KR101666564B1

KR101666564B1 - 항바이러스 및 항병원성세균 활성을 가진 락토바실러스 프란타륨 Probio 090 및 이의 생산물

Info

Publication number: KR101666564B1
Application number: KR1020140143099A
Authority: KR
Inventors: 박용하
Original assignee: 주식회사 프로바이오닉
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2016-10-17
Also published as: WO2016064000A1; KR20160047125A

Abstract

본 발명은 항바이러스 및 항병원성세균 활성을 갖는 락토바실러스 프란타륨 Probio 090에 관한 것으로, 보다 구체적으로 바이러스 활성 및 인플루엔자 바이러스의 생육을 억제하는 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양물 또는 이의 생산물 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양산물 또는 이의 생산물은 발효음료, 김치용 스타터, 발효식품 등 식품용 조성물, 생균제, 정장용 조성물 등 약학 조성물, 발효사료, 화장품, 살균제 등 다양한 분야에 활용가능하다.

Description

항바이러스 및 항병원성세균 활성을 가진 락토바실러스 프란타륨 Probio 090 및 이의 생산물{Lactobacillus plantarum Probio 090 having anti-virus and anti-pathogenic bacterial activity and products from Lactobacillus plantarum Probio 090}

본 발명은 병원성바이러스 및 병원성세균을 유산균을 이용하여 억제하는 것으로, 보다 구체적으로는 인플루엔자 바이러스, 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 생육을 억제하는 대사산물을 생산하는 락토바실러스 프란타륨(Lactobacillus plantarum) Probio 090 및 이의 사용 용도에 관한 것이다.

인류의 건강을 위협하는 바이러스성 질병의 병인 중 하나인 인플루엔자 바이러스는 공기로 쉽게 전파되는 성질이 있다. 특히 산업화로 인한 인구 증가로 바이러스 병원체의 전파가 용이해 지면서 인플루엔자 바이러스에 의한 질병이 지속적으로 발생하고 있다. 이에 인플루엔자 바이러스의 효과적인 예방 및 대응 방법이 요구된다.

인플루엔자 바이러스에 의한 피해는 오랜 동안 지속되어 왔었다. 특히, 이 바이러스는 20세기 전반에 범세계적인 대유행(pandemic) 발생이 있었으며 이로 인해 많은 인명 피해와 경제적 손실이 발생하였다. 1918년 발생하여 대유행한 스페인독감(Spanish flu)의 경우 인플루엔자 H1N1 형에 의한 것으로 2천만에서 5천만에 이르는 인명이 사망하였다. 1957년에는 H2N2 형의 Asian Influenza가 발생하여 백만명 이상의 인명피해가 발생하였다. 1968년에 발생한 Hong Kong Flu는 H3N2 형으로 백만명 가까운 인명 손실을 초래하였다. 1977년에는 Russian Flu로 불리는 질환이 대 유행하였으며 이는 H1N1 형 바이러스가 원인 병원체였다. 가장 최근의 유행성독감의 창궐은 2009년의 pandemic flu로 H1N1 형의 인플루엔자 바이러스가 병원체였다. 과거부터 최근까지 대유행한 인플루엔자 바이러스는 몇 가지 형으로 나누어져 있으나, 최근 유전자 분석 결과를 통하여 모두가 직접 혹은 간접적으로 조류인플루엔자 바이러스에서 유래되었음이 밝혀졌다.

한편, 대장균, 이질균, 포도상구균 등은 장내 건강을 위협하는 병원성 세균으로 이들을 억제하기 위한 항생제의 사용은 약제 내성균의 증가를 야기하고 있다. 그럼으로 항생제를 사용하지 않는 병원균 억제 방법의 개발 및 이용은 세균성질병 억제를 위해 필수적으로 요구된다.

