KR20170111763A - 락토바실러스 애시도필러스 kcnu 균주를 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실리에 의한 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents
락토바실러스 애시도필러스 kcnu 균주를 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실리에 의한 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수탁번호 KCCM-10753P로 기탁된 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주 또는 상기 균주 배양물을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 클로스트리듐 디피실리에 대하여 자가유도물질 생산을 억제하고, 클로스트리듐 디피실리 발병력 관련된 유전자인 luxS, tcdA, tcdB 및 txeR의 발현을 감소시키며, 클로스트리듐 디피실리의 성장을 억제시키고, 사멸을 유도함으로써 클로스트리듐 디피실리에 의해 유발되는 장 질환에 대하여 예방 및 치료 효과를 나타낸다. 본 발명의 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주는 클로스트리듐 디피실리에 의해 유발되는 장 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위해 생균용 조성물, 사료첨가제, 식품첨가제 및 기타 발효제품 등에 다양하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주를 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실리에 의한 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물물에 관한 것이다.
인체나 동물의 장에 서식하면서 여러 가지 유익한 작용을 하는 미생물들이 있는데 이러한 미생물을 프로바이오틱스(Probiotics)라고 하며, 여기에 속하는 미생물 중 유산균(Lactic acid bacteria)은 대표적인 프로바이오틱스 중 하나이다.
유산균은 보통 젖산균이라고도 칭하며, 포도당 또는 유당과 같은 탄수화물을 분해 및 이용하여 최종 대사산물로 젖산을 상당량 생산하는 박테리아로, 지금까지 밝혀진 유산균은 300 내지 400여 종류로 알려지고 있다. 유산균은 사람이나 동물의 소화관, 우유, 요쿠르트, 치즈, 김치, 식물 및 토양 등 자연계에 널리 분포되어 있으며, 이들 유산균은 인류의 생활에 직·간접적으로 밀접한 관계를 맺고 있는 유익한 공생체이다. 최근에는 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되어 일반식품뿐만 아니라 건강식품 및 의약품으로써 이용되는 등 그 응용범위가 넓어지고 있으며 여기에 속하는 세균들로는 스트렙토코코스(Streptococcus)속, 페디오코커스(Pediococcus)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacilus)속과 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등이 있다. 상기 균들은 그람 양성균으로써 혐기성이거나 편혐기성인 성질을 지니고 있으며 동물의 장내에 서식하면서 동물이 섭취한 영양분 및 섬유소 등을 분해시켜 에너지원으로 사용하여 젖산 및 항생물질을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로써 장내 건강 유지 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)는 항균제 유발 설사증을 일으키는 세균으로, 심할 경우에는 위막성 대장염으로 일으키는 매우 위험한 세균으로서 임상적으로 매우 중요한 클로스트리듐속의 세균 중 하나이다.
클로스트리듐속의 세균들 중 클로스트리듐 디피실리는 약 2-5%의 정상 성인의 장관 내에 정착하여 존재하는 장내세균으로 보고되고 있는데, 항생제, 특히 광범위한 효과를 나타내는 항생제 치료 시 장내 정상 세균의 붕괴로 인해 항생제 내성이 있는 클로스트리듐 디피실리가 과도하게 증식하여 많은 문제가 발생할 수 있다.
이러한 클로스트리듐 디피실리 중 특정 균주는 독소를 생산할 수 있어 중증의 설사, 독성거대결장, 천공, 패혈증, 위막성 대장염을 일으키기도 한다. 이러한 병원성 클로스트리듐 디피실리가 생산하는 독소는 장내독소[독소 A(toxin A)], 세포독소[독소 B(toxin B)] 및 2성분 독소(Binary toxin)로 알려져 있으며, 설사와 염증반응을 일으킬 수 있다. 특히, 독소 A는 분비성, 출혈성 설사를 유발하며, 독소 B는 세포독소로서 조직배양 세포에서 파괴적인 세포병변 효과를 나타낸다.
