KR20200067299A - 퇴행성 뇌질환의 치료 효과를 갖는 락토코커스 락티스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

락토코커스 락티스 SK-21 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 퇴행성 뇌질환의 치료 효과를 갖는 락토코커스 락티스 균주, 및 상기 균주를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료용 약학적 조성물 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물 등을 제공한다.

Description

퇴행성 뇌질환의 치료 효과를 갖는 락토코커스 락티스 균주 및 이의 용도{Lactococcus lactis strain for treating degenerative brain disease and uses thereof}

퇴행성 뇌질환의 치료 효과를 갖는 락토코커스 락티스 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

전 세계가 빠른 속도로 고령화 사회로 진입하고 있으며, 이에 따라 인간은 질병없이 건강하게 장수할 수 있는 높은 삶의 질을 추구하고 있다. 과학의 발달로 인한 수명의 연장으로 노인 인구가 증가하면서, 신경퇴행성 질환인 치매 환자의 비율이 급증하고 있다.

알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease)는 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로, 이 병의 특징은 서서히 발병하여 점차적으로 계속 진행되는 것이다. 알츠하이머성 치매의 증상은 인지기능 저하뿐만 아니라 성격변화, 초조함, 우울증, 망상, 환각, 공격성, 수면 장애 등의 정신행동이 나타난다. 알츠하이머성 치매의 말기에 이르면 경직, 보행 이상 등의 신경학적 장애가 나타나고 대소변 실금, 감염, 욕창 등 신체적인 장애도 나타난다. 알츠하이머성 치매는 발병 연령에 따라 65세 미만에서는 조발성(초로기) 알츠하이머성 치매, 65세 이상에서는 만발성(노년기) 알츠하이머성 치매으로 구분한다. 알츠하이머형 치매는 비교적 젊은 층에서도 발병하는 사례가 보고된 바 있으며, 65세에서 85세 범위 내에서는 나이가 5세 증가할 때마다 발병률이 2배씩 높아지는 등 노인 인구의 치매 유형 중 가장 흔한 형태로 알려져 있다. 2009년 전체 노인 인구의 사망자 중 알츠하이머형 치매로 사망한 환자가 2000년 대비 약 47% 증가하였다고 보고되고 있으며 알츠하이머형 치매 환자가 있는 가정의 의료비 지출은 다른 형태의 치매환자가 있는 가정의 의료비 지출보다 약 3.2배 정도 높은 것으로 나타나고 있다. 알츠하이머형 치매는 환자를 수용하는 수동적인 방법으로는 사회 경제적 부담을 감당할 수가 없기 때문에 치료요법 개발의 중요성이 한층 대두되고 있는 실정이다. 알츠하이머성 치매 환자의 뇌 조직을 검사하였을 때 노인반(senile plaque), 신경원섬유 다발(neurofibrillary tangle), 그리고 신경세포의 사멸(neuronal cell death)을 관찰할 수 있다. 알츠하이머성 치매의 정확한 발병 기전과 원인에 대해서는 알려져 있지 않지만, 현재는 신경전달물질(neurotransmitters)의 불균형과 베타 아밀로이드 단백질(amyloid β protein)이 과도하게 만들어져 뇌에 침착되면서 독성을 일으키는 것이 발병의 핵심 기전으로 알려져 있다. 그 외에도 타우 단백질(tau protein)의 과인산화, 신경염증(neuroinflammation), 산화적 물질 등이 뇌 세포 손상을 일으키는 것이 알츠하이머성 치매의 발병 원인으로 알려져 있다.

한편, 최근 치매 등으로 인해 저하된 인지기능 및 학습기능을 개선시키고 향상시키는 다양한 치료전략을 수립하고 효과적인 약물을 개발하고자 하는 노력이 시도되고 있다. 현재까지 개발된 기억력 개선 약물들에는 아세틸콜린 합성전구체(acetylcholine precursor), 수용체 활성제(receptor agonist), 아세틸콜린분해 억제제(acetylcholine esterase inhibitor) 등이 있다. 그러나 현재까지는 알츠하이머성 치매의 근본적인 발병원인을 치료할 수 있는 치료제는 개발되어 있지 않으며, 일반적인 치료제로서 사용 가능한 것으로는 아세틸콜린 에스테라제 저해제인 화이자사의 아리셉트(Aricept), 노바티스사의 엑셀론(Exelon), 그리고 얀센사의 레미닐(Reminyl)과 최근에 미국 FDA로부터 허가를 받은 NMDA 수용체의 길항제 기전의 룬드벡사의 에빅사(Ebixa: Memantine)가 있다. 그러나 아세틸콜린 에스테라제 저해제의 경우, 감퇴된 인지 능력을 개선해 줄 뿐 알츠하이머성 치매의 근본적인 발병 원인을 치료하지는 못한다. 또한 일부 환자에게서만 일시적인 증세 완화 효과를 보일 뿐, 그 약효가 오래 지속되지 못하므로 근본적인 치료제라 하기 어렵다. 뿐만 아니라, 질환의 특성상 장기 복용을 요하게 되는데, 상기 의약품들의 경우 간 독성, 구토, 식욕감퇴를 비롯한 여러 가지 부작용을 수반하는 것 또한 문제점으로 드러나고 있다. 따라서 질환의 진행 과정을 막아줄 수 있는 치료제의 개발이 시급한 과제가 되고 있다.

이러한 기술적 배경 하에서, 퇴행성 뇌질환을 근본적으로 치료할 수 있는 새로운 접근법이 다양하게 연구되고 있으나(한국 공개특허 10-2018-0068119), 아직은 미비한 실정이다.

일 양상은 항산화 및 항염증 활성을 갖는 락토코커스 락티스 SK-21 균주(Lactococcus lactis SK-21, 수탁번호: KFCC11795P)를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 균주를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주 배양하는 단계; 및 배양 후 얻어진 균체 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계를 포함하는, 락토코커스 락티스 SK-21 균주 배양액을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 항산화 및 항염증 활성을 갖는 락토코커스 락티스 SK-21 균주(Lactococcus lactis SK-21, 수탁번호: KFCC11795P)를 제공한다.

상기 락토코커스 락티스 SK-21 균주는 된장, 고추장, 간장, 치즈 및 젓갈과 같은 발효 식품으로부터 분리한 것일 수 있으며, 배지 내 혐기적 조건에서 배양된 콜로니로부터 수득된 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 락토코커스 락티스 Sk-1은 균주는 서열번호 1의 염기서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 상동성을 갖는 16s rDNA를 포함할 수 있으며, 종래의 락토코커스 락티스 균주에 비해 유의적으로 향상된 항산화 및 항염증 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 균주는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.