Lange-Starke 등이 스타터로 사용하는 유산균 배양체의 항바이러스 활성을 조사하였으나 H1N1형의 인플루엔자 바이러스에 활성이 있는 것은 없었고, murine norovirus S99(MNV)의 생육만 일부 감소 시켰다(Food Environ Virol. 2013 Dec 3). 하지만, 특허출원번호 PCT/KR2010/003895에서는 바이셀라 시바리아(Weissella cibaria) BLS13에 의한 조류 인플루엔자 바이러스의 억제가 보고되었으며, 특허 출원번호 PCT/KR2011/003522에서는 락토바실러스 사케이 Probio 65 균주가 H9N2형의 인플루엔자 바이러스에 의한 세포병변형성을 억제함을 보고하였다.

상기와 같이 지속적으로 인류의 건강을 위협하는 바이러스의 감염을 사전에 예방하려는 시도와 감염자의 치료를 위한 약제의 개발이 계속 진행되고 있다. 하지만 백신의 접종에 의한 인플루엔자 바이러스의 감염 억제는 범발하여 유행하는 바이러스의 형과 백신의 바이러스의 형이 맞지 않으면 효능에 문제점이 있어 예방에는 한계가 있다. 또한 항바이러스제의 경우 최근 내성 및 부작용에 관한 연구가 보고 되고 있다. 따라서 인플루엔자 바이러스에 대한 억제 효과를 가지며 안정성에 문제가 없는 치료예방제의 지속적인 개발이 요구되고 있다. 최근에 유산균에 의한 항바이러스 기능이 보고되고 있지만 바이러스의 변종 발생 등을 고려하여 추가적인 기능성 생물제제의 개발이 필요하다.

한국특허공개공보 제10-2014-0022506호 (2014.02.25)

본 발명의 목적은 항바이러스 및 항병원성세균 활성을 갖는 락토바실러스 프란타륨 Probio 090 균주(수탁번호: KCTC 12694BP)를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 생산물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 또는 항병원성세균용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항바이러스 및 항병원성세균 활성을 갖는 락토바실러스 프란타륨(Lactobacillus plantarum) Probio 090 균주(수탁번호: KCTC 12694BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 생산물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 생산물을 유효성분으로 포함하는 항병원성세균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양산물 또는 생산물은 인플루엔자 바이러스를 포함한 바이러스에 대한 저해활성을 나타내기에, 이를 사료, 발효제품, 건강식품 등의 식품, 의약품, 화장품 등 다양한 분야에 활용할 수 있다.

도 1은 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여, 관련된 락토바실러스 속의 세균과 Probio 090의 상관관계를 나타내는 계통분석도 이다.
도 2는 Madin-Darby canine kidney(MDCK) 세포주에 인플루엔자 바이러스 H1N1을 감염시킨 후 락토바실러스 프란타륨 Probio 090을 처리하고 감염된 세포주를 계속 배양한 실험 결과를 나타낸 것이다 (A, IFV H1N1 바이러스 감염; B, 락토바실러스 프란타륨 Probio 090 과 IFV H1N1 바이러스 처리; C, MDCK cell 세포주).
도 3은 종란에 락토바실러스 프란타륨 Probio 090과 인플루엔자 바이러스 H1N1을 접종하여 5일간 배양 후 혈구응집시험 (hemagglutination test, HA)을 실시한 결과를 나타낸 것이다 (A, IFV H1N1 type; B, PBS buffer; C, 락토바실러스 프란타륨 Probio 090(1:10^-4) + IFV H1N1 type; D, 락토바실러스 프란타륨 Probio 090(1:10^-5) + IFV H1N1 type)
도 4는 병원성세균 억제를 확인하는 것으로 E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus를 각각 액체배지에서 배양하여 이를 한천평판배지에 도말한 후, 한천배지의 중심부에 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 배양 상징액을 함유하는 디스크페이퍼를 놓은 후, 각각의 병원균을 배양하여 유산균 배양 상징액에 의한 병원균의 억제를 관찰한 것이다. (A, E. coli; B, Salmonella; C, Staphylococcus aureus).

