KR102578408B1 - 지방간 개선 효능을 갖는 신규 락토바실러스 사케이 균주 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)는 인체에 안전하고 프로바이오틱 특성을 가진다. 또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체는 간세포 내 지방축적 억제, 지방 합성 관련 유전자의 발현 감소, 지방 대사 관련 유전자의 발현 증가, 혈중 염증성 사이토카인의 함량 감소, 장내 미생물 균총의 개선 등과 같은 다양한 기능성을 가지며, 간손상 지표인 혈중 ALT, AST, TG, TCHO 등을 감소시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체는 지방간을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 의약품 내지 건강기능식품의 유용한 소재로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규 균주 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 지방간을 개선할 수 있는 신규 락토바실러스 사케이 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
지방간은 간세포 내에 중성 지방이 비정상적으로 축적되어 간의 비대화를 유발하는 증상을 말한다. 지방간 질환에는 과도한 음주로 인해 발생하는 알코올성 지방간 질환과 대사 조절장애로 발생하는 비알코올성 지방간 질환이 있다. 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 단순 지방간(simple nonalcoholic fatty liver, NAFL)에서부터 염증 및 섬유화가 동반되는 보다 진행된 형태인 비 알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)를 모두 포함하는 스펙트럼이 넓은 질환이다.
비알코올성 지방간 질환 치료제에 대한 임상적 수요도는 매우 높고 많은 제약사들이 연구개발 중이지만, 충분히 효과적인 약물의 개발이 아직 미흡한 질환군이다.
한편, 최근 발효식품에 존재하는 유산균 또는 인간의 장내 미생물총에 존재하는 유산균에 대한 지식과 이를 이용하는 기술의 발전은 인간의 질병과 치료에 대한 기존의 관점을 변화시켰다. 인간의 장내 미생물은 약 1-2 kg의 총 질량을 가진 다양한 박테리아로 구성된 복잡한 생태계이다. 장내 미생물은 숙주와 긴밀한 관계를 유지하며 비타민 생산, 점막 면역계 및 박테리아 전위 (bacterial translocation)에 중요한 역할을 한다. 장은 간문맥을 통하여 간과 직접 연결되어 있으며, 간은 중요한 식이 영양소와 미생물-관련 구성 요소로 구성된 장 생산물 (gut products)의 주요 대사기관으로 장-간축 (gut-liver axis)이라는 용어로도 불리고 있어, 장내 미생물의 교란은 NAFLD를 포함한 간 질환으로 이어질 수 있다. NAFLD에 대한 기존 치료법은 낮은 순응도, 효능 부족 또는 식이 요법 및 생활 습관의 변화로 인해 종종 비효율적이다. 이론적으로는, 프로바이오틱스의 투여를 통한 장내 미생물의 조절이 효과적일 수 있으며 최근의 연구는 이 이론을 지지하는 몇 가지 가능성을 보여준 바 있다.
유산균을 이용한 지방간 개선 기술과 관련하여, 대한민국 등록특허공보 제10-1955276호에는 지방 합성 관련 유전자인 FAS(fatty acid synthase), SREBP-1(sterol regulatory element binding protein-1), SREBP-2(sterol regulatory element binding protein-2) 및 HM GCR(hydroxymethylglutaryl-CoA reductase) 유전자의 발현을 억제함으로써 비알코올성 지방간 개선 효능을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) HY7207(수탁번호: KCTC13691BP)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-2279283호에는 수탁번호 KCTC 13670BP인 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) CKDB001 균주를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간증 (steatosis) 또는 비알코올성 지방간염 (steatohepatitis)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-2128098호에는 수탁번호 KCTC 14149BP인 락토바실러스 델브루키 subsp. 락티스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) CKDB001 균주를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-2043740호에는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HY7014(수탁번호: KCTC 13689BP)를 유효성분으로 함유하는 알코올성 지방간 개선을 위한 식품조성물이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2022-0057323호에는 수탁번호 KCTC 14323BP인 락토바실러스 무단지앙엔시스 (Lactobacillus mudanjiangensis) CKDB001 균주를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이 개시되어 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 지방간을 개선할 수 있는 신규 신규 락토바실러스 사케이 균주 및 이의 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명은 합성 화학물질에 비해 안전성이 높고 지방간 개선 또는 치료 