通过先天免疫系统在进化上被保存和产生。它们在人类和哺乳动物中作为第一道防线。AMP是由10-50个氨基酸构成的多肽，具有≥30％的疏水比率和正电荷。通常，AMP对细菌、真菌和酵母具有广谱的抗微生物活性。
WO 2011/113999公开了来自岩高兰(Empetrum nigrum)的内寄生菌的胰蛋白酶多肽以及获得它们的方法。基于经由计算机(in silico)的分析，预测所述肽具有抗微生物活性。
迫切需要对各种病原微生物具有活性的新分子。如下所解释的，本发明满足了这些需求。
发明概述
岩高兰(Crowberry)(Empetrum nigrum)是生长在北半球的多年生灌木，其传统上已经用于治疗传染性疾病并且被认为是这种研究的好的候选者。本发明提供了来源于岩高兰的内寄生菌的新型抗微生物(多)肽及其变体，其对各种微生物具有改善的活性。
本发明的第一方面是提供抗微生物肽或其变体。根据本发明，所述多肽包含SEQID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少37％的同一性。
本发明的第二方面是杀死微生物或抑制微生物生长的方法。根据本发明，所述方法包括用本文所述的肽或其变体处理所述微生物的步骤。
本发明的第三方面是本文所述的肽或其变体作为药物、饲料添加剂、防腐剂或表面活性剂的用途。
本发明获得了相当多的优点。已知AMP对广谱的微生物(包括真菌以及革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌二者)具有活性。由于生产成本最小，所以小AMP易于合成并具有商业可行性。未发现AMP在细菌中发展耐药性。本发明涉及新型抗微生物肽，它们的变体和在各种应用中的用途。
附图简述
图1.琼脂覆层测定，其显示在基于大肠杆菌的内寄生菌宏基因组文库中鉴定的对金黄色葡萄球菌(S.aureus)具有抗细菌活性的亚克隆(a)和不具有活性的亚克隆(s)。
图2.岩高兰宏基因组抗细菌蛋白1的预测氨基酸序列。预测蛋白具有549个残基。高度保守的PPR序列(三角状五肽(pentatricopeptide)重复)是加下划线的。
图3.合成肽Met1-Met12(各100μg)的代表性径向扩散测定(RDA)，针对大肠杆菌(A)和金黄色葡萄球菌(B)测试，NC＝阴性对照，庆大霉素为10μg。
图4a显示由SEQ ID NO:4定义的“Met10”-肽(链100)的25个变体的比对。
图4b显示由SEQ ID NO:5定义的“Met11”-肽(链200)的23个变体的比对。
图4c显示由SEQ ID NO:6定义的“Met12”-肽(链300)的25个变体的比对。
图5a显示由SEQ ID NO:4定义的“Met10”-肽(链100)的9个变体的比对。
图5b显示由SEQ ID NO:5定义的“Met11”-肽(链200)的10个变体的比对。
图5c显示由SEQ ID NO:6定义的“Met12”-肽(链300)的13个变体的比对。
图6a.合成肽变体链100–109(各50μg)的径向扩散测定(RDA)，针对大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC10031)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 27853)测试，NC＝阴性对照，庆大霉素为5μg。
图6b.合成肽变体链200-210(各50μg)的径向扩散测定(RDA)，针对大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 10031)和绿脓假单胞菌(ATCC 27853)测试，NC＝阴性对照，庆大霉素为5μg。
图6c.合成肽变体链300-313(各50μg)的径向扩散测定(RDA)，针对大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 10031)和绿脓假单胞菌(ATCC 27853)测试，NC＝阴性对照，庆大霉素为5μg。
图7a.合成肽变体链109、105、104、201、204、310、308、307和306(各20μg)的径向扩散测定(RDA)，针对黄曲霉(Aspergillus flavus)(DSM 1959)测试，NC＝阴性对照，两性霉素B为20μg。
图7b.合成肽变体链109、105、104、201、204、310、308、307和306(各20μg)的径向扩散测定(RDA)，针对产黄青霉(Penicillium chrysogenum)(DSM 1075)测试，NC＝阴性对照，两性霉素B为20μg。
图8a.通过径向扩散测定在14天的时期内在各种温度下测试的链肽104(A-D)和105(E-H)的热稳定性。通过等分20μg的肽(在不同温度下温育)测试抗细菌活性，并通过抑制区域测量活性。将处于-20℃的肽作为对照。
图8b.通过径向扩散测定在14天的时期内在各种温度下测试的链肽201(A-D)和204(E-H)的热稳定性。通过等分20μg的肽(在不同温度下温育)测试抗细菌活性，并通过抑制区域测量活性。将处于-20℃的肽作为对照。
图8c.通过径向扩散测定在14天的时期内在各种温度下测试的链肽306(A-D)和308(E-H)的热稳定性。通过等分20μg的肽(在不同温度下温育)测试抗细菌活性，并通过抑制区域测量活性。将处于-20℃的肽作为对照。
图9a.通过径向扩散测定(RDA)确定链肽104和105的pH稳定性。使用范围在4-9的不同pH来检查抑制区域。
图9b.通过径向扩散测定(RDA)确定链肽201和204的pH稳定性。使用范围在4-9的不同pH来检查抑制区域。
图9c.通过径向扩散测定(RDA)确定链肽306和308的pH稳定性。使用范围在4-9的不同pH来检查抑制区域。
图10c.链肽306的窄谱抗细菌活性。
图11a.在37℃暴露于10μg/ml的链105达1小时的大肠杆菌(A-C)和金黄色葡萄球菌(D-G)的透射电子显微镜(TEM)图像。对照(A&D)；用链105处理(B–C&E–G)。
图11b.在37℃暴露于10μg/ml的链201达1小时的大肠杆菌(A-C)和金黄色葡萄球菌(D-F)的透射电子显微镜(TEM)图像。对照(A&D)；用链201处理(B–C&E–F)。
图11c.在37℃暴露于10μg/ml的链308达1小时的大肠杆菌(A-C)和金黄色葡萄球菌(D-F)的透射电子显微镜(TEM)图像。对照(A&D)；用链308处理(B–C&E–F)。
图12.链105和201固定化的导管的抗细菌活性。硅导管被用作对照。
发明详述
在所有植物物种中都发现了内寄生菌，即在宿主植物的健康组织内部度过其整个生命周期或其部分的微生物。尽管无法培养大多数内寄生菌，但是从植物分离的化学结构实际上能够具有微生物来源也是不足为奇的。宏基因组学提供了一种有价值的工具以获取来源于不可培养的微生物的生物活性化合物的资源。