바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스에 대한 치료제로서 타미플루와 리렌자가 사용되고 있다. 하지만 이 두 치료제에 대한 내성이 증가된 돌연변이 인플루엔자 바이러스가 현재 출현하고 있다. 새로이 출현한 신종 플루는 타미플루 및 리렌자 등이 더 이상 억제력을 발휘하지 못하고 있다. 이에 본 발명자는 항바이러스 활성이 강하며, 천연에서 추출하여 인체에 대한 부작용이나 내성의 우려가 적고, 돌연변이 바이러스 출연에도 저항성을 나타낼 수 있는 신규한 물질을 찾고자 노력하던 중, 본 발명의 유산균에 의해 상기 문제점이 해결될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항바이러스 및 항병원성세균 활성을 갖는 락토바실러스 프란타륨 Probio 090 균주(수탁번호: KCTC 12694BP)를 제공한다.

상기 균주는 김치로부터 분리된 식물성 프로바이오틱 유산균으로, 37℃에서 24시간 동안 MRS 고체배지 또는 MRS 액체배지 (Difco laboratories, Detroit, MI, USA)에서 배양한 후 순수 분리하였다. 분리한 유산균의 분자생물학적인 동정을 위해 이 유산균의 게놈 DNA에 포함된 16S rRNA 염기서열을 분석 (16S rRNA sequencing)하여 유사한 서열을 가진 표준 균주들과 비교하여 계통학적 분석을 하였다. 또한 균주 생리 생화학적은 특징을 조사하여 그 결과를 동정에 이용하였다. 분리한 김치미생물의 미생물학적 분류를 위한 실험은 실시예 1과 같다.

상기 균주는 2014년 10월 16일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생명자원센터에 기탁번호 KCTC 12694BP로 기탁되었다.

산에 약한 유산균은 섭취 후 위에서 사멸할 가능성이 높다. 본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 인공위액과 인공담즙액에서의 생육을 알아본 실험의 결과는 실시예 2와 같다. 이 유산균은 인공위액(pH 2.5)에서 24시간 배양한 후 약 85% 이상 생존하였고, 인공담즙액에서 24시간 배양한 후 80% 이상 생존하였다. 그럼으로, 본 발명의 균주는 산과 담즙에 대한 내성이 있어서 위장관에서의 높은 생존 가능성을 가진다.

또한 상기 균주는 겐타마이신(Gentamicin), 카나마이신 (Kanamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 에리트로마이신(Erythromycin), 클린다마이신(Clindamycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 암피실린(Ampicillin)등의 항생제에 대해 감수성이 보였다.

락토바실러스 프란타륨 Probio 090에 의한 인플루엔자 바이러스의 억제 실험의 결과는 실시예 3과 같다. 본 유산균은 세포주와 종란 (embryonated egg)을 사용한 실험에서 인플루엔자 바이러스 증식을 강하게 억제하였다.

본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090은 항바이러스 활성이 강할 뿐 아니라, 장기간 안정성과 유용성을 인정받은 김치에서 추출한 것으로 부작용이나 내성의 우려가 적다.

또한, 본 발명에 따른 미생물은 당업계에 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량될 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

본 발명의 균주가 억제할 수 있는 바이러스는 특별히 한정된 것은 아니고, 병원성 바이러스일 수 있다. 바람직하게는 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 인플루엔자 바이러스는 혈청형 H1N1 일 수 있다.

본 발명의 균주가 억제할 수 있는 병원성 세균은 특별히 한정된 것은 아니다. 바람직하게는 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella) 또는 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 일 수 있다.

상기 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 이용은 특별히 한정된 것은 아니고, 배양상태를 그대로 사용하거나 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉장하거나 냉동 건조하여 그 항바이러스 혹은 항병원성세균 활성이 유지되도록 보존할 수 있다.