등에 사용할 수 있는 신규 소재를 발굴하기 위해 다양한 발효식품으로부터 간세포 지방축적 억제 효능이 우수하고 간세포에 대해 독성이 없는 신규 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 스크리닝하고, 상기 신규 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주가 식품학적으로 안전하고 프로바이오틱스로서 필요한 활성을 가지며 동시에 지방 합성 억제, 지방 분해 촉진, 항염증 활성, 장내 미생물 균총의 변화 등과 같은 다양한 기능성을 통해 지방간을 효과적으로 개선시킬 수 있다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)의 사균체를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)는 인체에 안전하고 프로바이오틱 특성을 가진다. 또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체는 간세포 내 지방축적 억제, 지방 합성 관련 유전자의 발현 감소, 지방 대사 관련 유전자의 발현 증가, 혈중 염증성 사이토카인의 함량 감소, 장내 미생물 균총의 개선 등과 같은 다양한 기능성을 가지며, 간손상 지표인 혈중 ALT, AST, TG, TCHO 등을 감소시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체는 지방간을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 의약품 내지 건강기능식품의 유용한 소재로 사용될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 HepG2 세포에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
도 2는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 계통분류학적 비교분석 결과를 나타내는 진화관계 트리이다.
도 3은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 혈중 생화학 지표 등의 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 4는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 H&E로 염색된 간 절편의 조직병리학적 관찰 결과로 나타낸 것이다.
도 5는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 맹장 미생물총 조성 및 맹장 내 단쇄 지방산(SCFAs) 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 6은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 간조직 내 지방 합성 관련 유전자 및 지방 대사 관련 유전자의 발현량 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 7은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 간조직 내 지방 합성 단백질 및 지방 대사 관련 단백질의 발현량 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 8은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 체중(A), 몸무게 증가량(B), 간 무게(C), 간과 체중의 비율(D), 장간막 무게(E) 및 부고환 주변 지방 무게(F) 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 9는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 혈청 수준에서 ALT(aspartate aminotransferase) 함량(A), AST(aspartate aminotransferase) 함량(B), 중성지방(triglyceride, TG) 함량(C) 및 총콜레스테롤(total cholesterol, TCHO) 함량(D) 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 2는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 계통분류학적 비교분석 결과를 나타내는 진화관계 트리이다.
도 3은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 혈중 생화학 지표 등의 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 4는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 H&E로 염색된 간 절편의 조직병리학적 관찰 결과로 나타낸 것이다.
도 5는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 맹장 미생물총 조성 및 맹장 내 단쇄 지방산(SCFAs) 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 6은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 간조직 내 지방 합성 관련 유전자 및 지방 대사 관련 유전자의 발현량 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 7은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 간조직 내 지방 합성 단백질 및 지방 대사 관련 단백질의 발현량 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 8은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 체중(A), 몸무게 증가량(B), 간 무게(C), 간과 체중의 비율(D), 장간막 무게(E) 및 부고환 주변 지방 무게(F) 분석 결과로 나타낸 것이다.