在该研究中，我们已经构建了来自内寄生菌的宏基因组文库并筛选了抗细菌活性。通过双琼脂层法筛选文库，将金黄色葡萄球菌用作靶标生物体以选择抗细菌克隆。从宏基因组文库中选择展现抗细菌活性的一个独特克隆。产生次级文库以获得具有减小的插入大小的抗细菌亚克隆用于表征负责抗细菌活性的基因。
针对Genbank数据库中存在的序列将亚克隆的核苷酸序列进行BLAST分析，但是没有鉴定出与任何已知序列的相似性。编码所公开的蛋白质的分离基因在WO 2011/113999中，并命名为岩高兰宏基因组抗细菌蛋白1(En-MAP1，GenBank登录号KC466596)。推导的氨基酸序列(SEQ D NO:1)的分析揭示了En-MAP1编码549个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质与来自Pseudozyma hubeiensis的假设蛋白质具有32％的最高相似性并且与任何已知功能的蛋白质不具有相似性。
分离的内寄生菌蛋白质被表达和分离，但是没有观察到抗微生物活性。然后使用实验部分中描述的算法预测经由计算机消化的肽的抗微生物活性。还测试了肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的抗微生物活性。在初步测试中，预测具有抗微生物活性的一些肽在体外测试中也显示活性。选择最佳候选者用于进一步的研究。
抗微生物肽与细菌膜相互作用以在最佳浓度下有效地进行杀死。AMP还应该具有生物相容性，耐盐性和广谱抗微生物活性。通过使用合理的设计技术，我们能够通过并入或置换各种氨基酸来改善肽的抗微生物活性。我们已经设计并修饰了Met10(由SEQ ID NO:4定义的链100)、Met11(由SEQ ID NO:5定义的链200)和Met12(由SEQ ID NO:6定义的链300)，即在各种位置具有色氨酸(W)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)的肽，以改善抗细菌活性。
利用APD2数据库检查肽与已知抗微生物剂的同源性和同一性(Wang等人，2009)。
本发明的一个实施方案是抗微生物肽或其变体，包含SEQ ID NO:4(Met 10，链100)、SEQ ID NO:5(Met11，链200)、SEQ ID NO:6(Met12，链300)，或与SEQ ID NO:SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少37％的同一性。已经令人惊讶地发现，相对小的片段可以具有期望的活性。
在一个实施方案中，肽或其变体包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中的任一者或者这样的肽，所述肽与所述序列中的任一者具有至少40％的同一性，优选具有至少50％、60％、70％的同一性，更优选与所述序列中的任一者具有至少80％的同一性，并且最优选与所述SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有90％或甚至95％的同一性。
就此而言，术语“同一性”是指两个氨基酸序列之间从第一个氨基酸到最后一个相应氨基酸相对于彼此的总体同一性。因此，只能将片段与成熟(多)肽的相应氨基酸(基本上相同数量的氨基酸)进行比较。
在本发明的一个实施方案中，包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中任一者的肽被修饰以增加抗微生物活性。
根据一个实施方案，所述肽用W、R、K、L、C、I、F和A-取代中的一个或多个进行修饰，更优选地用W、R和A-取代中的一个或多个进行修饰。这些取代增加了与微生物膜的相互作用，并且因此改善了抗微生物活性。
在一个实施方案中，由SEQ ID NO:4定义的肽(链100)包含选自由以下组成的组的一个或多个取代，优选五个、六个或甚至七个取代：V16K/L/W/R；Q15R/L/W/I/F/C；N14L/K/R/W；/W；A11W；M6W和I7W。
优选地，SEQ ID NO:4的氨基酸残基R8、L9和H10未被修饰。
根据一个实施方案，所述肽包含SEQ ID NO:4(链100)中的一个或多个取代或缺失，其选自由以下组成的组：
a.D1-/R
b.C2-/K
c.W3-
d.S4-/R
e.A5-
f.M6W
g.I7W
h.A11W
i.Y13W/R
j.N14L/K
k.Q15R/L
l.V16K/W
其中“-”表示氨基酸的缺失。
在本发明的一个实施方案中，当与由SEQ ID NO:4定义的原始肽(链100)相比时，肽具有1至5个(优选5个)已经缺失的N-末端氨基酸。已经发现较短的肽能够保持它们的抗微生物活性。另外，较短的肽导致较低的合成成本。
在另外的实施方案中，具有N-末端缺失的SEQ ID NO:4的肽变体进一步包含选自由以下组成的组的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部氨基酸修饰：V16K/W；Q15R/L；N14L/K；Y13R/W；A11W；I7W和M6W。
根据一个实施方案，由SEQ ID NO:5定义的肽用W、R、K、F、I和L-取代中的一个或多个进行修饰，更优选地用W、K和R-取代中的一个或多个进行修饰。这些取代增加了与微生物膜的相互作用，并且因此改善了抗微生物活性。
在一个实施方案中，由SEQ ID NO:5定义的肽(链200)包含选自由以下组成的组的一个或多个取代，优选至少六个、七个、八个、九个或甚至10个取代：N1R/K/W，R2W，I3L，V4/I/L，Q5W/K/R，Q6R/L/W，R7W，T8R/W/F，S9F/W/R/L和S10K/L。
备选地或另外地，由SEQ ID NO:5定义的肽能够通过在C-末端添加K来进行修饰(例如，由SEQ ID NO:15定义的链207)。
在一个实施方案中，由SEQ ID NO:5定义的肽的氨基酸残基R11未被修饰。
根据一个实施方案，所述肽包含SEQ ID NO:5(链200)中的一个或多个取代或缺失，其选自由以下组成的组：
a.N1K/R/W
b.R2W
c.I3L
d.V4I/L
e.Q5W/K/R
f.Q6R/L/W
g.R7W/R
h.T8R/W/F/K
i.S9F/W/R/L
j.S10K/L
根据一个实施方案，由SEQ ID NO:6定义的肽用W、R、K、L和I-取代中的一个或多个进行修饰，更优选地用W和R-取代中的一个或多个进行修饰。这些取代增加了与微生物膜的相互作用，并且因此改善了抗微生物活性。
在一个实施方案中，由SEQ ID NO:6定义的肽(链300)包含选自由以下组成的组的一个或多个取代，优选四个、五个、六个、七个、八个或甚至九个取代：Y1I/R/W/K，D2I/L/W/R，G4R/W，F5W/R，G6R/W/L，F8R，K9R，K10R和M11L/R/W/K。
优选地，由SEQ ID NO:6定义的肽的氨基酸残基K3和L7未被修饰。