상기 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 배양산물은 본 유산균을 배양시킨 모든 종류의 형태로 고체 또는 액체 배양산물을 포함할 수 있으며, 배양을 위한 배지의 종류나 배양방법에 의해 한정되지 않는다. 항바이러스 활성 혹은 항병원성세균 활성을 갖는 배양산물은 균체를 포함한 배양원액, 균체를 제거한 배양 상징액 또는 배양액의 희석액 또는 농축액일 수 있다. 또한 상기 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 생산물은 상기 미생물의 대사에 의해 생성되는 모든 산물을 의미할 수 있다.

본 발명의 일례인 고체 배양의 경우, 표준 한천 배지 혹은 MRS 한천 배지를 사용하여 30-45℃에서 정치배양을 하는 방법을 사용할 수 있다. 액체 배양의 경우, 상기 한천 배지로부터 한천을 제거한 액체 배지을 사용하여 30-45℃에서 진탕 혹은 정치 배양하여 생산된 균체 및 배양 상징액을 제공할 수 있다.

본 발명의 일례로, 락토바실러스 프란타륨 Probio 090을 37℃에서 24시간 동안 MRS 액체배지에서 배양하여 균체가 포함된 배양액을 얻거나, 배양액을 원심분리하여 무세포 상징액(cell-free supernatant)과 세포를 분리하여 얻은 후 각각 사용할 수 있다.

상기 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양물 또는 이의 생산물을 포함하는 항바이러스용 조성물은 그 용도에 있어서 특별히 한정된 것은 아니고, 식품 조성물, 약학 조성물, 화장품 조성물로서 활용이 가능하며, 일례로 발효음료, 김치스타터, 요쿠르트스타터, 발효식품, 정장제, 생균제, 분무용 살균제, 화장료, 손소독제, 동물사료 또는 바디소독제로 사용될 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양물 또는 이의 생산물은 항바이러스용 또는 항병원성세균용 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

상기 식품은 특별히 한정된 것은 아니고 동식물이 섭취할 수 있는 것으로, 건강보조제, 유산균 음료와 같은 발효식품, 식품 첨가제, 및 사료첨가제 등을 모두 포함할 수 있다.

식품 조성물에는 본 발명의 미생물과 더불어 지방, 단백질, 탄수화물, 식이섬유, 무기질 및 비타민 등으로 구성된 하나 이상의 영양 구성물을 포함할 수 있다. 상기 구성물 중에서 특히 식이섬유는 일반적으로 유용 미생물의 생육을 보조하는 물질로 알려져 있음으로 본 발명의 조성물에 포함시킬 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양물 또는 이의 생산물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

또한, 상기 조성물이 사료 조성물의 형태로 제공될 경우, 기존 항생제의 대체용으로 사용되어 장내 유해균의 생육을 억제하며 장내 균총을 안정되게 유지하여 가축의 건강상태를 양호하게 하여 가축의 증체량과 육질을 개선시키고 산유량 및 면역력을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 이에 한정되지는 않으나 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태, 사일레지 (silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양산물 또는 이의 생산물과 여러 가지 미생물 또는 효소를 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양물 또는 이의 생산물을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090로 발효시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함되는 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 함량은 특별히 한정된 것은 아니나, 액체 상태인 경우 10³ cfu/ml 내지 약 10¹⁰ cfu/ml일 수 있으며 고체 상태인 경우 10³ cfu/g 내지 약 10¹⁰ cfu/g일 수 있다. 최소의 효능을 가지는데 필요한 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 일일 섭취 균주량은 섭취자의 신체 또는 건강상태에 따라 달라질 수 있다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양물 또는 이의 생산물은 항바이러스용 또는 항병원성세균용 약학 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물의 적용대상에는 특별한 제한이 없으며, 본 발명의 조성물은 사람뿐만 아니라 동물 일례로, 사육동물이나 애완동물을 포함한 모든 동물에게 적용될 수 있다.