다양한 항생제가 클로스트리듐 디피실리 관련 질환(Clostridium difficile associated disease, CDAD)과 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 클로스트리듐 디피실리는 입원 환자의 약 10-25%에서 장관 내 획득이 일어나고, 클로스트리듐 디피실리의 획득은 입원기간에 따라 증가하는 것으로 밝혀졌다. 병원성 클로스트리듐 디피실리는 감염된 환자의 설사에서 클로스트리듐 디피실리가 배출된 후 포자를 형성하여 체외에서 오랜 기간 생존할 수 있다. 이러한 생리학적 특징으로 인하여 클로스트리듐 디피실리는 장기간 환경에 오염될 수 있고, 이러한 오염원으로부터 아포가 정상인의 구강을 통하여 추가적인 감염을 일으킴으로써 병원 내에서 클로스트리듐 디피실리가 집단 발병할 수 있다. 따라서, 이러한 클로스트리듐 디피실리에 의한 병원 내 집단 발병을 방지하기 위해서는 클로스트리듐 디피실리의 병원성과 감염원 전파경로의 조기 확인이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Sherris Medical Microbiology (4th ed.). McGraw Hill. pp. 322-4, 2004
INT J ANTIMICROB AG 33, S1, 2009, S13-S18
Surgery 116:768-775, 1994, J Infect Dis 166:561-567, 1992
본 발명자들은 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)로 인한 장 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 균을 발굴하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 돼지소장으로부터 분리된 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주가 클로스트리듐 디피실리에 의해 발생한 질환에 대하여 우수한 예방 및 치료 효과를 나타낸다는 것을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주 또는 상기 균주 배양물을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주 또는 상기 균주 배양물을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCCM-10753P로 기탁된 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주 또는 상기 균주 배양물을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)로 인한 장 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 균을 발굴하기 위해 연구 노력하였고 그 결과, 돼지소장으로부터 분리된 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주가 클로스트리듐 디피실리에 의해 발생한 질환에 대하여 우수한 예방 및 치료 효과를 나타낸다는 것을 실험적으로 증명하였다.
본 발명의 조성물은 클로스트리듐 디피실리에 대하여 자가유도물질(autoinducer 2, AI-2) 생산을 억제하고, 클로스트리듐 디피실리 발병력 관련된 유전자인 luxS, tcdA, tcdB 및 txeR의 발현을 감소시키며, 클로스트리듐 디피실리의 성장을 억제시키고, 사멸을 유도함으로써 클로스트리듐 디피실리에 의해 유발되는 장 질환에 대하여 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주 또는 상기 균주 배양물을 포함하며, 상기 균주 배양물은 균주 배양물 자체 또는 균주 배양물을 원심분리하여 모든 균체를 파쇄하고 원심분리하여 회수한 상등액일 수 있다.
본 발명의 조성물이 적용되는 장 질환은 항균제 관련 설사, 클로스트리듐 디피실리로 인한 장 질환, 염증성 장 질환 및 위장관 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 본 발명의 조성물이 적용되는 장 질환은 클로스트리듐 디피실리로 인한 설사이다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCCM-10753P로 기탁된 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주 또는 상기 균주 배양물을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물 형태로 제공되는 경우, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로 덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서 천연 감미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 레바우디오시드 A, 글리시리진 등) 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 수탁번호 KCCM-10753P로 기탁된 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주 또는 상기 균주 배양물을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품조성물을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 조성물은 클로스트리듐 디피실리에 대하여 자가유도물질 생산을 억제하고, 클로스트리듐 디피실리 발병력 관련된 유전자인 luxS, tcdA, tcdB 및 txeR의 발현을 감소시키며, 클로스트리듐 디피실리의 성장을 억제시키고, 사멸을 유도함으로써 클로스트리듐 디피실리에 의해 유발되는 장 질환에 대하여 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
(ⅲ) 본 발명의 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주는 클로스트리듐 디피실리에 의해 유발되는 장 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위해 생균용 조성물, 사료첨가제, 식품첨가제 및 기타 발효제품 등에 다양하게 이용될 수 있다.