다른 양상은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 배양액의 농축물, 및 이들의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상기한 바와 같다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "예방"은 일 실시예에 따른 조성물의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"는 일 실시예에 따른 조성물의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환에 대한 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 약학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 "퇴행성 뇌질환"은 노화가 진행됨에 따라 뇌조직 또는 뇌세포의 구조 또는 기능이 퇴화되어 발생하는 질병을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병, 경도인지장애, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측삭 경화증, 간질, 허혈, 주의력결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증 또는 외상 후 스트레스 장애일 수 있고, 여기서, 상기 치매는 알츠하이머병형 치매, 노인성 치매, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 당뇨성 치매, 알코올성 치매, 샤르코 마리 투스 질환성 치매, 파킨슨병형 치매, 헌팅턴병형 치매, 크루츠펠트-야콥병형 치매, 픽스병형 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 또는 두부 외상으로 인한 치매일 수 있다. 또한, 상기 퇴행성 뇌질환은 뇌 조직 내 올리고머 아밀로이드(Aβ)의 형성과 관련된 질환으로서, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 프리온병, 또는 이로부터 유발된 치매 등일 수도 있다.

일 구체예에서, 상기 락토코커스 락티스 SK-21 균주의 배양액은 미생물 배양 배지에 상기 균주를 접종하고, 당업계에 공지된 미생물 배양방법(예를 들어, 정치 배양, 교반 배양)에 따라 제조될 수 있다. 또한, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 배양액의 농축물, 및 이들의 건조물은 역시 당업계에 공지된 미생물 또는 배양액의 처리, 농축 또는 건조 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다.

상기 약학 조성물에서, 상기 균주 등은 기존의 퇴행성 뇌질환 치료용 물질과 함께 복합 제제 형태로 사용될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 균주 등은 하기의 화학식을 갖는 올레로페인 (Oleuropein) 또는 이의 염과의 복합 제제 형태로 제조될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 락토코커스 락티스 SK-21 균주 또는 이의 배양액, 또는 상기 균주와 올레로페인의 복합 제제는 치매 동물모델의 피부 염증 및 탈모 현상을 현저하게 감소시킬 뿐만 아니라, 뇌 조직 내 올리고머 아밀로이드(Aβ)의 형성을 억제시킴으로써 뇌인지 기능 개선과 같은 행동학적 변화를 유도할 수 있었다. 따라서, 상기 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료는 전술한 균주의 항염증, 항산화 작용, 및/또는 올리고머 아밀로이드(Aβ)의 형성 억제능을 통해 달성될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으며, 이 밖에도 생체적합성 폴리머 등도 포함할 수 있다. 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기“약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 상기 균주는 하루에 1.0×10¹ 내지 1.0 ×10¹¹ CFU 범위 내, 또는 체중 1 kg 당 1 내지 500 mg 또는 치료학적으로 유효한 양의 배양액 등을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 5회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

일 양태로서, 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료방법을 제공한다. 상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또 다른 양상은 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 배양액의 농축물, 및 이들의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

상기 건강기능성 식품 조성물에 있어서, 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상기한 바와 같다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때 상기 건강기능성 식품 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

상기 건강 기능성 식품 조성물에서, 유효성분은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 건강 기능성 식품 조성물은 원료에 대하여 바람직하게 약 15 중량% 이하, 바람직하게는 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

상기 건강 기능성 식품 조성물은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에도, 일 양상에 따른 건강 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

또 다른 양상은 락토코커스 락티스 SK-21 균주(Lactococcus lactis SK-21, 수탁번호: KFCC11795P)를 배양하는 단계; 및

배양 후 얻어진 균체 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계를 포함하는, 락토코커스 락티스 SK-21 균주 배양액을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서 사용되는 락토코커스 락티스 SK-21 균주는 상기한 바와 같다.

일 구체예에 있어서, 상기 배양하는 단계는 예를 들어, pH 4 내지 5, pH 4.1 내지 4.9, pH 4.2 내지 4.8, 또는 4.3 내지 4.7의 범위의 혐기적 조건에서 수행될 수 있으며, 이때, 상기 배양시간은 예를 들어, 7 내지 9시간, 또는 7.5 내지 8.5 시간일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 배양하는 단계 전, 당업계에 공지된 방법에 따라 1차 종균 배양액 및 2차 종균 배양액을 제조할 수 있으며, 이후, 본 배양은 예를 들어, 5 내지 30g/L 농도의 당류, 1 내지 10g/L 농도의 말토덱스트린, 1 내지 10g/L 농도의 소듐아세테이트, 0.1 내지 3g/L 농도의 마그네슘 설페이트, 0.1 내지 3g/L 농도의 소금, 0.1 내지 1 내지 20g/L 농도의 물엿, 1 내지 10g/L 농도의 계면활성제를 포함하는 배지에서 진행할 수 있다.

일 실시예에 따른 방법에 의하면, 상기 방법은 우수한 생산 효율로 락토코커스 락티스 SK-21 균주 배양액을 대량 생산할 수 있으며, 이때, 상기 방법에 의해 제조된 균주 배양액은 우수한 항염증, 항산화 작용, 및/또는 올리고머 아밀로이드(Aβ)의 형성 억제능을 나타내어, 퇴행성 뇌질환의 개선 또는 치료에 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 조성물에 의하면, 일 실시예에 따른 락토코커스 락티스 SK-21 균주, 또는 상기 균주 등과 올레로페인을 유효성분으로 포함하며, 치매 동물모델에 대한 상기 조성물의 투여는 피부 염증 및 탈모 현상을 현저하게 감소시킬 뿐만 아니라, 뇌 조직 내 올리고머 아밀로이드(Aβ)의 형성을 억제시킴으로써 뇌인지 기능 개선에 크게 기여할 수 있었다. 따라서, 상기 균주 및 이를 포함하는 조성물은 퇴행성 뇌질환의 치료를 위한 유효물질로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 락토코커스 락티스 SK-21 배양액의 Neisseria gonorrhea에 대한 항균 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 온도에 따른 락토코커스 락티스 SK-21의 성장률 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 올리고머 아밀로이드에 의한 신경조직 내 세포사멸에 대하여, 락토코커스 락티스 SK-21 및 올레로페인 복합 제제의 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 치매 동물 마우스의 염증에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 치매 동물 마우스의 뇌조직 내 아밀로이드 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 Water morris maze 분석에서 치매 동물 마우스의 뇌인지 개선 효과를
행동 tracer 궤도를 통해 확인한 결과이다.
도 7은 상기 Water morris maze 분석에서 치매 동물 마우스의 뇌인지 개선 효과에 대한 그래프를 나타낸 것이다.
도 8은 치매 동물모델의 색깔 반응에 대한 (A) 분석상자틀, 및 (B) 안망막신경조직 콘세포 빈도를 나타낸 것이다.
도 9는 치매 동물모델의 물체형태 및 색깔 반응에 대한 (A) 분석상자틀, 및 (B) 안망막신경조직 콘세포 빈도를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. Lactococcus lactis SK21의 분리 및 동정