본 발명의 항바이러스용 또는 항병원성세균용 약학 조성물은 병원성 바이러스의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 지닌 조성물일 수 있으며, 그 일례로는, 정장제, 생균제, 분무용 살균제 등이 있다.

상기 정장제는 동물의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반증상을 치료 및 개선하기 위한 것으로, 본 발명의 일례로, 유해 미생물에 의한 감염성 설사, 위장염, 염증성장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장 급이성 설사 등이 포함될 수 있다.

상기 생균제는 살아 있는 균 즉, 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서 특정 병리상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 의미할 수 있다.

상기 약학조성물 총 중량에 대하여 상기 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 배양물 또는 이의 생산물은 0.1 내지 90 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양물 또는 이의 생산물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 담체기질 또는 영양 성분과 함께 경구 투여, 비경구 투여, 또는 피부 또는 점막에 물리적인 접촉을 통해 투여하거나, 직접적으로 튜브나 카테타를 통해 장에 투여할 수도 있다. 상기 약학적 조성물은 정제(tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭시르(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension), 과립제(granule), 분무제 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다.

예를 들어, 산제는 본 발명의 유산균과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 미생물, 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성율, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태, 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있는데, 일례로, 생균제용 조성물의 경우에는 조성물 내 생균수가 10³ cfu 내지 약 10¹¹ cfu이 되도록 투여될 수 있으나, 이는 환자 및 상황에 따라 선택되어야 할 사항으로 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양물 또는 이의 생산물은 항바이러스용 또는 항병원성세균용 화장품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물의 적용대상에는 특별한 제한이 없으며, 본 발명의 조성물은 사람뿐만 아니라 동물 예를 들면, 사육동물이나 애완동물을 포함한 모든 동물에게 적용될 수 있다.

본 발명의 화장품의 형태는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 형태로도 제조될 수 있는데, 에멀젼, 로션, 크림 (수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액 (무수 및 수계), 무수 생성물 (오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 비누 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 일례로, 본 발명의 조성물은 분무용 현탁액으로 손소독제 또는 바디소독제로 사용될 수 있다.

본 발명의 화장품에는, 필요에 따라 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위에서, 통상의 성분들, 예컨대 유분, 계면활성제, 보습제, 다가알콜, 증점제, 수용성 고분자, 피막형성제, 비수용성 고분자, 분말, 안료, 염료, 레이크, 저급 알콜, 자외선 흡수제, 금속이온 킬레이트제, 유기아민류, pH 조정제, 약효성분, 당류, 방부제, 산화방지제, 향료, 물 등을 첨가할 수 있다.

상기 화장품에 있어서의 락토바실러스 프란타륨 Probio 090, 이의 배양산물 또는 이의 생산물의 배합량은, 화장품의 형태인 상기 물질의 종류 등에 따라 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들면 0.001 중량% 내지 50 중량%일 수 있으나, 용도, 상태 등에 따라 중량비는 변할 수 있다.

본 발명의 화장품은 완제품의 최종 용도와 특성에 따라서 도포한다. 예를 들면 항바이러스 활성을 나타내는 소독용 화장품를 매일 한번, 필요에 따라서는 그보다 더 자주 또는 그보다 더 적은 횟수로 사용할 수 있다. 기타 적합한 도포 방법은 통상의 최적화 방법에 따라 결정한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 조류인플루엔자 바이러스 생장 억제 유산균 분리

1. 항바이러스 활성유산균 분리 및 생리적 특징

김치에서 2,272개의 세균을 분리하여 배양 상징액의 항 IFV H1N1 활성을 조사하였다. 이중 가장 활성이 높은 유산균을 선별하여 Probio 090으로 명명하였다. Probio 090은 그람염색 양성, 포자형성 없음, 간균, 편성혐기성, 카탈라아제 음성인 전형적인 락토바실러스의 특징을 나타내었다.