도 9는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 혈청 수준에서 ALT(aspartate aminotransferase) 함량(A), AST(aspartate aminotransferase) 함량(B), 중성지방(triglyceride, TG) 함량(C) 및 총콜레스테롤(total cholesterol, TCHO) 함량(D) 분석 결과로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배양물"은 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 배양된 미생물이 포함되는 개념이이다. 구체적으로 상기 배양물은 미생물 배양액일 수도 있고, 미생물 배양액을 고형화한 고체상일 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "조성물"은 2가지 이상의 성분이 균일하게 혼합되어 있는 상태의 물질을 의미하며, 완제품뿐만 아니라 완제품 제조를 위한 중간 소재를 포함하는 개념이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소 또는 완화시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 프로바이오틱스로서의 필요한 특성과 함께 지방간 개선 효능 등과 같이 인체에 유익한 다양한 기능성을 가지면서 식품학적으로 안전한 신규 유산균에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 유산균은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)이다. 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 16S rDNA를 갖는다. 또한, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체는 간세포 내 지방축적 억제, 지방 합성 관련 유전자의 발현 감소, 지방 대사 관련 유전자의 발현 증가, 혈중 염증성 사이토카인의 함량 감소, 장내 미생물 균총의 개선 등과 같은 다양한 기능성을 가진다. 구체적으로, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체는 지방 합성 관련 유전자인 FAS(fatty acid synthase) 및 ACC(acetyl-CoA carboxylase) 유전자의 발현을 감소시키고, 지방 대사 관련 유전자인 PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor alpha) 및 CPT1A(carnitine palmitoyltransferase 1a) 유전자의 발현을 증가시킨다. 또한, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체는 지방 합성 관련 단백질인 FAS(fatty acid synthase) 및 SREBP-1(sterol regulatory element-binding protein 1) 단백질의 발현을 감소시키고 지방 대사 관련 단백질인 PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor alpha) 단백질의 발현을 증가시킨다. 또한, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체는 IL-1β, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 혈중 농도를 감소시킨다. 또한, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체는 장내 미생물 군집 중에서 Firmicutes 문 및 Actinobacteria 문에 속하는 세균을 감소시키고 Venrrucomicrobia 문 및 Tenericutes 문에 속하는 세균을 증사키며 장내 미생물 균총을 정상적으로 회복시킬 수 있다. 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체를 고지방식이에 의해 지방간이 유도된 실험동물에 투여하는 경우 간손상 지표인 혈중 ALT, AST, TG, TCHO 등을 감소시키고 지방간, 특히 비알코올성 지방간을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 신규 유산균인 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)의 사균체를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 지방간은 알코올성 지방간, 비알코올성 지방간 등에서 선택될 수 있고, 비알코올성 지방간인 것이 바람직하다.
본 발명에서 배양물은 미생물을 배지에서 배양시켜 수득한 산물로서, 상기 배지는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 MRS 액체 배지, MRS 한천 배지, BL 한천 배지 등 일 수 있다.
본 발명에서 사균체는 유산균을 열처리하여 사멸시킨 균체로서, 생균보다 안전성이 높고 생균과 효능이 유사하거나 더 높은 것으로 보고되고 있다.
또한, 본 발명에서 상기 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 건강기능식품 조성물 등으로 구체화될 수 있고, 조성물 내에서 유효성분인 특정 락토바실러스속 균주 등의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분인 신규 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 이의 추출물 또는 이의 사균체의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 신규 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 이의 추출물 또는 이의 사균체 외에 지방간 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으나 바람직하게는 유효성분을 기준으로 할 때 0.01 내지 3000 ㎎/㎏ B.W.이고, 더 바람직하게는 0.1 내지 2000 ㎎/㎏ B.W.이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP) 또는 이의 사균체를 기준으로 할 때 1×106 CFU/kg B.W. 내지 1×1015 CFU/kg B.W.이고 바람직하게는 1×108 CFU/kg B.W. 내지 1×1012 CFU/kg B.W.이다.