(1) 발효 식품으로부터 유산균의 분리

일반 가정의 된장, 고추장, 간장, 치즈 내지 젓갈(100μl)을 10 ml의 MRS 액체배지(MRS borth; Difco, USA)에 첨가하고, 이를 현탁하였다. 이후, 상기 상등액을 SPL(가평, 한국)의 미생물용 플라스틱 배양접시 내 MRS 고체 한천배지(MRS agar plate; Difco, USA)에 백금이(platinum loop)를 사용하여 접종하고 도말한 후, 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적 조건에서 배양하고, 이에 따라 형성된 콜로니로부터 균주를 분리하였다.

(2) 선별한 유산균의 동정

된장, 고추장, 간장, 치즈 및 젓갈으로부터 분리한 균주들의 생화학적 특성 및 16S 리보좀 RNA서열을 분석하여 균주의 종을 확정하였다. 상기 균주들 중 락토코커스 락티스 SK-21에 대한 미생물의 분류학적 동정은 Hammes 등[The prokaryotes, 1563-1578, 2nd Edition, Springer-Verlag Co.(1992)]의 방법에 따라 수행하였다. 이들 균주는 공히 그람 양성, 간균이며, 산소 유무와 상관없이 잘 생장하였고, 카탈라제와 운동성은 음성이었다. 또한, 이들은 15℃ 및 45℃에서 생장하였으며, 글루코스(glucose)로부터 가스를 생성하지 않았고, 알긴산으로부터 암모니아를 생성하지 않아 Lactococcus 속(genus)에 속함을 확인할 수 있었다. 종(species)을 결정하기 위하여 API 50CHL kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 50종의 당 발효 시험을 실시한 결과, 락토스 등 19종으로부터 산을 생성하였고 (하기 표 1 참고), ATB 동정시스템에 입력하여 조사한 결과와 16S rRNA Gene Sequence를 이용하여 얻어진 결과가 일치되어 락토코커스 락티스로 판명되었다. 상기 균주는 그람 양성균인 혐기성 간균으로서, 포자를 형성하지 않는 호기적 조건에서도 생존성을 나타내었고, 10~42℃ 조건에서 생존하였으며, pH 2에서 2시간 동안 안정적인 내산성 균주였다. 상기 동정된 락토코커스 락티스의 화학분류학적 특성으로 16S rDNA을 측정하였고, 그 결과, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것으로 확인할 수 있다. 상기 락토코커스 락티스 균주의 16S rDNA 염기서열을 Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 균주는 검색되지 않았으나, 락토코커스 락티스 C22의 16S rDNA 부분 서열과 99%의 상동성을 보였다. 이에 따라, 상기 분리된 균주를 락토코커스 락티스 SK-21로 명명하였다. 이후, 이를 한국미생물보존센터에 2018년 10월 04일자로 기탁하고, 수탁번호 KFCC11795P를 부여받았다.

한편, 상기 전술한 락토코커스 락티스 SK-21의 생화학적 특성은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 즉, 탄소원 이용성을 API Kit(모델명: API 50 CHL; 제조사 : BioMerieux’s, USA)에 의한 당 발효 시험으로 분석하였다. 하기 표 1에서, "+"는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타내고, "-"는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 나타낸다.

탄소원	균주명		탄소원	균주명
	Lactococcus lactis	Lactococcus lactis SK-21		Lactococcus lactis	Lactococcus lactis SK21
glycerol	+	+	salicin	+	+
erythritol	-	-	cellobiose	+	+
D-arabinose	-	-	maltose	+	+
L-rabinose	-	-	lactose	+	+
D-ribose	-	-	melibiose -	-	-
D-xylose	-	-	sucrose	+	+
L-xylose	-	-	trehalose	+	+
D-adonitol	-	-	inulin	-	-
methyl-β-D-xylopyranoside	-	-	melezitose	-	-
D-galactose	+	+	raffinose	-	-
D-glucose	+	+	starch	+	+
D-fructose	+	+	glycogen	-	-
D- -mannose	+	+	xylitol	+	+
L-sorbose	+	+	gentiobiose	+	+
L-rhamnose	+	+	D-turanose	-	-
dulcitol	-	-	D-lyxose	-	-
inositol	+	+	D-tagatose	-	-
mannitol	-	-	D-fucose	-	-
sorbitol	-	-	L-fucose	-	-
α-methyl-D-mannoside	-	-	D-arabitol	-	-
α-methly-D-glucoside	-	-	L-arabitol	-	-
N-acetyl-glucosamine	-	-	gluconate	-	-
amygdalin		+	2-keto-gluconate	-	-
arbutin	-	-	5-keto-gluconate	-	-
esculin	+	+

실시예 2. Lactococcus lactis SK21의 특성 분석

(1) 항생제 내성시험

항생제 내성시험은 트립틱 소이 브로스 배지(tryptic soy broth, Difco, USA)를 사용한 2배 희석법으로 처리된 상기 균주의 생장 여부를 관찰함으로써 최저억제농도(MIC)를 평가하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

항생제 종류	최소억제농도 (μg/ml)
아미노글로코사이드계열
아미카신	290
겐타마이신	650
가나마이신	3500
네오마이신	3800
스트렙토마이신	850
베타-락탐계열
페니실린-G	20
메치실린	460
옥사실린	30
암피실린	1210
그람-양성 스펙트럼
바시트라신	150
리팜피신	110
노보바이오신	10
린코마이신	700
항생제 종류	최소억제농도 (μg/ml)
그람-음성 스펙트럼
폴리마이신B	1240
광범위 스펙트럼
클로람페니콜	170

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, Lactococcus lactis SK21은 타 계열의 항생제에 비해 아미노글로코사이드계열중 아미카신, 겐타마이신, 가나마이신, 네오마이신에 대해서는 높은 내성을 나타내었던 반면, 노보바이오신에 대해서는 가장 높은 감수성을 보여주었다.