2. Probio 090의 탄수화물 이용성

Probio 090의 탄수화물 이용성은 API 50CH strips과 API 50CHL 배지를 사용하였다. API 50CH strips에 포함된 각각의 탄수화물의 종류와 Probio 090의 탄수화물 이용성을 나타내는 결과는 표 1과 같다.

Substrate	Utilization^a	Substrate	Utilization
Glycerol	-	Salicin	+
Erythritol	-	Cellobiose	+
D-Arabinose	-	Maltose	+
L-Arabinose	-	Lactose	+
D-Ribose	-	Melibiose	+
D-Xylose	+	Sucrose	+
L-Xylose	-	Trehalose	+
D-adonitol	-	Inulin	-
β-Methyl-D-Xyloside	-	Melezitose	+
Galactose	+	Raffinose	+
Dlucose	+	Starch	-
Fructose	+	Glycogen	-
Mannose	+	Xylitol	-
Sorbose	-	Gentiobiose	+
Rhamnose	+	D-Turanose	+
Dulcitol	-	D-Lyxose	-
Inositol	-	D-Tagatose	+
Mannitol	+	D-Fucose	-
Sorbitol	+	L-Fucose	-
α-Methyl-D-Mannoside	-	D-Arabitol	+
α-Methyl-D-Glucoside	-	L-Arabitol	-
N-Acethyl-Glucosamine	+	Gluconate	-
Amygdalin	+	2-Keto-Gluconate	-
Arbutin	+	5-Keto-Gluconate	-
Esculin	+
^aUtilization of carbohydrate: +, utilize; -, do not utilize

상기 표 1에서 확인한 API 50CHL의 결과는 분리균주 Probio 090이 락토바실러스 프란타륨과 가장 근연함을 내타낸다. 락토바실러스 프란타륨 Probio 090은 D-xylose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, L-rhamnose, D-mannitol, D-sorbitol, N-acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D-cellobiose, D-maltose, D-lactose, D-melibiose, D-saccharose, D-trehalose, D-melezitose, D-raffinose, gentiobiose, D-turanose, D-tagatose 그리고 D-arabitol를 발효에 이용하였다.

3. Probio 090의 계통 분석

Probio 090의 16S rRNA 유전자 서열을 중합효소연쇄반응을 이용하여 증폭하고 염기서열을 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI의 BLAST 프로그램을 이용하여 상동성이 높음 유사서열과 비교하였다. BLAST에서 찾은 근연균주와 Probio 090의 계통분류학적 상관관계를 조사하기 위해, MEGA의 Clustal W 프로그램을 이용하여 정렬한 후, 도 1에서 보이는 바와 같이 계통도는 neighbor-joining method를 이용하여 나타내었다.

< 실시예 2> 내산성 , 내담즙산성 및 항생제 감수성을 갖는 유산균 분리

1. 내산성 측정

한국 김치에서 분리한 락토바실러스 프란타륨 Probio 090을 MRS 액체배지 (Difco)에 37℃에서 24시간 배양하여 배양액을 확보하였다.

내산성을 확인하기 1M HCl 용액을 사용하여 pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지에 락토바실러스 프란타륨 Probio 090을 접종하고, 37℃에서 24시간 배양하여 생균수를 측정하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

내산성 (인공 위액)
생균수(CFU/ml)		생존율(%)
배양 전	배양 후
2.67×10⁹	6.9×10⁸	85

2. 내담즙산성 측정

내담즙산성 시험은 담즙 (Oxgall, Sigma-Aldrich, USA) 5%가 첨가된 MRS 액체배지에 락토바실러스 프란타륨 Probio 090을 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 생균수를 측정하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

내담즙산성 (인공 담즙액 )
생균수(CFU/ml)		생존율(%)
배양 전	배양 후
2.67×10⁹	1.5×10⁸	80

상기 표 2 및 표 3에서 확인한 바와 같이, 락토바실러스 프란타륨 Probio 090은 산과 담즙에 대한 내성이 있어 위장관에서의 생존 가능성이 높은 것으로 나타났다.