备选地或另外地，由SEQ ID NO:6定义的肽能够通过在氨基酸残基9和10之间添加K来进行修饰(例如，由SEQ ID NO:32定义的链313)。
根据一个实施方案，所述肽包含SEQ ID NO:6(链300)中的一个或多个取代或缺失，其选自由以下组成的组：
a.Y1I/R/W/K
b.D2I/L/W/R
d.G4R/W
e.F5W/R
f.G6R/W/L
h.F8R
i.K9R
j.K10R
k.M11L/R/W/K。
在一个实施方案中，肽或其变体包含选自SEQ ID NO:4(链100)或者SEQ ID NOs 7至31(链101至125)之一的序列，或者由其组成。
在一个实施方案中，肽变体(肽)包含选自SEQ ID NOs 7至15(链101至109)的序列，或者由其组成。在一个实施方案中，肽变体包含选自SEQ ID NOs 10至15(链104至109)的序列，或者由其组成。在一个实施方案中，肽变体包含选自SEQ ID NOs 10、11和15(链104、105和109)的序列，或者由其组成。
在一个实施方案中，肽包含SEQ ID NO:4(链100)。在一个实施方案中，肽由SEQ IDNO:4(链100)组成。
在一个实施方案中，肽或其变体包含选自SEQ ID NO:5(链200)或者SEQ ID NOs32至54(链201至223)之一的序列，或者由其组成。
在一个实施方案中，肽变体包含选自SEQ ID NOs 32至41(链201至210)的序列，或者由其组成。在一个实施方案中，肽变体包含选自SEQ ID NOs 32、34、35和39(链201、203、204或208)的序列，或者由其组成。
在一个实施方案中，肽包含SEQ ID NO:5(链200)。在一个实施方案中，肽由SEQ IDNO:5(链200)组成。
在一个实施方案中，肽或其变体包含选自SEQ ID NO:6(链300)或者SEQ ID NOs55至79(链301至325)之一的序列，或者由其组成。
在一个实施方案中，肽变体包含选自SEQ ID NOs 55至67(链301至313)的序列，或者由其组成。在一个实施方案中，肽变体包含选自SEQ ID NOs 55、58、59和61至65(链301、304、305或307至311)的序列，或者由其组成。
在一个实施方案中，肽变体包含选自SEQ ID NOs 61和62(链307和308)的序列，或者由其组成。
在一个实施方案中，肽包含SEQ ID NO:6(链300)。在一个实施方案中，肽由SEQ IDNO:6(链300)组成。
证明了肽及其变体对不同微生物具有不同的抗微生物活性。在该研究中，针对细菌和真菌二者测试了抗微生物活性。
针对大肠杆菌(ATCC 25922)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 10031)、绿脓假单胞菌(ATCC27853)和金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)测试选择的肽(肽变体)的抗细菌活性。使用径向扩散测定和最小抑制浓度来确定抗细菌活性，其中径向扩散测定用于评价肽变体的抗真菌活性。
针对黄曲霉(DSM 1959)和产黄青霉(DSM 1075)测试抗真菌活性。
在一个实施方案中，肽或其片段是化学合成的(合成肽)。在另一个实施方案中，肽已经被重组产生。在一个实施方案中，从重组肽生产的生长培养基或合成介质中分离肽或多个肽。
在一个实施方案中，抗微生物肽任选地使用接头肽来附着于医疗装置、食品包装、载体物质或例如生物传感器。备选地或另外地，在另一个实施方案中，例如当在生物传感器中使用抗微生物肽时，肽附着于可检测试的试剂，诸如例如荧光剂或酶底物。在一个实施方案中，所述肽被固定在硅、聚乙烯和其它材料上以用作药物或涂层剂。
在溶血测定中，测量了128μg/ml浓度下肽溶解人红细胞以释放血红蛋白的能力。本文描述的肽优选地在哺乳动物体内具有低溶血活性(0.2-3.8％溶血)。测试的溶血浓度(128μg/ml)是链105、201和308的最小抑制浓度(MIC)的超过50倍，并且溶血在0.2-0.5％时各自可忽略不计。这些肽作为抗微生物药物是有用的，因为它们在杀死细菌所需的浓度下几乎不显示副作用或不显示副作用。
在一个实施方案中，肽或其变体展现针对微生物的活性，特别是针对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性，特别是针对葡萄球菌科和肠杆菌科的活性。在一个实施方案中，肽展现针对酵母和/或真菌的活性。
在一个实施方案中，肽或其变体展现针对细菌的活性。在一个实施方案中，肽或其变体展现针对真菌的活性。在一个实施方案中，肽或其变体展现针对细菌和真菌的活性。针对细菌和/或真菌的活性可以是例如抑制所述微生物的增殖或生长或者杀死它们。
在一个实施方案中，肽或其变体展现针对革兰氏阳性细菌的活性，特别是针对葡萄球菌科的微生物的活性，特别是针对金黄色葡萄球菌种属的微生物的活性。
基本上包含SEQ ID NOs:10至15(链104至109)、SEQ ID NOs:32、34至36、39至41(链201、203至205、208至210)和SEQ ID NOs:55至65和67(链301至311和313)中任一者的肽尤其对葡萄球菌科(特别是金黄色葡萄球菌)具有活性。金黄色葡萄球菌已经发展了对大多数市售抗生素的抗性。我们在本文描述的抗微生物肽是一类很有希望的新抗生素，因为它们不诱导微生物中的抗性。
在一个实施方案中，肽展现针对革兰氏阴性细菌的活性，特别是针对大肠杆菌的活性。基本上包含SEQ ID NOs:10至15(链104至109)、SEQ ID NOs:32、34至36、39至41(链201、203至206、208至210)和SEQ ID NOs:55至65和67(链301至311和313)中任一者的肽尤其对大肠杆菌具有活性。
在一个实施方案中，肽展现针对克雷伯氏杆菌属的活性，特别是针对肺炎克雷伯氏菌的活性。基本上包含SEQ ID NOs:10至15(链104至109)、SEQ ID NOs:32、34、35、39至41(链201、203、204、208至210)和SEQ ID NOs:55、58、59、61至65和67(链301、304、305、307至311和313)中任一者的肽尤其对克雷伯氏杆菌属具有活性。
在一个实施方案中，肽展现针对假单胞菌属的活性，特别是针对绿脓假单胞菌的活性。基本上包含SEQ ID NOs:10至12和15(链104至106、109)、SEQ ID NOs:32、34、35和39(链201、203、204、208)和SEQ ID NOs:55至65和67(链301至311和313)中任一者的肽尤其对假单胞菌属具有活性。
在一个实施方案中，肽展现针对曲霉属的活性，特别是针对黄曲霉的活性。基本上包含SEQ ID NO:10、11或15、SEQ ID NO:32或35(链104、105或109)、SEQ ID NOs:32或35(链201或204)；SEQ ID NOs:60、61、62和64(链306、307、308和310)中任一者的肽尤其对曲霉属具有活性。