또한, 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에서 유효성분인 신규 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 이의 추출물 또는 이의 사균체의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~25 중량%, 더 바람직하게는 0.5~10 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품(health functional food) 외에 이와 유사한 개념을 갖는 식이보충제(dietary supplement) 및 식품보충제(food supplement)를 모두 포함한다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 상기 보조 첨가제에는 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제 등이 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분 외에 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 간세포를 이용한 지방축적 억제 유산균의 스크리닝
(1) 발효식품에서 분리된 유산균의 지방축적 억제 효능 확인 시험
김치 등의 발효식품에서 분리하고 종(species)을 확인한 후 보관 중인 15개의 유산균들의 지방축적 억제 효능을 확인하기 위해 간세포와 공배양하고 간세포의 지방축적을 관찰하였다. 간세포는 한국 세포주은행에서 구입한 HepG2 세포를 사용하였다. HepG2 세포를 5 ×105 cells/mL 로 6-well plate에 접종하고 10% 소태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)을 포함하는 DMEM(Dulbecco’Modified Eagle Medium) 배지에서 37℃의 온도 및 5% CO2 조건으로 24 hr 동안 배양하였다. 이후, 배지를 소태아혈청(FBS)이 없는 DMEM 배지로 교체하고 하룻밤동안 starvation 시켰다. 이후, 유산균을 항생제가 없고 지방 성분으로 1 nM 올레산(Oleic acid), 7.5 ㎍/mL 콜레스테롤(cholesterol)이 보충된 DMEM 배지에 108 및 109 CFU/mL 농도로 현탁하고, 유산균 현탁액을 트랜스웰 막 인서트(Transwell membrane insert)에 접종한 후 HepG2 세포와 약 6 hr 동안 공배양하였다. 이후, 트랜스웰 막 인서트(Transwell membrane insert)를 제거하고 HepG2 세포를 PBS 버퍼로 세척한 후 10% 포름알데히드로 약 5분 동안 고정시키고 오일레드오(Oil Red O) 시약으로 염색한 후 현미경으로 지방축적을 관찰하였다. HepG2 세포에 축적된 지방을 정량화하기 위해 염색한 HepG2 세포를 PBS 버퍼로 세척한 후 100% 이소프로판올을 첨가하여 염색된 지방적(fat droplet)을 용해시키고 ELISA 리더기를 이용하여 510 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
하기 표 1에 15개의 유산균에 대한 간세포 지방축적 억제 효능 확인 실험 결과를 정리하였다.
| 처리 물질 | 지방 축적량(Control 대비 백분율) | 지방 축적량 감소율(OA-C와 비교한 값임) |
| Control(정상군) | 100 | - |
| OA-C(음성 대조군) | 173.76 | - |
| Simvastatin (1μM, 양성 대조군) | 136.87 | 21.23 |
| Lactobacillus gasseri MJM61024 | 122.59 | 29.45 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 151.53 | 12.79 |
| Lactobacillus rhamnosus MJM60370 | 157.33 | 8.93 |
| Lactobacillus brevis MJM60386 | 132.25 | 23.89 |
| Lactobacillus heveticusMJM60419 | 158.27 | 8.91 |
| Lactobacillus fermentum MJM60430 | 172.69 | 0.62 |
| Lactobacillus casei MJM60432 | 177.36 | -2.07 |
| Lactobacillus paracasei MJM60434 | 152.72 | 12.11 |
| Lactobacilus helveticus MJM60463 | 160.42 | 7.68 |
| Streptococus thermophilus MJM60636 | 171.11 | 1.53 |
| Lactobacillus sakei MJM60958 | 92.46 | 46.76 |
| Lactobacillus rhamnosus MJM60711 | 146.26 | 15.83 |
| Lactobacilus helveticus MJM60825 | 152.72 | 12.11 |
| Lactobacillus plantarum MJM61025 | 145.53 | 16.25 |
| Lactobacillus curvatus MJM61026 | 139.46 | 19.74 |
* 유산균 처리농도 : 109 CFU/mL
* Control(정상군) : HepG2 세포에 아무런 처리도 하지 않은 실험군
* OA-C(음성 대조군) : HepG2 세포를 1 nM 올레산(Oleic acid), 7.5 ㎍/㎖ 콜레스테롤(cholesterol)로 처리한 실험군
* Simvastatin (1μM, 양성 대조군) : HepG2 세포를 1 nM 올레산(Oleic acid), 7.5 ㎍/㎖ 콜레스테롤(cholesterol) 및 1μM 심바스타틴으로 처리한 실험군
하기 표 1에서 보이는 바와 같이 지방산 및 콜레스테롤에 의해 지방축적이 유도된 간세포에 대해 대부분의 유산균은 지방축적 억제 효능을 보였고, 특히 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 지방축적 억제 효능이 현저하게 높은 것으로 나타났다.
(2) 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 세포독성 확인
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 세포독성을 확인하기 위하여, 지방축적 억제 효능 확인 시험과 동일한 조건으로 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 HepG2 세포와 공배양한 후 트랜스웰 막 인서트(Transwell membrane insert)를 제거하고 HepG2 세포를 5 ㎎/mL 농도의 MTT 용액 20 ㎕로 4 hr 동안 처리하였다. 이후, 상등액을 제거하고 HepG2 세포를 200㎕의 다이메틸설폭사이드(DMSO)로 처리하여 포르마잔 결정(formazan crystal)을 녹인 후, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 미처리구와 비교하여 결정하였다. 그 결과, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.