3. 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 항생제 감수성

락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 항생제에 대한 감수성 실험은 European Food Safety Authority (EFSA)에서 제시한 microdilution method를 따라 실험하였고, 8종의 항생제에 대해 수행하였으며, 그 종류와 농도는 하기 표 4와 같다. 항생제의 감수성을 나타내는 결과는 표 5에 나타내었다.

Antibiotics	1^a	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12^b
Gentamicin	P	0.5	1	2	4	8	16	32	64	128	256	N
Kanamycin	P	2	4	8	16	32	64	128	256	512	1024	N
Streptomycin	P	0.5	1	2	4	8	16	32	64	128	256	N
Tetracycline	P	0.125	0.25	0.5	1	2	4	8	16	32	64	N
Erythromycin	P	0.016	0.032	0.063	0.012	0.25	0.5	1	2	4	8	N
Clindamycin	P	0.032	0.063	0.125	0.25	0.5	1	2	4	8	16	N
Chloramphenicol	P	0.125	0.25	0.5	1	2	4	8	16	32	64	N
Ampicillin	P	0.032	0.063	0.012	0.25	0.5	1	2	4	8	16	N
^aPositive control well without the antibiotics, but with the test strain and the medium containing solvent which is used to dissolve the antibiotics at the highest concentrations. ^bNegative control well without the test strain and the antibiotic, but with the medium

항생제	최소억제농도 기준값(mg/L)	Probio 090 억제 농도(mg/L)
Gentamicin	16	0.5
Kanamycin	64	4
Streptomycin	not required.	2
Tetracycline	32	8
Erythromycin	1	0.125
Clindamycin	2	0.125
Chloramphenicol	8	4
Ampicillin	2	0.25

상기 표 5에서 확인한 바와 같이, 8가지 항생제의 최소억제농도 기준값 보다 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 억제 농도가 모두 낮은 것으로 보아 8가지 항생제에 대한 감수성이 있는 것으로 확인할 수 있다.

< 실시예 3> In vitro 상에서 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 생장 억제 실험

1. 세포주(Cell line)을 이용한 항바이러스 활성

MDCK cell monolayer(단층세포)에 인플루엔자 바이러스 H1N1 혈청형 바이러스(IFV H1N1 virus)인 A/Korea/01/2009(H1N1) 접종하고 약 1시간 바이러스를 세포에 흡착시킨 후 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 첨가하고 4% CO₂ 농도를 유지하는 37℃ 세포배양기에서 배양하면서 세포 변성효과 (cytopathic effects, CPE)를 관찰하였다. IFV H1N1 바이러스 배양액을 DMEM으로 희석하여 바이러스 역가 (virus titer)가 10^6.5 EID₅₀/0.1ml가 되게 하였다. 96공 세포배양 플레이트 (plate)에 MDCK cell monolayer를 준비한 다음 유산균 배양액을 각 공(well)에서 2배씩 희석하였으며, 96공 세포 배양 plate의 각 공 (well)에 IFV H1N1 바이러스를 참가한 후 4% CO₂를 유지하는 37℃ 세포배양기에서 72시간 배양하여 세포변성효과를 관찰하였다. 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 IFV H1N1 바이러스에 대한 억제 활성은 다음 표 6과 같다.

	희석 배수
	2 ⁰	2 ¹	2 ²	2 ³	2 ⁴
세포배양 상징액 (Cell-free supernatant)	+	-	-	-	-
10배 농축 세포배양 상징액	+	+	+	+	-
+ : antiviral activity, - : cytopathic effect

상기 표 6 및 도 2에서 확인한 바와 같이, 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 배양 상징액을 처리한 경우 세포변성이 나타나지 않았으므로 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 IFV H1N1 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 확인할 수 있다.