在一个实施方案中，肽展现针对青霉属的活性，特别是针对产黄青霉的活性。基本上包含SEQ ID NO:10、11或15、SEQ ID NO:32或35(链104、105或109)、SEQ ID NOs:32或35(链201或204)；SEQ ID NOs:60、61、62和64(链306、307、308和310)中任一者的肽尤其对青霉属具有活性。
在一个实施方案中，肽展现针对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、绿脓假单胞菌、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、约氏不动杆菌(A.johnsonii)、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌(Candidaalbicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)和C.quillermondiae的临床菌株的活性。肽基本上包含SEQ ID NO:10、11或15、SEQ ID NO:32或35(链104、105或109)、SEQ ID NOs:32或35(链201或204)；SEQ ID NOs:58、60、61、62、63、64和65(链304、306、307、308、309、310和311)中任一者。
链104、链105、链109、链201、链204、链307、链308和链310是可证明的广谱抗微生物肽，在0.5至32μg/ml的范围内对革兰氏阳性细菌和阴性细菌具有活性，并且如通过溶血测定所测试的对人类几乎不具有副作用。
本发明还涉及包含本文所述的一种或多种抗微生物肽的抗微生物组合物。在一个实施方案中，这种组合物还包含药学上可接受的载体和任选的其它常规成分。
具有SEQ ID NO:4(链100)、SEQ ID NO:5(链200)、SEQ ID NO:6(链300)的肽，或者与所述序列具有至少37％，优选至少40％、50％、60％、70％，更优选至少80％且最优选至少90％的同一性的其变体，或者根据本公开的任何肽，在疗法中使用，特别是作为抗微生物剂使用。
抗微生物活性可以针对细菌或真菌或者细菌和真菌。细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。特别地，肽具有针对葡萄球菌属或大肠杆菌属或者葡萄球菌属和大肠杆菌属二者的微生物的活性。上面已经讨论了肽的各种抗微生物活性和溶血性质。
本发明的另一个实施方案是根据本公开的肽作为药物、饲料添加剂、防腐剂或表面活性剂的用途。
在一个实施方案中，具有SEQ ID NO:4、5或6中任一者的肽，或者与所述序列具有至少37％，优选至少40％、50％、60％、70％，更优选至少80％且最优选至少90％的同一性的其变体，或者根据本公开的任何肽，作为药物使用，尤其作为针对污染微生物(包括如上讨论的金黄色葡萄球菌)的药物使用。
本发明还涉及要求保护的本文所述的肽及其变体作为药物、饲料添加剂、防腐剂或表面活性剂的用途。由各种微生物产生的毒素污染人类食物和动物饲料，并且用作防腐剂的这些肽可以减少污染物的生长。上面已经结合其它实施方案讨论了肽的活性和其它性质。
链104、链105、链109、链201、链204、链307、链308和链310这些肽是可证明的广谱抗微生物肽，在0.5至32μg/ml的范围内对革兰氏阳性细菌和阴性细菌具有活性，并且如通过溶血测定所测试的对人类几乎不具有副作用。这些肽具有治疗由大肠杆菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 10031)、绿脓假单胞菌(ATCC 27853)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)引起的革兰氏阴性菌感染的潜力。
本发明还涉及杀死微生物或抑制微生物生长的方法，所述方法包括用本文所述的肽或其变体处理所述微生物的步骤。在一个实施方案中，肽或其变体展现针对微生物的活性，特别是针对革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌的活性，特别是针对葡萄球菌科和肠杆菌科的活性，特别是针对金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌种属的微生物的活性。在一个实施方案中，肽或其变体展现针对真菌的活性。在又一个实施方案中，肽或其变体展现针对真菌和细菌二者的活性。上面已经结合其它实施方案讨论了肽的活性和其它性质。
导管作为细菌的载体，通过附着到表面，然后到达尿道的管腔。大多数导管由硅橡胶制成，其中微生物容易粘附以形成生物膜并引起感染。已经开发了若干策略以通过使用抗生素化合物(例如利福平和米诺环素)或导管表面上的银涂层来克服这些问题。然而，在临床应用中使用细菌抗性和抗生素效力的抗生素风险发展并非众所周知的。在体外研究中发现镀银导管是无效的。
通过使用抗微生物肽(AMP)涂覆的导尿管能够防止与尿管相关的尿路感染(CAUTI)，所述导尿管也防止抗生素抗性的传播。
还应该理解的是，本发明的肽或其变体能够与需要抗微生物活性的各种用途一起使用。
应该理解的是，本文使用的术语是为了描述目的，并且不应该被认为是限制性的。
作为单独实施方案的本文所述发明的特征也可以在单个实施方案中组合地提供。在单个实施方案的情况中本文所述本发明的各种特征也可以分开提供或者以任何合适的子组合提供。应该理解的是，上述描述中给出的实施方案仅用于说明性目的，并且在本公开的范围内可能存在各种改变和修改。
下面将给出引用文献的列表。所有引用文献的内容通过引用并入本文。
以下非限制性实例对本发明进行了说明。
实施例
实施例1：总植物DNA的分离
岩高兰(Empetrum nigrum L.)的新鲜嫩叶用70％乙醇(v/v)进行表面灭菌1分钟并置于次氯酸钠(3.5％v/v)5分钟，并用于分离基因组DNA(
等人2001)。
实施例2：宏基因组文库构建和筛选抗细菌活性
从岩高兰分离的植物DNA溶解在无菌水中至0.1μgμl-1的浓度。然后将DNA在CHEF-DRII(Bio-Rad)系统中进行制备型脉冲场凝胶电泳。电泳条件(脉冲间隔和持续时间)为：分别地，N/S-60s和E/W–60s，持续6h；N/S-90s和E/W–90s，持续6h；N/S-99s和E/W–99s，持续6h；6V/cm的电压，120°固定角以及使用0.15×Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)缓冲液。在电泳期间，温度保持在10℃。电泳后，切下来自凝胶每一侧的条带，并且用溴化乙锭染色以显现DNA。然后将高分子量DNA从凝胶的剩余的未染色部分切下，并在含有0.5×TBE的透析袋中以100V电洗脱1小时。如前所述通过对真菌和细菌具有特异性的引物进行扩增(