도 1 (A)는 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 세포질 추출물 농도별 자가유도물질 생산억제능력을 측정한 결과이고, 도 1 (B)는 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 세포질 추출물 첨가에 따른 클로스트리듐 디시필리의 성장 변화를 측정한 결과이다.
도 2는 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 세포질 추출물에 의한 클로스트리듐 디시필리의 자가유도물질 생산억제능력을 시간별로 측정한 결과이다.
도 3은 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 세포질 추출물에 의한 luxS, tcdA, tcdB, 및 txeR 유전자 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 4a는 클로스트리듐 디시필리 성장에 있어서 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 효과를 확인한 결과이다. 도 4b는 클로스트리듐 디시필리와 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 혼합 배양 시 pH 변화를 측정한 결과이다.
도 5는 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델을 이용한 실험의 모식도이다.
도 6a는 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델에 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주를 투여하고 생존율을 측정한 결과이다. 도 6b는 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델에 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주를 투여하고 체중 변화를 측정한 결과이다.
도 7은 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델에 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주를 투여하고, 맹장 및 결장 조직에 대하여 조직병리학적 분석을 실시한 결과이다.
도 8은 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델에 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주를 투여하고, 결장 내 미생물 변화를 측정한 결과이다.
도 2는 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 세포질 추출물에 의한 클로스트리듐 디시필리의 자가유도물질 생산억제능력을 시간별로 측정한 결과이다.
도 3은 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 세포질 추출물에 의한 luxS, tcdA, tcdB, 및 txeR 유전자 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 4a는 클로스트리듐 디시필리 성장에 있어서 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 효과를 확인한 결과이다. 도 4b는 클로스트리듐 디시필리와 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 혼합 배양 시 pH 변화를 측정한 결과이다.
도 5는 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델을 이용한 실험의 모식도이다.
도 6a는 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델에 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주를 투여하고 생존율을 측정한 결과이다. 도 6b는 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델에 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주를 투여하고 체중 변화를 측정한 결과이다.
도 7은 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델에 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주를 투여하고, 맹장 및 결장 조직에 대하여 조직병리학적 분석을 실시한 결과이다.
도 8은 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델에 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주를 투여하고, 결장 내 미생물 변화를 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 락토바실러스 애시도필러스 KCNU의 배양 상등액 및 세포질 추출물 제조
락토바실러스 애시도필러스 KCNU을 MRS 배지에서 3회 계대 배양하여 활력을 높인 후 최종 MRS 배지에서 24시간 배양하였다. 락토바실러스 애시도필러스 KCNU의 배양액을 14,000 × g로 30분간 원심분리한 후 PBS 완충액에 3회 세척하였다. 균체의 파쇄는 소니케이터를 이용하여 1분에 20회 파쇄하고 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액 예컨대 세포질 추출물은 pH를 7.2로 조정한 후 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 여과하고 동결 건조하여 -80℃에서 보관하면서 시료로 사용하였다.
실시예 2: 비브리오 하베이 BB170을 이용한 자가유도물질(autoinducer 2) 분석
자가유도물질(autoinducer 2, AI-2)는 큐롬센싱(quorum-sensing)의 보편적인 분자로 다양한 종의 세균 구성에서 이종간의 신호전달을 매개하고 세균막 형성에 기여한다.