2. 종란 (Egg)을 이용한 항바이러스 활성

IFV H1N1 바이러스는 10^5.5EID₅₀/0.1ml를 사용하였다. 유산균 처리군은 3가지로 배양상등액(cell-free supernatant), 생균(cell-mass), 사균(Heat-killed & sonication culture medium)를 10배씩 희석하여 사용하였다.

부화 11일령의 SPF 종란의 요막강에 각각의 유산균 처리군과 바이러스를 100㎕씩 동시 접종하였다. 바이러스 접종 후 5일간 배양(부화기, 37℃)하며, 매일 검란을 실시하여 죽은 유정란은 제외하였다. 5일간 배양된 유정란은 생존 유무를 확인 하고 생존 유무는 하기 표 7에 나타내었으며, 4℃에서 chilling 한 후 유정란에 요막액을 채취하였다. 바이러스 증식 억제 능력을 측정하기 위해, 1% SPF 닭의 적혈구를 사용하여 혈구 응집반응 시험을 실시하였고 농도별 결과를 표 8에 나타내었다.

시험구	희석 배율	생존 유정란/전체 유정란
CS	1:10^-4	2/2
CS	1:10^-5	0/2
CM	1:10^-4	2/2
CM	1:10^-5	0/2
HK	1:10^-5	1/2
HK	1:10^-6	1/2
CS ; cell free supernatant-treated eggs CM ; cell mass-treated eggs HK ; Heat-killed & sonication culture medium-treated eggs

상기 표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 유정란의 생존유무 결과 사균은 10^-5배, 생균과 배양상등액은 10^-4배 희석한 곳까지 바이러스 증식을 억제시킬 수 있는 항바이러스 활성을 확인할 수 있었다.

	시험구
	IFV	PBS	CS(1:10^-4)	CS(1:10^-5)
혈구응집반응 시험	1:4	1:0	1:0	1:4
IFV ; Only Influenza virus-treated eggs PBS ; Phosphate buffer saline CS ; cell free supernatant-treated eggs

상기 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혈구응집시험 결과 10^-4희석한 배양상징액은 대조군인 PBS와 같이 혈구응집이 되지 않은 것으로 보아 바이러스 증식을 억제하는 항바이러스 활성을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> 감염성 세균 생장 억제 실험

1. 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 이용한 항세균 활성

락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 항세균활성을 확인하기 MRS 액체배지에 이 유산균을 접종하고, 37℃에서 24시간 배양하고, 배양체를 원심분리한 후 여과한 대사산물 시료를 조제하였다.

병원성세균으로는 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 각각 NB 액체배지에서 37℃에서 15시간 배양하여 준비한 후, 각각 NB 한천평판배지에 도말한 후, 한천배지의 중심부에 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 배양 상징액을 함유하는 디스크페이퍼를 놓은 후, 37℃에서 8시간 배양하였다. 병원성 미생물의 생육억제 유무는 디스크페이퍼 주변에 발생한 투명환의 생성으로 확인하였고, 세균생육억제 강도는 투명환의 직경(mm)으로 판별하였다.

락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 억제 활성은 다음 표 9와 같다.

병원균	생육억제환 (유/무)	생육억제환의 직경 (mm)
E. coli	유	16
Salmonella	유	20
Staphylococcus aureus	유	20

상기 표 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 프란타륨 Probio 090의 배양 상징액은 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 생육을 억제하였다.

한국생명공학연구원

KCTC12694BP

20141016

Claims

인플루엔자 바이러스 혈청형 H1N1에 대한 항바이러스 활성을 갖는 락토바실러스 프란타륨(Lactobacillus plantarum) Probio 090 균주(수탁번호: KCTC 12694BP).
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제1항에 따른 균주, 이의 배양물 또는 이의 생산물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 혈청형 H1N1에 대한 항바이러스용 조성물.
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