等人2010，Tejesvi等人2010)以确认微生物DNA的分离。为了克隆，将约25–30kb的DNA进行末端修复以产生5’-磷酸化的DNA并连接至平端去磷酸化的pCC1FOSTM载体。使用MaxPlax Lambda包装提取物(Epicentre)将连接混合物包装到λ噬菌体中。然后将包装的文库转导到大肠杆菌EPI-300中，并在补充有氯霉素的LB琼脂平板上选择转化体。将包装的F黏粒(fosmid)文库作为克隆池储存在冷冻管中直到进行筛选，每个池中含有大约103个克隆。
如下进行F黏粒文库筛选：将克隆池解冻并涂布在补充有氯霉素的150-mm LB琼脂平板上，以获得每板约1000个菌落。将文库平板在30℃温育过夜，然后在室温(RT)温育额外的3-5天。用含有指数生长的金黄色葡萄球菌的顶层琼脂覆盖平板，并在37℃温育过夜，然后在RT进一步温育3-5天。具有抗细菌活性的菌落通过抑制金黄色葡萄球菌生长的区域来鉴定。穿过顶层琼脂挑取所述菌落，并将其通过在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上划线从氯霉素敏感的测定菌株(金黄色葡萄球菌)中分离。通过用BamHI消化和电泳进行所选抗细菌F黏粒克隆的限制性分析。
实施例3：菌株，质粒和生长条件
EPI-300TM-T1R噬菌体T1抗性大肠杆菌培养物在37℃在Luria-Bertani(LB)琼脂上或在补充有适当抗生素的LB肉汤+10mM MgSO4中生长。以下抗生素浓度用于大肠杆菌菌株：氯霉素12.5μg ml-1和氨苄青霉素100μg ml-1。携带两个复制起点(单拷贝起点(ori2)和可诱导的高拷贝起点(oriV))的质粒pCC1FOS TM(Epicentre,Madison,USA)被用来构建来自岩高兰内寄生菌的宏基因组文库并用于对赋予所述抗细菌活性的基因进行亚克隆。pET11-c载体用于表达宿主菌株金黄大肠杆菌BL21(DE3)中负责抗细菌活性的基因。
实施例4：克隆pFosS1A的亚克隆和测序
将选自琼脂覆盖测定的抗细菌F黏粒克隆命名为pFosS1。使用Plasmid Midiprep试剂盒(Qiagen)分离宏基因组F黏粒，并使用Sau3AI对其进行部分消化(0.1Uμl-1的DNA，37℃进行15min)并进行电泳以进行DNA的大小选择和亚克隆。从凝胶中提取大于1.5kb的片段，进行末端修复并连接到平端去磷酸化的pCC1FOSTM中。将连接混合物转化到大肠杆菌中，并通过琼脂覆盖测定筛选重组克隆，并将其涂布在补充有氯霉素的LB平板上。用BamHI消化后通过凝胶电泳分析显示金黄色葡萄球菌抑制的清亮区的亚克隆，以选择含有约1.8kb的最小插入物的亚克隆。将该亚克隆命名为pFosS1A，并根据制造商的说明书用pCC1正向引物和pCC1反向引物进行测序(Abi 3730DNA分析仪，Abi Prism BigDye Terminator Cycle测序试剂盒，Applied Biosystems，Warrington，UK)。将包含在亚克隆pFosS1A中的开放阅读框命名为En-MAP1，并通过Genbank的BLAST程序以及SignalP和pfam进行分析。
实施例5.宏基因组文库的构建和筛选
将对应于内寄生菌DNA的条带与岩高兰基因组DNA分离，其在PFGE电泳后残留在琼脂糖凝胶的孔中。通过用对真菌和细菌具有特异性的引物扩增PCR产物来证实条带中内寄生菌DNA的存在。从20μg DNA中获得大约8,000个宏基因组克隆。通过琼脂覆盖法筛选宏基因组文库导致鉴定了一种展现金黄色葡萄球菌抑制区的抗细菌克隆。然而，没有观察到宿主大肠杆菌的生长抑制。限制性片段分析揭示了所述克隆携带大小超过30kb的插入DNA。从抗细菌克隆产生次级文库以选择抗细菌亚克隆并表征负责抗细菌活性的各个基因。抗细菌亚克隆的限制性片段分析鉴定了亚克隆pFosS1A中1.8kb的最小插入物，其在琼脂覆盖测定中仍展现金黄色葡萄球菌的生长抑制(图1)。
实施例6：克隆上清的分级(fractionation)和分析
携带亚克隆pFosS1A和对照(空载体)的大肠杆菌细胞在含有氯霉素的LB-肉汤中在37℃生长过夜。这些培养物被用作拷贝数扩增程序的接种物。将一体积的这些培养物加入到10体积的新鲜LB+氯霉素中，并将1/100的CopyControl诱导溶液(Epicentre)加入到培养基中以将克隆诱导至高拷贝数。在37℃剧烈振荡培养物20小时后，通过在4℃以3040×g离心20分钟从细菌细胞分离上清。用Heto PowerDry LL1500冷冻干燥器(ThermoElectron,Mukarov,Czech Republic)将上清冻干。将冻干的肉汤称重，并将50mg溶解在2ml的蒸馏水中。将材料置于超声波发生器中20分钟，离心10分钟，过滤(GHP Bulk Acrodisc 13,PallLife Sciences)，并通过半制备型高压液相色谱(HPLC)分级。然后使用金黄色葡萄球菌作为测试菌株通过96孔板标准方法对级分测试抗细菌活性。通过结合Micromass LCT飞行时间质谱(TOFMS)(Micromass,Altrincham,UK)的Alliance 2690HPLC(Waters,Milford,MA,USA)对亚克隆pFosS1A和对照的上清分析小分子。
实施例7.抗细菌亚克隆的序列分析
亚克隆pFosS1A的插入物在两个方向上进行完全测序，并且其含有约1650bp的独特开放阅读框。推定的核糖体结合位点和启动子序列存在于起始密码子的-35/-10上游区域。针对Genbank数据库中存在的序列将核苷酸序列进行BLAST分析，但是没有鉴定出与任何已知序列的相似性。这表明分离的基因编码新结构的蛋白质，并且因此将所述蛋白质命名为岩高兰宏基因组抗细菌蛋白1(En-MAP1)。推导的氨基酸序列的分析揭示了En-MAP1编码549个氨基酸的蛋白质(图2)，所述蛋白质与来自Pseudozyma hubeiensis的假设蛋白质具有32％的最高相似性并且与任何已知功能的蛋白质不具有相似性。SignalP分析表明，En-MAP1的氨基酸序列不具有用于分泌或转位的推定的氨基末端信号序列。当使用pfam蛋白质家族数据库对推导的氨基酸序列分析保守基序时，在位置77至107、126至153和392至420aa处鉴定出三个三角状五肽重复基序(图2)。预测En-MAP1是由TMpred和PSORT分析的不具有跨膜区域的可溶性蛋白质。通过PSORT分析，残基147–176也包括预测的卷曲螺旋(coil-coil)区域(其对于蛋白质-蛋白质相互作用中涉及的蛋白质而言是典型的)，以及残基490处开始的可能的亮氨酸拉链。
实施例8：pET23(b)中的蛋白表达