슈레이트 및 바슬러(1998)의 방법에 따라 자가유도물질 생물검정을 측정하였다. BHI 액체배지에 밤새 성장시킨 클로스트리듐 디피실리(C. difficile) ribotype 027와 음성 대조군인 대장균 DH5α를 0.5% 글루코스가 포함된 LB 액체배지에 1.0% 접종하고 12시간 동안 37℃에서 배양하면서 시간별로 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 0.22 ㎛ 필터로 여과한 다음 -80℃에서 보관하면서 가공되지 않은 적정밀도 인식(QS)으로 사용하였다. 자가유도물질의 리포터 변종(reporter strain)으로 비브리오 하베이 BB170을 사용하여 1 : 5000으로 희석한 균액 900 ㎕와 상기에서 제조된 가공되지 않은 자가유도물질 100 ㎕를 혼합한 후 30℃에서 175 rpm으로 교반하면서 진탕배양을 실시하였다. 배양과정 중 시간별로 시너지 HT 리너(BIO-Tek)를 이용하여 발광(luminoscence)을 측정하였다. 자가유도물질 생산성은 음성 대조군으로 사용된 대장균 DH5α의 상등액이 첨가된 처리의 활력을 사용하여 다음과 같은 식을 이용하여 배수(fold)값을 측정하였다.
샘플의 평균 발광
발광 배수(fold) = -------------------------------------
E. coli DH5α의 발광
실시예 3: 클로스트리듐 디피실리(
C. difficile
) 자가유도물질 생산억제활성 평가
락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 평가
BHI 액체배지에서 밤새 배양한 클로스트리듐 디피실리를 0.1% 접종시킨 대조군과 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 세포질 추출물 10 ㎍/㎖ 첨가한 처리제(treatment)를 접종 초기부터 3시간 단위로 24시간까지 37℃에서 배양하면서 클로스트리듐 디시필리의 성장을 관찰하였다. 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 세포질 추출물의 농도별 자가유도물질 생산억제능력을 측정하여 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 최적 활성농도를 관찰하기 위해 추출물의 단백질 함량 기준으로 5, 10, 20, 40 ㎍/㎖ 세포질 추출물을 처리 후 상기 방법에 의해서 자가유도물질 생산억제능력을 실시하였다. 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1에서 나타난 바와 같이, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 세포질 추출물의 농도가 40 ㎍/㎖ 이상 이면 클로스트리듐 디피실리의 성장에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 세포질 추출물 40 ㎍/㎖에서 가장 높은 자가유도물질 생산억제능력이 관찰되었다.
아울러 도 2에 나타난 바와 같이, 클로스트리듐 디피실리의 성장시간 중 6시간에 가장 높은 자가유도물질 생산억제능력이 관찰되었다.
상기 결과들에서, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 세포질 추출물 5 ㎍/㎖ 이상에서 클로스트리듐 디피실리의 자가유도물질 생산억제능력을 확인하였으며, 자가유도물질 생산억제활성 평가를 통해서 클로스트리듐 디피실리에 의해 발생한 질환을 락토바실러스 애시도필러스 KCNU가 완화 시킬 수 있음을 보여준다.
클로스트리듐 디피실리 유전자 발현변화
락토바실러스 애시도필러스 KCNU균주의 세포질 추출물 10 ㎍/㎖ 첨가에 따른 클로스트리듐 디피실리 발병력 관련 유전자의 발현변화를 알아보기 위해 실험을 실시하였다. 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주의 세포질 추출물을 37℃에서 6시간 처리한 후 총 RNA를 Rneasy Lipid Tissue Mini Kit(Qiagen Inc., Valencia, CA)를 이용하여 상기 방식을 사용하여 추출하였다. cDNA는 RT PreMix (Random Pimer)를 이용하여 합성하였다. Real-time PCR을 위한 반응물 조성은 2 X Prime QMaster Mix(Kapa Biosystems, Boston, MA), cDNA 용액, 정방향 및 역방향 프라이머로 구성하였다. 프라이머는 표 1에 제시하였다. CFX96TM Real-Time system(Bio-Rad, Hercules, CA)에서 실시간 PCR을 수행하였다. 반응조건은 94℃에서 5분간 반응시킨 후 94℃에서 40초, 58℃에서 40초, 58℃에서 40초를 1 사이클로 하여 총 40 사이클을 반응시켰다.