(2) pH 내성시험

pH 내성시험은 종래의 문헌(CLlark et al., Cultured Dairy Products J., 28(4),11,1993)에 기술된 방법에 따라 실시되었으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

배양시간(H)	pH1	pH2	pH3	pH6.5
0	6.77	9.02	8.45	9.01
1	0	9.06	8.67	9.21
2	0	8.99	8.88	9.34
3	0	9.01	8.91	9.21
(단위: CFU/ml)

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 대조 pH인 6.5뿐만 아니라 강산 조건인 pH 2에서도 균주의 생육에는 큰 영향이 없었으며, 이를 통해 상기 균주의 내산성을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 균주의 최적 pH 조건은 pH 4.2 내지 4.4임을 알 수 있었다.

(3) 항균력 시험

항균력 시험은 종래의 문헌(Gilliland & Speck, J. Food Prot., 40(12), 820, 1977)에 기술된 방법에 따라 실시되었으며, 그 결과는 하기 표 4 및 도 1에 나타내었다.

세균	식중독균 CFU/ml (pH)	Lactococcus lactis SK21 CFU/ml (pH)	억제율(%)
E.coli	1.35×106 (6.5)	5.13×105 (4.88)	32.21
Salmonella typhi	2.26×106 (6.51)	1.4×103 (4.67)	44.21
Staphylococcus aureus	3.42×106 (6.48)	1.2×103 (4.82)	37.21
PseudomonasAeruginosa	2.2×106 (6.11)	2.2×104 (4.24)	35.23
Neisseria gonorrhea	2.15×106 (6.02)	1.2×104 (4.24)	43.1

상기 표 4 및 도 1에 나타낸 바와 같이, Lactococcus lactis SK21의 처리는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에 대하여 32.21%, 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에 대하여 44.21%, 스테피로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)에 대하여 37.21%, 녹농균(Pseudomonas Aeruginosa)에 대하여 35.23%, 질염균(Neisseria gonorrhea)에 대하여 43.1%의 억제율을 나타냄을 알 수 있었다.

(4) 생장시험

상기 균주의 생장은 생균수 및 pH를 측정하여 평가하였다. 생균수의 측정을 위하여, 10% 탈지분유(150ml)에 1ml용 마이크로피펫으로 사용하여 유산균을 포함하는 droplet을 접종한 뒤, 30℃, 32℃, 34℃, 36℃, 38℃, 또는 40℃에서 3시간 간격으로 24시간까지 배양한 각 시료를 0.1% 펩톤 용액에 희석하였다. 이후, 이를 BCP plate count agar 평판 배지에서 부어 굳힌 후, 35 ℃에서 48시간 배양한 뒤, 이에 따른 생균수를 계수하였다. 온도에 따른 균주의 성장률은 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 생장을 위한 최적 온도는 37.5℃이고, 전술한 최적의 pH 조건인 pH 4.2 내지 4.4에 도달하는데에는 약 16시간이 소요되었다. 이러한 결과는 기존의 Lactococcus lactis 균주와 상이한 것이었다.

실시예 3. Lactococcus lactis SK21의 생산을 위한 배지 조성 및 생산 공정

(1) 7.5L의 발효조에서 균주의 생산

-80℃ 딥프리저 상에 보관된 배양 용액을 약 3분동안 급속 해동시킴으로써, MRS(1.0%(w/v) 펩톤(peptone), 1.0%(w/v) beef extract(육분말), 0.4%(w/v) yeast extract(효모분말), 2.0%(w/v) glucose(당), 0.5%(w/v) sodium acetate trihydrate(소듐 아세트산 삼가수물), 0.1%(w/v) polysorbate 80(폴리소르베이트 89; Tween 80), 0.2%(w/v) dipotassium hydrogen phosphate(이가포타슘 수산화 인산화물), 0.2%(w/v) triammonium citrate(삼암모니움 스크레이트), 0.02%(w/v) magnesium sulfate heptahydrate(마그네슘 황산 헵타하이드레이트), 0.005%(w/v) manganese sulfate tetrahydrate(마그네슘 황산 테트라하이드레이트), 1.0%(w/v) agar(아가) (pH6.2)(밀리포어, 머크, USA)를 포함하는 액상의 배양 용액을 수득한 뒤, 이를 멸균된 평판 배지에 37℃ 조건으로 3일 동안 배양시키고, 여기에 Lactococcus lactis SK21 단일 콜로니를 접종하였다. 이후, 멸균된 200ml의 GP broth(1% 포도당, 0.4% 펩톤, 0.25% 소금) 액체 배지가 함유된 250㎖ 삼각 플라스크에 상기 콜로니를 clean bench (무균상자)에서 무균 상태로 접종한 뒤, 37℃의 간헐진탕 배양기 (비전과학,한국)에서 14시간 동안 순수 배양하여, 이를 1차 종균 배양액으로 사용하였다. 이때, 1차 시드(seed) 배양액의 최종 pH는 4.2였으며, 기본적으로 pH 4.5±0.2가 유지되도록 하였다. 상기 1차 시드 배지와 동일한 배지를 2차 시드 배지로 사용하였다. 이후, 2L의 2차 시드 액체 배지를 3L 코리아바이오엔지니어링(BE) 발효조에 넣고 121℃에서 15분 조건으로 멸균 2차 종균 배양을 실시하였다. 2차 시드 배양은 발효조 내 질소가스로 완충된 37℃, 100rpm 조건으로, 18시간 동안 무균 상태로 배양하여, 이를 2차 종균 배양액으로 사용하였다. 이때, 2차 종균 배양액의 최종 pH는 4.5였으며 기본적으로 pH 5.2±0.2에서 재현성을 확인할 수 있었다. 상기 2차 종균 배양액을 미리 준비된 본 배양 배지에 곧바로 무균 접종하였다. 구체적으로, 7.5L BE 발효조 내에 GMSMM(Glucose, Mltose, Sodium acetic acid, Magnesium sulfate Millet jelley) broth (포도당 2%(w/v), 말토덱스트린 0.5%(w/v), 소듐아세테이트 0.1%(w/v), 마그네슘 설페이트 0.25%(w/v), 물엿 1%, 소금 0.25%(w/v), PEG 0.5%(w/v), pH 6.0)가 포함된 5L의 액체 배지를 121℃에서 15분 동안 멸균하여 이를 본 배양액으로 사용하였고, 상기 1L의 2차 시드 배양액를 무균적으로 7.5L BE 발효조에 접종하여 10시간 동안 37℃, 100rpm의 조건으로 혐기 배양하였다. 이때 최적의 배양 시간에서 최종 pH는 4.5이었고 pH 4.5±0.2가 유지되도록 하였다.