使用具有Nde1和Sal1限制性位点pFosS1F(CATATGAGACTAGTAGCTCATCCTGTTCCTGATGC；SEQ ID NO:2)和pFosS1R(GTCGACTTATTAACGAGATGACGTCCTCTGCTGTACG；SEQ ID NO:3)的引物扩增基因En-MAP1。将扩增产物克隆到pET23(b)载体中，转化到XL1感受态细胞中，并通过测序确认基因同一性。使用大肠杆菌菌株BL21pLysS和BL21pRARE作为宿主进行表达研究。蛋白质在两个菌株中均表达为包涵体，分离所述包涵体(van Lith等人.2007)。将包涵体悬浮于5M盐酸胍/0.2M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，并且在AKTA FPLC中使用从3M胍/0.2M磷酸钠(pH 7.0)到0.2M磷酸钠(pH 7.0)的线性缓冲液交换使蛋白质在HisTrap柱(GEHealthcare Life Sciences)上重折叠超过4小时，最后用50mM EDTA/20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗脱。En-MAP1的核苷酸序列已经以登录号KC466596存放于GenBank。
实施例9：蛋白质的抗细菌活性分析
通过将10μg的蛋白质移液到LB平板上的金黄色葡萄球菌培养物上对折叠和未折叠的蛋白质二者测试针对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性。还在以30和60μg/ml的浓度用0.01％乙酸中的胰蛋白酶消化的折叠和未折叠的蛋白质中测试活性。
实施例10：抗微生物肽和肽合成的预测
蛋白质En-MAP1进行经由计算机的-胰蛋白酶消化(http://au.expasy.org)，并且通过三种不同的算法(支持向量机(SVM)分类器，随机森林分类器和判别分析分类器)且通过APD2(http://aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction_main.php)，12个肽(Met1–Met12)被预测(http://www.bicnirrh.res.in/antimicrobial)是抗微生物的。合成肽购自GenScript,USA。
实施例11：合成肽的抗微生物活性
如Andersen等人(2010)所描述的进行径向扩散测定(RDA)。简言之，将30ml的补充有1％琼脂糖和5.0×105CFU/ml金黄色葡萄球菌或大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌、绿脓假单胞菌细胞的1/10Muller-Hinton肉汤(MHB)倒入单孔全盘(omnitray)(Nunc)并用TSP 96孔板覆盖。测试100μg的每种合成肽。还针对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和大丽轮枝菌对肽进行了测试，其中使用了1/3马铃薯葡萄糖琼脂糖。为了测试肽的协同作用，将每种肽以等摩尔浓度混合。制备Mix1(met1–12)、Mix2(met3、4和5)、Mix3(met 8、9和10)、Mix 4(met11、12)和Mix5(8、9、10、11、12)，并针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行测试。包括庆大霉素和万古霉素作为细菌的阳性对照，并且将两性霉素B用作真菌的对照。
针对大肠杆菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 10031)和绿脓假单胞菌(ATCC 27853)确定最小抑制浓度(MIC)。还将大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、绿脓假单胞菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、约氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌的临床菌株用于MIC分析。另外，使用包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和C.quillermondiae的酵母的临床菌株。使用微量肉汤稀释测定确定这些微生物对链肽的敏感性。将来自温育过夜的Muller Hinton(MH)琼脂平板的各个微生物的菌落悬浮于MH肉汤培养基中，并将微生物的终浓度调节至5.0x105cfu/ml。将10μl的各链肽的等分试样或作为参比抗生素的庆大霉素、四环素连同90μl的细菌悬液以不同的浓度加入到96孔聚丙烯板，并在37℃温育20至24小时。链肽和参比抗生素的浓度在0.125至128μg/ml的范围内，并且在没有目视的细菌生长的情况下将MIC记录为最低浓度。类似地，在马铃薯葡萄糖肉汤中测试抗真菌MIC。
实施例12：抗细菌克隆的表达分析
通过HPLC-MS分析表达pFosS1A的亚克隆在液体培养基中可能产生的抗微生物小分子并与对照(空载体)进行比较。对于抗细菌克隆和对照，峰的色谱图和光谱是相同的。将培养基分级并测试针对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性，但是没有检测到活性。这表明针对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性不是来自由En-MAP1活性产生的代谢物。
然后将基因En-MAP1克隆到表达质粒pET23(b)中以分析抗细菌活性是否是由蛋白质本身引起的。得到的构建体pET23(b)-FosS1A框内地含有En-MAP1基因。当转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLyseS和BL21(DE3)pRARE中时，在诱导的培养物的细胞提取物中(而不是在未诱导的培养物中)产生大约63kDa的蛋白质(预测质量为63.3kDa)。得到的蛋白质在蛋白质序列的第一个氨基酸之前包括氨基酸序列MHHHHHHM-。蛋白质在两种菌株中均作为包涵体表达，并且它们在His-Trap柱中纯化并折叠，得到约1mg的纯的折叠蛋白质。测试折叠蛋白质针对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性，并且没有观察到活性。为了测试是否由于备选翻译起始位点而导致较短片段负责抗细菌活性，设计并表达了编码En-MAP1的较短片段的三种构建体，但是未观察到活性。然而，当用胰蛋白酶消化折叠的完整En-MAP1蛋白(SEQ ID NO:1)时，在消化后观察到抗细菌活性多达2小时(数据未显示)。未折叠蛋白质的胰蛋白酶消化中未检测到活性。这表明抗细菌活性是由蛋白质的片段化造成的，蛋白质的片段化产生了肽，其含有被折叠结构保护的内部胰蛋白酶切割位点。