| 유전자 | 기능 | 프라이머 서열 (5’- 3’) |
| luxS | Auto-inducer | 정방향 : GTGTACTTGATGGAGTAAAGGGAGA 역방향 : TTCTACATCCCATTGGAGATAAGTC |
| tcdA | Toxin A | 정방향 : CTTAACCCAGCCATAGAGTCTGATA 역방향 : AGCTCCTGGACCACTTAAACTTATT |
| tcdB | Toxin B | 정방향 : GTTCTATTTTGGTGAAGATGGTGTC 역방향 : CCTCACCATCAATAATAACTGAACC |
| txeR | Sigma factors | 정방향 : TCAAAGTAAGTCTGTTTTTGAGGAAG 역방향 : TGCTCTATTTTTAGCCTTATTAACAGC |
| rpoA | RNA polymerase subunit A | 정방향 : CATCAGGTGCAGGAAAAGGT 역방향 : CATTCCATTATTGCCGCTTT |
결과는 도 3에 나타내었다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 클로스트리듐 디피실리의 발병력과 관련되는 유전자(luxS, tcdA, tcdB 및 txeR)의 발현이 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 세포질 추출물 10 ㎍/㎖의 첨가로 인하여 감소되는 것을 확인하였다.
상기 결과에서 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 세포질 추출물 첨가로 인하여 클로스트리듐 디피실리의 발병력과 관련되는 유전자의 발현의 감소를 확인하였으며, 이는 클로스트리듐 디피실리 유전자 발현변화를 통해서 클로스트리듐 디피실리에 의해 발생한 질환을 락토바실러스 애시도필러스 KCNU가 완화시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 4: 클로스트리듐 디피실리와 락토바실러스 애시도필러스 KCNU의 공동배양
클로스트리듐 디피실리와 락토바실러스 애시도필러스 KCNU의 공동배양시 클로스트리듐 디피실리와 생균수와 pH의 변화를 알아보기 위해 시행하였다.
혐기성 상태의 MRS 액체배지에 104의 클로스트리디움 디피실리와 104, 106, 108의 락토바실러스 애시도필러스 KCNU를 각각 접종하여 클로스트리디움 디피실리의 생균수와 pH를 3시간 단위로 24시간 동안 측정하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.
그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 104 첨가시 21시간 이후 클로스트리듐 디피실리의 사멸이 관찰되었으며, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 106 첨가시 12시간 이후, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 108 첨가시 처음부터 사멸하기 시작하며, 6시간째 멸균되는 것을 확인할 수 있었다. pH의 변화를 보았을 때, pH 4.5에서 클로스트리듐 디피실리의 사멸이 관찰되었다. 즉, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU의 생균의 첨가가 클로스트리듐 디피실리의 성장에 영향을 미치는 것을 관찰하였다.
상기 결과들에서, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 생균 첨가로 인하여 클로스트리듐 디피실리의 사멸 확인하였으며, 클로스트리듐 디피실리와 락토바실러스 애시도필러스 KCNU의 공동배양을 통해서 클로스트리듐 디피실리에 의해 발생한 질환을 락토바실러스 애시도필러스 KCNU가 완화 시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 5: 클로스트리듐 디피실리 감염(
Clostridium difficile
infection; CDI) 마우스 모델
클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델 준비
6주된 C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratory, USA) 암컷을 실험에 이용하였다. 모든 마우스는 12시간 명/암주기, 22±2℃ 조건에서 모든 환경을 멸균하여 공급하였으며, 멸균식을 자유 식이하여 공급하며 사육하였다.
클로스트리듐 디피실리 포자 제조
클로스트리듐 디피실리를 BHI 액체배지에서 혐기성 조건으로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 클로스트리듐 디피실리 포자 제조를 위하여 BHI 한천배지에 도말하여 혐기성 조건에서 37℃에서 10일간 배양한다. 10일간 배양된 클로스트리듐 디피실리는 포자를 형성하게 된다. 생성된 포자를 PBS를 이용하여 회수하며 다시 BHI 한천배지에 배양하여 균수를 측정한 후 20℃에서 보관한다.