이후, 상기 배양액을 시간대별로 3㎖씩 수득한 뒤, 균주 분석을 통해 최종 생산성을 확인한 결과, 본 배양을 실시한지 8시간 이후로는 pH의 급격한 하락과 함께 생산성도 크게 저하됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터, 상기 균주의 배양 시간은 8시간, pH는 약 4.6으로 조정하는 것이 바람직하며, 상기 언급한 조건에서 균주 생산성은 15억 cfu(Colony-forming unit/ml)로 확인되었다.

배양 시간(h)	pH	생산량(×10 8 cfu/ml)
0	6.10	0
1	5.6	0
2	5.6	1
3	5.8	1
4	5.6	5
5	5.3	7
6	5.2	10
7	5.1	13
8	4.5	15
9	4.4	13
10	4.2	10

전술한 바와 같은, 배양이 완료된 본 배양액을 25℃로 급속 냉각시킨 다음, 원심분리기(VS1000, 비전과학, 한국(10,000rmp, 10분)를 이용하여 균체를 회수하고, 이를 냉장 보관하였다. 1kg의 스킨 밀크와 2kg의 락토오스를 10L의 증류수에 용해시켜 분산매를 조제하고, 이를 멸균 처리한 후, 상기 분산매 800ml를 취해서 원심분리가 완료된 균체와 균질하게 혼합 및 교반(100rpm)하여 농축 균액을 조제하였다. 상기 조제된 균액을 동결건조기에 넣고 2일 동안 동결건조 분말화 공정을 진행하였다. 이후, 동결건조된 균체를 수거하여 전분과 혼합하여 메쉬망(여과망)으로 거른 다음, 알루미늄 비닐로 포장하여 냉장 보관하였다.

(2) 75L의 발효조에서 균주의 생산

상기와 동일한 방법을 사용하여, 75L BE 발효조 내에 GMSMM broth(포도당 2%, 말토덱스트린 0.5%, 소듐아세테이트 0.1%, 마그네슘 설페이트 0.25%, 물엿 1%, 소금 0.25%, PEG 0.5%, pH 6.0)가 포함된 50L의 액체 배지를 121℃에서 15분 동안 멸균하여, 이를 본 배양액으로 사용하였고, 10L의 2차 시드 배양액을 무균적으로 75L BE 발효조에 접종하여 10시간 동안 37℃, 100rpm의 조건으로 혐기 배양하였다.

그 결과, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 상기 7.5L의 발효조를 사용한 경우와 마찬가지로 배양 8시간 째, 가장 높은 15억 cfu/ml의 생산량을 보여주었으며, 이후부터 실시예 1과 마찬가지로 점차 그 생산량이 감소되는 경향을 나타내었다.

배양 시간(h)	pH	생산량(×10 8 cfu/ml)
0	6.0	0
1	5.5	0
2	5.7	0
3	5.6	1
4	5.5	2
5	5.6	5
6	5.2	9
7	4.8	12
8	4.5	15
9	4.6	13
10	4.3	10

이러한 실험결과를 종합해 볼 때, 상기 확인된 배양 배지 조성, 배양 공정 그리고, 배양 시간을 통하여, 상기 균주의 생산성이 최적화될 수 있었다. 즉, 산업적 생산 측면에서, 상기 방법은 우수한 생산 효율로 균주 배양액을 대량 생산 할 수 있다.

[실험예]

실험예 1. 항염증 및 항산화 효과

마우스 해마세포주인 HT22세포를 10% FBS 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지(웰진, LM001-51, 대구)에서 배양하고, 12-well 플레이트에 웰 당 2×10⁴ 세포수가 되도록 분주하였다. 이후, 각 웰에 상기 균주들의 배양액(1×10⁴ CFU/㎖, 100μl)과 함께 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)로부터 분리한 LPS(lipopolysaccharide)를 0.2㎎/㎖의 농도로 첨가하고 배양하였다. 이후, NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 발현량을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하여 항염증 효과를 확인하였다. 또한, DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 에탄올에 0.2 mM 농도가 되도록 녹여 DPPH 용액을 제조하였다. 상기 DPPH 용액 0.1 ㎖에 상기 균주들의 현탁액(1×10⁸ CFU/㎖) 또는 대조군인 비타민 C 용액(1g/㎖)을 넣고 20분간 37℃에서 배양하였다. 배양액을 3,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 540㎚에서 상등액의 흡광도를 측정하고, 유산균의 항산화 활성을 계산하였다.

상기 실험들의 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

일련번호	항산화력	항염증	일련번호	항산화력	항염증
sk-1	+	+	sk-21	+++	+++
sk-2	+	-	sk-22	-	-
sk-3	-	-	sk-23	-	-
sk-4	-	-	sk-24	++	-
sk-5	++	+	sk-25	-	-
sk-6	+	-	sk-26	++	-
sk-7	-	-	sk-27	++	-
sk-8	-	-	sk-29	-	-
sk-9	-	-	sk-30	+	-
sk-10	++	-	sk-31	++	++
sk-11	+	-	sk-32	++	++
sk-12	-	-	sk-33	++	++
sk-13	-	-	sk-34	-	++
sk-14	-	-	sk-35	-	-
sk-15	-	-	sk-36	+	-
sk-20	+	+	sk-37	-	-

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, Lactococcus lactis (SK- 5, 10, 21, 24, 26, 27, 31, 32, 33) 유산균은 항산화 활성이 우수하고, 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS)의 활성을 강하게 저해하여 NF-κB의 활성화를 강력하게 억제하였다. 상기 유산균들은 항산화 효과, 또는 염증 발현 및 발암과 관련된 장내세균총의 유해균 효소활성 억제 효과가 우수하였다. 즉, 상기 유산균은 장내세균총의 유해균이 생산하는 내독소인 LPS(lipopolysaccharide)의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 항산화력을 나타내었다. 특히, 이들 중에서도 Lactococcus lactis SK21 균주의 효과는 다른 균주들에 비해 매우 현저하였다.