为了进一步鉴定负责抗微生物活性的肽，将En-MAP1蛋白经由计算机进行消化，并且合成预测为抗微生物的肽。在经由计算机的分析中包括若干限制性内切酶、蛋白酶和化学化合物(诸如ArgC蛋白酶、Asp-N内肽酶(EC 3.4.24.33)、胰凝乳蛋白酶-HS30(EC3.4.21.1)、梭菌蛋白酶、CNBr(EC 208-051-2)、甲酸、Lys-C、亚碘酰基苯甲酸、脯氨酸内肽酶和胰蛋白酶)的切割位点。使用四种不同的算法(支持向量机(SVM)分类器，随机森林分类器，判别分析分类器和APD2)预测肽片段的抗微生物活性。
这些肽中的大多数来自胰蛋白酶消化预测，而三种肽(在图3中显示为Met10、Met11和Met12，并且在表(1、2a、2b、2c、3a、3b和3c)和序列表中分别显示为由SEQ ID NO:4定义的链100、由SEQ ID NO:5定义的链200和由SEQ ID NO:6定义的链300)分别由Asp-N-内肽酶16、胰凝乳蛋白酶-HS30和CnBr消化而产生。这些肽中的八个含有内部胰蛋白酶切割位点。
实施例13：盐、pH和热稳定性
通过在PBS缓冲液(pH 7.4)中将肽稀释至2mg/ml的浓度并在不同的温度(诸如+4℃、25℃(RT)、37℃和45℃)下温育来评价热稳定性，储存在-20℃的肽用作对照。在每个时间间隔后，取出100μl(2mg/ml)的肽并在-20℃储存用于径向扩散测定以确定抗细菌活性(图8)。还通过在从pH 4开始到pH 9的不同pH值下稀释肽来测试它们。通过将不同浓度(50、100和200mM)的NaCl添加到MH培养基中来测试NaCl对抗微生物活性的影响，并且针对4种ATCC细菌菌株测试了最小抑制浓度。
实施例15：涂覆和未涂覆的硅导管上的细菌粘附
将涂覆的(链105或链201)和未涂覆的硅导管切成0.5cm的片，并置于悬浮有1ml的磷酸盐缓冲液盐水(PBS)中的5x 105CFU/mL细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)培养物的24孔板中。样品在37℃以150RPM温育6小时。温育后，使用新鲜的PBS将每个导管片用1ml的PBS冲洗2次。将导管片转移至Eppendorf管中并加入500μl的PBS，在水浴中超声处理2分钟，涡旋5秒，连续稀释，并确定CFU。
实施例14：制备用于透射电子显微镜(TEM)的细胞
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长至中指数期，并通过在600nm处获取吸光度在Muller Hinton肉汤(MHB)培养基中稀释至0.1的细胞密度，并在37℃与10μg/ml链肽温育1小时。温育后，加入等体积的0.1M磷酸盐缓冲液中的2％戊二醛，通过以5000rpm离心2分钟使细胞沉淀，并且将细胞沉淀用0.1M磷酸盐中的1％戊二醛固定。细胞用四氧化锇进行后固定，使用增加浓度的丙酮或乙醇进行脱水，并包埋在塑料树脂(Epon)中。在用TEM进行观察之前用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对超薄切片(70–80nm)进行后染色。使用具有Veleta和Quemesa CCD相机的Tecnai G2Spirit 120kV TEM进行显微镜检查。
针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和大丽轮枝菌测试了十二种肽(Met1-Met12)的抗微生物活性。通过径向扩散测定进行初步筛选以确认抗微生物活性。肽Met1、Met3、Met4、Met5、Met10、Met11和Met12对大肠杆菌具有活性(图3)，并且Met3、Met10和Met11展现了针对金黄色葡萄球菌的活性，每种的浓度为100μg/孔。还通过混合等摩尔浓度的肽来测试肽的协同作用，但是没有观察到活性上的显著差异。观察到Met8针对大丽轮枝菌的中等抗真菌活性(数据未显示)。针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对所有样品进行最小抑制浓度(MIC)测定。Met11在95μM的浓度下具有活性，其余的肽具有>190μM的MIC。除Met12之外，预测所有的肽都具有α螺旋结构。
通过使用合理的设计技术，我们已经通过在原始肽中并入或置换各种氨基酸来设计肽的变体。因此，我们已经在各种位置处用色氨酸(W)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)对链100、链200和链300进行了设计和修饰，以改善抗微生物活性(图4a-c和5a-c)。在一些肽中，我们还已经使用了其它氨基酸，诸如亮氨酸(L)、半胱氨酸(C)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)和丙氨酸(A)。对于合成，基于各种参数诸如正电荷、脂肪族指数和不稳定性指数选择了32种变体和3种原始肽。通过使用针对大肠杆菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 10031)和绿脓假单胞菌(ATCC 27853)的径向扩散测定来测试肽变体(图6a–c)。抑制区域的范围对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在10–18mm之间，对于绿脓假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌是6–18mm和8–18mm(表2)。对于庆大霉素，其在22–24mm之间。针对黄曲霉(DSM 1959)和产黄青霉(DSM 1075)测试了有希望的抗细菌肽(链104、105、109、201、204、306、307、308、310)的抗真菌活性。所有这些肽在20μg的浓度下具有活性，两性霉素B在20μg下用作阳性对照(图7)。
通过微量肉汤稀释法测试最小抑制浓度(MIC)，并且链104、105和109在1–8μg/ml之间分别抑制大肠杆菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 10031)和绿脓假单胞菌(ATCC 27853)的生长(表3a、3b和3c)。通过测量从志愿者捐献的新鲜血液的红细胞的血红蛋白的释放来测试肽的溶膜活性。根据Schmidtchen等人,2011的方案，通过在540nm处获取OD经由分光光度法确定血红蛋白水平。范围在0.1至9％之间的百分比溶血表明这些肽中的大多数在128μg/ml的浓度下对宿主没有任何影响(表3)。