클로스트리듐 디피실리 감염
1~2주 동안 모든 환경을 멸균하여 공급하였으며, 감염 6일전 항생제 칵테일[가나마이신(0.4 ㎎/㎖), 젠타마이신(0.035 ㎎/㎖), 콜리스틴(850 U/㎖), 메트로니다졸(0.215 ㎎/㎖), 반코마이신(0.045 ㎎/㎖)을 3일간 멸균된 물과 섞여 먹인다. 감염 2일전에는 멸균식과 멸균수만 공급하며, 감염 하루 전 클린다마이신(10 ㎎/kg)을 복강주사한다. 다음날 클로스트리듐 디피실리를 포자상태로 약 107을 경구용 존대를 이용하여 구강투여한다.
락토바실러스 애시도필러스 KCNU 처리
클로스트리듐 디피실리 감염 24시간 후 약 108 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 생균, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU균주의 세포질 추출물 10 ㎎/day, 및 약 108 락토바실러스 애시도필러스 KCNU를 95℃에서 1시간 처리한 열처리 사멸균주를 매일 구강투여하여 5일간 생존율 및 몸무게 변화를 측정하였다. 이러한 클로스트리듐 디피실리 감염(Clostridium difficile infection; CDI) 마우스 모델의 전체 디자인은 도 5에 제시하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에서 나타난 바와 같이, 대조군은 3일째에 최종적으로 90%가 죽음으로써 10%의 생존율을 보이며, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 생균 처리군은 4일째에 최종적으로 20%가 죽음으로 80%의 가장 높은 생존율을 나타내었다. 아울러 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 세포질 추출물 처리군은 70%의 생존율, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 열처리 사균 처리군은 50% 생존율을 나타내었다.
상기 결과들에서, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 처리로 인하여 클로스트리듐 디피실리의 감염 마우스의 대조군과 비교하여 70%가 더 생존함을 확인하였으며, 클로스트리듐 디피실리 감염(Clostridium difficile infection; CDI) 마우스 모델 통해서 클로스트리듐 디피실리에 의해 발생한 질환을 락토바실러스 애시도필러스 KCNU가 완화 시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 6: 클로스트리듐 디피실리 감염(
Clostridium difficile
infection; CDI) 마우스 모델의 조직병리학적 분석
상기 마우스들이 감염 후 2일 일 때 맹장과 결장 조직을 분리 한 후, 4% 파라 포름알데하이드에 고정시키고, 파라핀을 첨가한 뒤 절편으로 조각내어 조직 슬라이드를 제조하여 헤마톡실린 및 에오신 염색방법으로 염색하여 병변의 경중도를 조직병리학적으로 관찰하였다. 결과는 도 7에 나타내었다.
그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 클로스트리듐 디피실리에 감염된 마우스인 대조군에서 맹장과 결장에서 세포의 탈락과 염증 소견이 보였으나, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 처리군에서는 항생제 처리군과 거의 유사한 정상적인 세포의 모습을 관찰하였다.
상기 결과들에서, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 처리로 인하여 클로스트리듐 디피실리의 감염 마우스의 대조군과 비교하여 정상적인 세포의 모습을 확인하였으며, 클로스트리듐 디피실리 감염(Clostridium difficile infection; CDI) 마우스 모델의 조직병리학적 분석을 통해서 클로스트리듐 디피실리에 의해 발생한 질환을 락토바실러스 애시도필러스 KCNU가 완화 시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 7: 클로스트리듐 디피실리 감염(
Clostridium difficile
infection; CDI) 마우스 모델의 결장내 미생물 변화
상기 마우스들이 감염 후 2일 일 때 결장 조직을 분리한 후, 결장과 결장 속의 분변을 혐기성 희석액(4.5 g KH2PO4, 6.0 g Na2HPO4, 0.5 g L-cystein, 0.5 g Tween 80 /L)희석하여 MRS, BL-NPNL, PCA, 및 Clostridium difficile selective agar(CDSA)에 도말하여 생균수를 측정한다. MRS 한천배지는 표 2에 제시하였다. BL-NPNL 한천배지는 표 3에 제시하였다. PCA 한천배지는 표 4에 제시하였다. CDSA 한천배지는 표 5에 제시하였다.