실험예 2. 올리고머 아밀로이드에 의한 해마 세포주의 생존효과

퇴행성 뇌질환 치료를 위한 복합 제제로서 Lactococcus lactis SK21 (이하, LL SK21로 명명함.)의 효능을 확인하기 위하여, 올리고머 아밀로이드에 따른 해마 세포주의 생존에 상기 복합 제제가 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, 10% FBS(암소혈장, 웰진) 및 0.1% 항생제(스트렙토마이신, 페니실린)를 함유하는 DMEM 배지(웰진, LM001-51)를 24-well 플레이트에 분주하고, 뇌 조직 내에 존재하는 해마 세포주 HT22(1x10³)를 첨가한 뒤, 이를 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 여기에 1μM 올리고머 아밀로이드를 첨가한 뒤, LL SK21 및 올레로페인 (제품번호: 12247, 시그마-알드리취) 복합 제제 (이하, LL0-SK21)를 25 μg/ml의 농도로 PBS에 녹인 후, 이를 올리고머 아밀로이드와 함께 배양된 해마 세포주에 첨가하였다. 한편, 대조군으로는 정상세포주에 1μM 올리고머 아밀로이드만 첨가한 군(oAβ)을 설정하였다.

해마세포의 사멸정도를 분석하였다, 도 3에 나타낸 바와 같이, 정상적인 성장을 보여주는 정상군에 올리고머 아밀로이드를 첨가한 경우(oAβ), 세포 독성으로 인해 유의적인 세포사멸이 유도되었던 반면, LLO-SK21 군은 정상군과 동등한 세포 생존의 형태학적 변화를 보여주었다. 즉, LL SK21 및 올레로페인 복합체제는 해마세포주에 대한 Aβ의 세포 독성을 경감시키고, 이를 통해 신경조직 내 세포사멸을 억제함을 알 수 있었다.

실험예 3. 치매 동물모델의 외형상 변화

APP(amyloid precursor protein), presenilin1(PS1) 및 Tau 유전자가 형질도입된 치매 동물모델(Tg-APP/PS1/Tau 마우스)를 제조하였다. 구체적으로, C57BL6/JxC3H hybrid 마우스와 집중 교차교배하여 얻은 자손의 꼬리 조직을 취하여 genomic DNA를 준비하고, PCR(polymerase chain reaction)을 통해 이를 증폭시켰다. 이후, 상기 준비된 genomic DNA를 사용하여 Tg-APP/PS/Tau 마우스를 각각 암수 5수 이상 확보하였다. 이후, 정상군인 C57BL6 마우스와 대조군인 Tg-APP/PS1/Tau 마우스에 1% CMC(carboxymethyl cellulose)를 공급하였으며, 실험군인 Tg-APP/PS/Tau 마우스에는 25μg/ml 농도의 LL SK21 및 올레로페인 복합 제제(LL0-SK21)를 하루에 2g/kg으로 제공되는 사료에 도포하여 공급하였다. 이후, 10주 동안 주 2회씩 치매 동물모델의 형태적 변화를 육안으로 관찰하였다. 한편, 추가 비교군으로는 Tg-APP/PS/Tau 마우스에 50 mg/kg의 커큐민을 제공한 군(curcumin)을 설정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 정상군과 달리 치매 동물모델(AD)의 등부위에서는 뚜렷한 피부 염증과 탈모 현상이 관찰되었나, 커큐민을 제공한 군(curcumin)에서는 이러한 반응이 어느 정도 개선되었다. 또한, LLO-SK21 군 역시 피부 염증 및 탈모 현상이 개선되었으며, 이러한 효과는 커큐민을 제공한 군에 비해서 우수한 것이었으며, 정상군과 유사한 수준을 나타내었다. 따라서, LL SK21 및 올레로페인 복합 제제는 치매로부터 비롯된 피부 염증 및 탈모 현상의 개선에 우수한 효과를 보였다.

실험예 4. 치매 동물모델 뇌조직에 형성된 플라크의 변화

3개월된 Tg-APP/PS/Tau 수컷 마우스 5수를 확보하였다. 대조군인 Tg-APP/PS1/Tau 마우스에 1% CMC(carboxymethyl cellulose)를 공급하였으며, 실험군인 Tg-APP/PS/Tau 마우스에는 LL0-SK21(20mg/Kg/day)을 10주간 처리하였다. 이후, 분당서울대병원 전임상 사육 프로토콜에 따라 치매 동물모델의 뇌 조직에서 올리고머 아밀로이드 변화를 측정하였고, 실험 시작으로부터 5개월 째, 뇌를 적출하여 조직학적 검사를 준비하였다. 실험군으로서 2개월간 LL0-SK21를 경구 투여한 마우스를 이소플란으로 마취한 다음, 이의 두개골을 절개하였다. 이후, 뇌 조직을 paraffin 포매한 뒤, 면역조직형광염색을 수행하였다. 구체적으로, 뇌조직 부위를 formalin으로 고정한 후, 50㎛의 두께로 vibrotome을 사용하여 절단하였다. 이후, 각각의 조직 슬라이드에 형광염색시약인 MX04(청색)을 표지하고, 올리고머 아밀로이드와 민감하게 반응하는 oAβ 압타머를 절편화된 뇌조직에 처리하여 4℃ 냉장실에서 12시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 슬라이드를 0.5×10배율 하에서 공초점 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 치매 동물모델(3xTg-AD 마우스)의 대뇌피질(cortex), 및 해마(Hippocampus)에서 다량의 plaque가 형성되었으나, LL0-SK21 처리군에서는 이러한 plaque의 형성이 현격하게 감소되었다. 또한, Tg-APP/PS/Tau 대조군에서는 많은 양의 올리고머 아밀로이드가 발현된 상태였던 반면, LL0-SK21 처리군 경우에는 대뇌피질과 해마영역 내 올리고머 아밀로이드(Aβ)의 형성이 크게 감소되었다. 이러한 결과를 종합해 보면, LL SK21 및 올레로페인 복합 제제는 올리고머 아밀로이드의 생성을 억제시킴으로써, 과도한 플라크 형성을 저해시킴을 알 수 있다.