发现链104、链105、链109、链201、链204、链304、链306、链307、链308、链309、链310和链311这十二个肽对所述四种ATCC菌株非常具有活性，并且因此将其作为D-型氨基酸进行合成且针对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、绿脓假单胞菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、约氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌的临床菌株进行测试。也用12个链肽对包括白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和C.quillermondiae的酵母的临床菌株进行测试。最小抑制浓度(MIC)在这些肽之间是变化的，并且呈现于表4a、4b、4c和5a、5b、5c中。链105、201和308这些肽是广谱抗微生物剂，其除了对雷氏菌和奇异变形杆菌具有64–128μg/ml之间的MIC以外，对所有测试的细菌和酵母具有0.5–32μg/ml之间的MIC。链306这种肽针对大肠杆菌具有1μg/ml的窄谱活性，并且对于其余的细菌菌株具有>32μg/ml的窄谱活性(图10c)。
针对金黄色葡萄球菌的抗生素敏感的菌株RN4220和金黄色葡萄球菌的甲氧西林抗性菌株COL(MRSA)对链104、链105、链201、链308、链310这些肽进行了测试。针对这些细菌测试了包含L-型或D-型氨基酸的链肽，并且发现与L-型相比，D-型肽具有更好的活性(表6)。测试链肽连同厄他培南(Ertapenem)(4μg/ml)的协同活性以了解其是否将影响针对MRSA菌株的活性。发现所有的链肽都具有针对MRSA菌株的抗细菌活性，MIC在0.03至4μg/ml的范围内。连同厄他培南(4μg/ml)，对于L-肽和D-肽两种形式，链310具有针对MRSA菌株的最佳抗细菌活性，MIC为0.06和0.03μg/ml(表6)。
许多抗微生物肽(AMP)对细菌和真菌的临床菌株具有广谱抗微生物活性。抗微生物肽通过盐敏感步骤经由与细菌膜的静电相互作用形成二级结构。因此，人体液中的高盐浓度能够使许多AMP失活，并且开发应用于医疗保健的耐盐AMP是至关重要的。然而，众所周知的是生理条件、pH、温度和高盐浓度将影响这些肽的活性。我们已经评价了链104、105、201、204、306和308的pH、盐-和热稳定性，并发现这些肽在pH或甚至高达45℃的温度达超过14天都没有受到阻碍(图8和9)。然而，使用200mM NaCl浓度时，链104、105、201、204、306和308的MIC值增加了2倍。
需要进行电子显微镜研究，以了解在细胞表面上用5X MIC处理后细胞上AMP的作用机制，以及细胞内改变。即使在低浓度下，AMP典型地在细胞膜上引起多重应力。大肠杆菌的细胞结构复杂，具有细胞质膜(7nm)、肽聚糖层(7–8nm)和外膜(10–15nm)。大肠杆菌的抗生素抗性是由内部肽聚糖连同外膜的存在造成的。与链肽(105、201、308)温育后，几乎所有的大肠杆菌细胞都丧失了杆状结构完整性，并且在细胞中观察到颗粒结构的积聚、从细胞表面突出的气泡样结构以及变形(图11)。链肽与金黄色葡萄球菌脂双层的相互作用可以通过膜面积的扩大而观察到。我们还观察到随着细胞内形成细胞内双层膜和间体样结构，细胞质膜和球形间体的扩散。
与导管有关的感染由浮游细菌细胞通过定殖(colonization)和生物膜形成而粘附到生物材料表面而引起。固定有链201或链105的导管对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有优异的抗微生物活性。观察到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活细胞分别减少超过70％和30％(图12)。
表2a.通过径向扩散方法的肽变体的抗细菌活性。对于各个细菌病原体，抑制区域以毫米提供。
测试浓度：庆大霉素–5μg；肽–50μg
大肠杆菌(ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)，肺炎克雷伯氏菌(ATCC10031)和绿脓假单胞菌(ATCC 27853)
*包括孔的直径值。
表2b.通过径向扩散方法的肽变体的抗细菌活性。对于各个细菌病原体，抑制区域以毫米提供。
测试浓度：庆大霉素–5μg；肽–50μg
大肠杆菌(ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)，肺炎克雷伯氏菌(ATCC10031)和绿脓假单胞菌(ATCC 27853)
*包括孔的直径值。
表2c.通过径向扩散方法的肽变体的抗细菌活性。对于各个细菌病原体，抑制区域以毫米提供。
测试浓度：庆大霉素–5μg；肽–50μg
大肠杆菌(ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)，肺炎克雷伯氏菌(ATCC10031)和绿脓假单胞菌(ATCC 27853)
*包括孔的直径值。
表3a.针对4种细菌病原体测试的不同肽变体的最小抑制浓度。肽的溶血活性在128μg/ml测试，并呈现溶血百分比。
*在128μg/ml测试
表3b.针对4种细菌病原体测试的不同肽变体的最小抑制浓度。肽的溶血活性在128μg/ml测试，并呈现溶血百分比。
*在128μg/ml测试
表3c.针对4种细菌病原体测试的不同肽变体的最小抑制浓度。肽的溶血活性在128μg/ml测试，并呈现溶血百分比。
*在128μg/ml测试
表4a：如通过微量稀释法确定的肽变体的最小抑制浓度。
*使用在0.02％BSA和0.2％乙酸的存在下调节的Muller Hinton肉汤-阳离子通过微量稀释法确定MIC值。
表4b：如通过微量稀释法确定的肽变体的最小抑制浓度。
*使用在0.02％BSA和0.2％乙酸的存在下调节的Muller Hinton肉汤-阳离子通过微量稀释法确定MIC值。
表4c：如通过微量稀释法确定的肽变体的最小抑制浓度。
*使用在0.02％BSA和0.2％乙酸的存在下调节的Muller Hinton肉汤-阳离子通过微量稀释法确定MIC值。
表5a：针对临床酵母菌株测试的肽变体的最小抑制浓度
表5b：针对临床酵母菌株测试的肽变体的最小抑制浓度
表6.肽变体对金黄色葡萄球菌的抗生素抗性和敏感性菌株的最小抑制浓度(MIC)以及与厄他培南的协同活性。
*D–D-氨基酸。
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Claims (5)
1.由SEQ ID NO:32、36至37和39至40任一个组成的抗微生物肽。
2.一种杀死或抑制微生物生长的体外方法，包括用权利要求1的肽处理所述微生物的步骤，其中所述方法不用于疾病治疗或诊断目的。
3.根据权利要求2的方法，其中所述肽表现出针对细菌或真菌或细菌和真菌二者的活性。
4.权利要求1的肽在制备抗微生物药物中的用途。
5.根据权利要求1所述的肽作为饲料添加剂、防腐剂或表面活性剂的用途，其中所述用途不用于疾病治疗或诊断目的。
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