| Ingredients | g/L |
| Peptone | 10 |
| Beef extract | 10 |
| Yeast extract | 5 |
| Glucose | 20 |
| Ammonium-citrate | 2 |
| Sodium acetate | 5 |
| Tween 80 | 1 ml |
| K 2 HPO 4 | 2 |
| MgSO 4 | 0.1 |
| MnSO 4 | 0.05 |
| Agar | 15 |
| pH | 5.0 |
| Ingredients | g/L |
| L-cysteine hydrochloride | 0.5 |
| Glucose | 10 |
| Lab-Lemco (Oxoid/Liebig meat extract) | 3 |
| Liver extract solution | 150 ml |
| Phytone (BBL) | 3 |
| Proteose peptone no. 3 (Difco) | 10 |
| Solution A | 10 ml |
| KH2PO4 | 25 |
| K2HPO4 | 25 |
| In 250 ml of distilled water | |
| Solution B | 5 ml |
| FeSO47H2O | 0.5 |
| MgSO47H2O | 10 |
| MnSO44H2O | 0.337 |
| Sodium chloride | 0.5 |
| In 250ml of distilled water | |
| Tween 80 | 1 |
| Trypticase (BBL) | 5 |
| Yeast extract (Difco) | 5 |
| Neomycin-Paromomycin-Nalidixic acid-Lithium chloride (NPNL) | 50 ml |
| Lithium chloride | 6 |
| Nalidixic acid | 0.03 |
| Neomycin sulphate | 0.2 |
| Paromomycin sulphate | 0.4 |
| In 100ml of distilled water | |
| Agar | 15 |
| pH | 7.2 |
| Ingredients | g/L |
| Tryptone | 5 |
| Yeast extract | 2.5 |
| Glucose | 1 |
| Agar | 15 |
| pH | 7.0 |
| Ingredients | g/L |
| Peptic digest of animal tissue | 32 |
| Disodium phosphate | 5 |
| Monopotassium phosphate | 1 |
| Magnesium sulfate | 0.1 |
| Sodium chloride | 2 |
| Mannitol | 6 |
| Growth factors | 3.3 |
| Cycloserine | 0.250 |
| Cefoxitin | 0.016 |
| Agar | 15 |
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 클로스트리듐 디피실리 감염 마우스 모델에서 락토바실러스 애시도필러스 KCNU를 처리군 결장에서 대조군과 비교하였을 시, 클로스트리듐 디피실리의 감소와 락토바실러스의 증가를 확인하였다.