실험예 5. 치매 동물모델에서의 행동 변화

LL0-SK21의 뇌인지 능력 향상 효과를 검증하기 위하여, 스테인레스 원통(직경×높이, 150cm×60cm)와 도피대(지름 10cm, 높이 30cm)로 이루어진, 웨터 메리즈 메이즈 (water morris maze, Harvard Apparatus, USA)에서 물미로 실험을 실시하였다. 수조의 물 온도는 22±2℃, 높이는 플렛폼을 기준으로 2cm로 설정하였고, 마우스가 도피대에 앉으면 몸이 물밖으로 나올수 있도록 하였다. 상기 물미로 실험에서 치매 동물모델이 수조 표면 또는 주변의 표지물을 이용하여 도피대를 찾아가기 때문에 주변의 환경 변화가 없도록 표지물을 실험기간 동안 일정하게 유지하였다. 실험동물이 도피대를 찾아가 20초 이상 머무르면 찾아 갈때까지 걸린시간을 탈출 잠복기(escape latency)로 평가하였으며, 이를 1일 3회 실시한 평균값을 평균 탈출 잠복기로 측정하였다. 탈출 잠복기는 수조위 천정에 카메라를 설치하여 컴퓨터프로그램(스마트 비디오 추적시스템 V3.0, PanLab SL, Barcelona, Spain)을 통해 관찰하여 기록하였다. 실험은 6일 동안 매일 3회 실시하였으며, 이때, 수조에 투입되는 실험동물의 위치를 순차적으로 달리하여 우연에 의해 도피대를 찾는 가능성을 최소화하였다.

그 결과, 도 6에 나타내는 바와 같이, 50mg/kg의 커큐민 섭이군(curcumin), 및 25mg/kg의 oleuropein 섭이군(oleuropein)에서도 치매 대조군(AD)에 비해 뇌인지 개선시간이 유의적으로 짧았으나, 20mg/kg의 LL SK21 섭이군(LL SK21) 및 20mg/kg의 LL0-SK21 섭이군(LL0-SK21)에서의 효과가 보다 현저하였다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군(Normal), 치매군(AD), 25mg/kg의 oleuropein 섭이군(oleuropein), 50mg/Kg의 커큐민 섭이군(curcumin), 20mg/kg의 LL SK21 섭이군(LL SK21) 및 20mg/kg의 LL0-SK21 섭이군(LL0-SK21)의 경우, 최종일의 평균탈출시간은 각각 28±2초, 356±36초, 245±15초, 156±21초, 122±11초, 및 58±2초를 보였는바, LL SK21 섭이군 및 LL0-SK21 섭이군에서 현저하게 향상된 뇌인지 회복효과를 확인할 수 있었다.

특히, LL0-SK21 군의 경우, 정상군과 거의 유사한 뇌인지 능력을 보여 주었으며, 이는 장내 미생물의 유익균 증가가 장기적으로 장내 세균총의 균형으로 인해 뇌신경세포를 파괴하는 치매인자를 감소시키거나, 장내 유익균의 2차 대사체가 염증을 억제하여 뇌기능을 활성화하는데 기여하였기 때문이라고 예상되었다. 또한, 이러한 효과는 기존 도네페질보다 우수한 뇌인지 개선 효과를 보여주는 것으로서, 치매 치료제가 없는 현 시점에서, 본 실시예에 따른 균주 또는 균주 배양물은 치료 보조제 등으로서, 충분한 효과를 나타낼 것으로 예상되었다.

실험예 6. 치매 동물모델의 색깔비전에 대한 반응도

치매 동물모델의 망막 황반조직 주변 콘세포에 대한 색깔비전에 대한 반응도 변화를 분석하고자, 바탕이 흰색인 상자(가로×세로 80cm×80cm, 높이 40cm)의 동서남북 정중간 모서리에 100mm 플라스틱 배양접시를 각각 위치시키고, 상기 배양접시를 색깔별로 적색, 녹색, 청색 및 흰색으로 색칠하였다. 이후, 여기에 약 25g의 사료를 공급한 뒤, 정상 마우스, 치매 동물모델, 커큐민 섭이군 및 LL0-SK21 섭이군으로서 각각 5마리씩 상자 내에 풀어놓고 12시간씩 3회 반복하여 카메라를 통해 관찰하였다. 이후, 이들의 행동을 컴퓨터프로그램(스마트 비디오 추적시스템V3.0, PanLab SL, Barcelona, Spain)을 통해 기록하고 분석하였다.

그룹명	적색	녹색	청색	흰색
정상 마우스	34±5	231±22	167±11	56±8
치매 마우스	269±12	78±5	57±5	110±13
치매 마우스+커큐민	121±36	110±2	78±3	78±7
치매 마우스+LL0-SK21	67±7	216±45	145±23	68±5

그 결과, 상기 표 8 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스는 적색, 녹색, 청색 및 흰색을 인식하는 콘분포가 각각 34±5, 231±22, 167±11 및 56±8이었던 반면, 치매 마우스는 각각 269±12, 78±5, 57±5 및 110±13을 나타내었다. 이러한 결과로부터 정상 마우스는 주로 청색 및 녹색을 이용하지만, 치매 마우스의 경우에는 올리고머 아밀로이드-베타가 망막신경조직에 발현되어 이들 콘세포 사멸을 유도하므로 망막조직에는 주로 적색이 주로 분포하는 상태, 즉 적색 콘세포들을 이용하는 경향을 확인할 수 있었다. 한편, 커큐민 섭이군은 각각 121±36, 110±2, 78±3 및 78±7; LL0-SK21 섭이군은 각각 67±7, 216±45, 145±23 및 68±5를 나타내었다. 즉, 이는 LL0-SK21 섭이군의 경우, 장내 미생물의 유해균의 증식이 억제되어, 독성물질 또는 아밀로이드의 생성이 저해되거나 세포사멸이 감소됨으로써, 시각의 망막세포에 정상군과 유사하게 청색과 녹색콘 세포의 분포가 증가되어 있음을 나타내는 것이다.

실험예 7. 치매 동물모델의 물체형태 및 색깔비전에 대한 반응도

치매 동물모델의 망막 황반조직 주변 콘세포에 대한 물체형태 및 색깔비전에 대한 반응도 변화를 분석하고자, 바탕이 흰색인 상자(가로×세로 80×80cm, 높이 40cm)의 동서남북 정중간 모서리에 각각 다른 입체 나무모형 (녹색:원통기둥, 적색:사각기둥, 청색:원뿔기둥, 흰색:삼각기둥)을 위치시키고, 높이가 4cm인 부분에 약 25g의 사료를 공급하였다. 이후, 정상 마우스, 치매 동물모델, 커큐민 섭이군 및 LL0-SK21 섭이군으로서 각각 5마리씩 상자 내에 풀어놓고 12시간씩 3회 반복하여 카메라를 통해 관찰하였다. 이후, 이들의 행동을 컴퓨터프로그램(스마트 비디오 추적시스템 V3.0, PanLab SL, Barcelona, Spain)을 통해 기록하고 분석하였다.