상기 결과들에서, 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 처리로 인하여 클로스트리듐 디피실리의 감염 마우스의 대조군과 비교하여 결장에서 클로스트리듐 디피실리의 감소와 락토바실러스균의 증가를 확인하였으며, 클로스트리듐 디피실리 감염(Clostridium difficile infection; CDI) 마우스 모델의 결장내 미생물 변화를 통해서 클로스트리듐 디피실리에 의해 발생한 질환을 락토바실러스 애시도필러스 KCNU가 완화 시킬 수 있음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, CHONNAM UNIVERSITY
<120> Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Enteric
Diseases Caused by Clostridium difficile Comprising Lactobacillus
acidophilus KCNU
<130> PN160079
<160> 10
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> luxS Forward Primer
<400> 1
gtgtacttga tggagtaaag ggaga 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> luxS Reverse Primer
<400> 2
ttctacatcc cattggagat aagtc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> tcdA Forward Primer
<400> 3
cttaacccag ccatagagtc tgata 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> tcdA Reverse Primer
<400> 4
agctcctgga ccacttaaac ttatt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> tcdB Forward Primer
<400> 5
gttctatttt ggtgaagatg gtgtc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> tcdB Reverse Primer
<400> 6
cctcaccatc aataataact gaacc 25
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> txeR Forward Primer
<400> 7
tcaaagtaag tctgtttttg aggaag 26
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> txeR Reverse Primer
<400> 8
tgctctattt ttagccttat taacagc 27
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> rpoA Forward Primer
<400> 9
catcaggtgc aggaaaaggt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> rpoA Reverse Primer
<400> 10
cattccatta ttgccgcttt 20
Claims (10)
- 수탁번호 KCCM-10753P로 수탁된 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주 또는 상기 균주 배양물을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 장 질환은 항균제 관련 설사, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)로 인한 장 질환, 염증성 장 질환 및 위장관 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 장 질환은 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)로 인한 설사인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 자가유도물질(autoinducer 2)의 생산을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 luxS, tcdA, tcdB 및 txeR 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 수탁번호 KCCM-10753P로 기탁된 락토바실러스 애시도필러스 KCNU 균주 또는 상기 균주 배양물을 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제 8 항에 있어서, 상기 장 질환은 항균제 관련 설사, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)로 인한 장 질환, 염증성 장 질환 및 위장관 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 9 항에 있어서, 상기 장 질환은 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)로 인한 설사인 것을 특징으로 하는 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160037818A KR20170111763A (ko) | 2016-03-29 | 2016-03-29 | 락토바실러스 애시도필러스 kcnu 균주를 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실리에 의한 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160037818A KR20170111763A (ko) | 2016-03-29 | 2016-03-29 | 락토바실러스 애시도필러스 kcnu 균주를 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실리에 의한 장 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 |
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| Publication Number | Publication Date |
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|---|---|---|---|
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200126261A (ko) | 2019-04-29 | 2020-11-06 | 순천향대학교 산학협력단 | 사람 대변 유래 바실러스, 이를 이용한 클로스트리듐 디피실 장염 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR20200126260A (ko) | 2019-04-29 | 2020-11-06 | 순천향대학교 산학협력단 | 발효식품 유래 락토바실러스 5종 혼합 배양액을 이용한 클로스트리듐 디피실 장염 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR102310898B1 (ko) | 2021-02-16 | 2021-10-08 | 주식회사 메디오젠 | 락토바실러스 애시도필러스 배양 건조물을 포함하는 항산화용 조성물 |
| WO2022039561A1 (ko) * | 2020-08-21 | 2022-02-24 | 서울대학교산학협력단 | 클로스트리디움 디피실리 감염의 치료 또는 예방용 조성물 |
-
2016
- 2016-03-29 KR KR1020160037818A patent/KR20170111763A/ko not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200126261A (ko) | 2019-04-29 | 2020-11-06 | 순천향대학교 산학협력단 | 사람 대변 유래 바실러스, 이를 이용한 클로스트리듐 디피실 장염 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR20200126260A (ko) | 2019-04-29 | 2020-11-06 | 순천향대학교 산학협력단 | 발효식품 유래 락토바실러스 5종 혼합 배양액을 이용한 클로스트리듐 디피실 장염 예방 또는 치료용 조성물 |
| WO2022039561A1 (ko) * | 2020-08-21 | 2022-02-24 | 서울대학교산학협력단 | 클로스트리디움 디피실리 감염의 치료 또는 예방용 조성물 |
| KR102310898B1 (ko) | 2021-02-16 | 2021-10-08 | 주식회사 메디오젠 | 락토바실러스 애시도필러스 배양 건조물을 포함하는 항산화용 조성물 |
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