그룹명	적색:사각기둥	녹색:원통기둥	청색:원뿔기둥	흰색:삼각기둥
정상 마우스	24±3	178±51	154±42	73±5
치매 마우스	221±42	98±12	27±2	156±32
치매 마우스+커큐민	145±46	126±12	45±7	89±2
치매 마우스+LL0-SK21	45±4	145±25	135±31	63±2

그 결과, 상기 표 9 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스는 각각의 콘 분포가 24±3, 178±51, 154±42 및 73±5였던 반면, 치매 마우스는 각각 221±42, 98±12, 27±2 및 156±32을 나타내었다. 이러한 결과로부터 정상 마우스는 주로 청색/원뿔기둥 및 녹색/원통기둥을 이용하지만, 치매 마우스의 경우에는 올리고머 아밀로이드베터가 망막신경조직에 발현되어 이들 콘세포 사멸을 유도하므로 망막조직에는 주로 적색/사각기둥을 주로 분포하는 상태에서 먹이 활동을 위한 최소한의 적색 콘세포들을 이용함을 확인할 수 있었다. 한편, 커큐민 섭이군은 각각 145±46, 126±12, 45±7 및 89±2; LL0-SK21 섭이군은 각각 45±4, 145±25, 135±31 및 63±2를 나타내었다. 이러한 실험 결과 역시, 상기와 마찬가지로, 독성물질이나 아밀로이드의 생성이 저해되거나 세포사멸이 감소됨에 따른 결과로 판단되었다.

이러한 실험결과를 종합해 보면, 본 실시예에 따른 균주 또는 균주 배양물은 치매를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료를 위한 유효물질로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

한국미생물 보존 센터 KFCC11795P 20181004

<110> JP biotec CO.,LTD. <120> Lactococcus lactis strain for treating degenerative brain disease and uses thereof <130> PN123219KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1418 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA <400> 1 tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtt gagcgatgaa gattggtgct 60 tgcaccaatt tgaagagcag cgaacgggtg agtaacgcgt ggggaatctg cctttgagcg 120 ggggacaaca tttggaaacg aatgctaata ccgcataaca actttaaaca taagttttaa 180 gtttgaaaga tgcaattgca tcactcaaag atgatcccgc gttgtattag ctagttggtg 240 aggtaaaggc tcaccaaggc gatgatacat agccgacctg agagggtgat cggccacatt 300 gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tcggcaatgg 360 acgaaagtct gaccgagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaaactct 420 gttggtagag aagaacgttg gtgagagtgg aaagctcatc aagtgacggt aactacccag 480 aaagggacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtcccg agcgttgtcc 540 ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggt ggtttattaa gtctggtgta aaaggcagtg 600 gctcaaccat tgtatgcatt ggaaactggt agacttgagt gcaggagagg agagtggaat 660 tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaggaac accggtggcg aaagcggctc 720 tctggcctgt aactgacact gaggctcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagatatcc 780 ctggtagtcc acgccgtaac gatgagtgct agatgtaggg agctataagt tctctgtatc 840 gcagctaacg caataagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg 900 aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 960 accttaccag gtcttgacat actcgtgcta ttcctagaga taggaagttc cttcgggaca 1020 cgggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1080 cgcaacgagc gcaaccccta ttgttagttg ccatcattaa gttgggcact ctaacgagac 1140 tgccggtgat aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacy 1200 tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagtcg cgagacagtg atgtttagct 1260 aatctcttaa aaccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagtcgg 1320 aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380 ccgcccgtca caccacggga gttgggagta cccgaagt 1418

Claims (16)

1. 항산화 및 항염증 활성을 갖는 락토코커스 락티스 SK-21 균주(Lactococcus lactis SK-21, 수탁번호: KFCC11795P)
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 퇴행성 뇌질환에 대한 치료 효과를 나타내는 것인, 균주.
   
3. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 16s rDNA를 포함하는 것인, 균주.
   
4. 청구항 1에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병, 경도인지장애, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측삭 경화증, 간질, 허혈, 주의력결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증 및 외상 후 스트레스 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 균주.
   
5. 청구항 4에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머병형 치매, 노인성 치매, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 당뇨성 치매, 알코올성 치매, 샤르코 마리 투스 질환성 치매, 파킨슨병형 치매, 헌팅턴병형 치매, 크루츠펠트-야콥병형 치매, 픽스병형 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 및 두부 외상으로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 균주.
   
6. 락토코커스 락티스 SK-21 균주(Lactococcus lactis SK-21, 수탁번호: KFCC11795P) 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 배양액의 농축물, 및 이들의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 청구항 6에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병, 경도인지장애, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 픽병, 근위축성 측삭 경화증, 간질, 허혈, 주의력결핍-과잉행동장애, 정신분열증, 우울증 및 외상 후 스트레스 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
   
8. 청구항 7에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머병형 치매, 노인성 치매, 혈관성 치매, 루이체 치매, 전측두엽 치매, 당뇨성 치매, 알코올성 치매, 샤르코 마리 투스 질환성 치매, 파킨슨병형 치매, 헌팅턴병형 치매, 크루츠펠트-야콥병형 치매, 픽스병형 치매, 정상압 뇌수두증에 의한 치매, 및 두부 외상으로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
   
9. 청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 올레로페인 (Oleuropein)을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
   
10. 청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 뇌 염증반응에 대한 억제 효과를 갖는 것인, 약학적 조성물.
    
11. 청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 인지 능력 및 기억력 개선 효과를 갖는 것인, 약학적 조성물.
    
12. 락토코커스 락티스 SK-21 균주(Lactococcus lactis SK-21, 수탁번호: KFCC11795P) 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주 유래의 소포체, 상기 배양액의 농축물, 및 이들의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
    
13. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 올레로페인 (Oleuropein)을 추가로 포함하는, 식품 조성물.
    
14. 락토코커스 락티스 SK-21 균주(Lactococcus lactis SK-21, 수탁번호: KFCC11795P)를 배양하는 단계; 및
    배양 후 얻어진 균체 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계를 포함하는, 락토코커스 락티스 SK-21 균주 배양액을 제조하는 방법.
    
15. 청구항 14에 있어서, 상기 균주 배양액은 퇴행성 뇌질환의 치료 효과를 갖는 것인, 방법.
    
16. 청구항 14에 있어서, 상기 배양하는 단계는 pH 4 내지 5의 혐기적 조건에서 7 내지 9시간 동안 배양되는 것인, 방법.

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