도 1은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 HepG2 세포에 미치는 영향을 관찰한 결과이다. 도 1에서 MJM6958 또는 MJM60958은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 나타낸다. 도 1의 A는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 HepG2 세포와 공배양시킨 후 HepG2 세포를 오일레드오(Oil Red O)로 염색하여 관찰한 사진이고, 도 1의 B는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 HepG2 세포와 공배양시킨 후 HepG2 세포 내 지방축적을 정량화한 결과이고, 도 1의 C는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 HepG2 세포와 공배양시킨 후 MTT 어세이를 사용하여 HepG2 세포의 생존율을 측정한 결과이다. 도 1에서 Control은 HepG2 세포에 아무런 처리도 하지 않은 정상군이고, OA-C는 HepG2 세포를 1 nM 올레산(Oleic acid), 7.5 ㎍/㎖ 콜레스테롤(cholesterol)로 처리한 음성 대조군이고, Simvastatin은 HepG2 세포를 1 nM 올레산(Oleic acid), 7.5 ㎍/㎖ 콜레스테롤(cholesterol) 및 1μM 심바스타틴으로 처리한 양성 대조군이다.
(3) MJM60958 균주의 동정 결과
발효식품에서 분리된 유산균 중 간세포 내 지방축적 억제 효능이 가장 우수한 MJM60958 균주를 분자생물학적인 방법으로 동정하였다. MJM60958 균주로부터 genomic DNA isolation kit를 사용하여 유전체 DNA를 분리하고 이를 주형으로 한 PCR을 진행하여 16S ribosomal DNA를 증폭하였다. 이 때 PCR primer로는 범용 프라이머인 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였다. 증폭된 DNA를 클로닝(cloning) 하여 염기서열을 분석한 결과, MJM60958 균주의 16S rDNA는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것으로 나타났다. MJM60958 균주의 16S rDNA를 Ezbiocloud 데이터베이스(ChunLab Inc., Seoul, South Korea)에서 표준 균주의 16S rDNA와 비교하여 유사성을 탐색하고, Clustral X를 사용하여 다수 균주의 연관관계 있는 서열을 배치하였고, MEGA X 소프트웨어를 사용하여 계통분류학적 비교분석을 한 후 이웃 종과의 진화관계 트리를 만들었다. 그 결과, MJM60958 균주의 종은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 판명되었다. 도 2는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 계통분류학적 비교분석 결과를 나타내는 진화관계 트리이다.
(4) 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 기탁 정보
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 2022년 10월 11일에 공인기탁기관인 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC; 주소 : 대한민국 전라북도 완구군 이서면 농생명로 166)에 부다페스트 조약에 의거한 국제특허기탁을 진행하여 수탁번호 KACC 81232BP를 부여받았다. 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)는 부다페스트 조약에 규정된 절차 내에서 제3자에게 분양될 수 있다.
2. 락토바실러스 사케이(
Lactobacillus sakei
) MJM60958 균주의 안전성 및 프로바이오틱스 특성 규명
(1) 항생제 감수성 평가
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 항생제 감수성은 유럽식품안전청(European Food Safety Authority, EFSA, 2012) 기준을 사용하여 평가하였다. 검증한 항생제는 Chloramphenicol, Ampicillin, Tetracycline, Gentamycin, Kanamycin, Streptomycin, Erythromycin, Clindamycin, Vancomycin 이다.
유산균을 MRS 배지에서 배양한 후 MacFarland 0.5로 MRS 배지에 현탁하여 유산균 현탁액을 준비하였다. 512 ㎍/mL 농도의 항생제를 2-fold dilution 형식으로 항생제 농도가 0.25가 될 때까지 희석하여 항생제 희석액을 준비하였다. 이후, 96-well plate에 항생제 히석액 100 ㎕와 유산균 현탁액 100 ㎕를 혼합후 37℃에서 24 hr 동안 배양하였다. 이후, 육안으로 유산균의 생육을 확인하고 유산균이 자라지 않는 최고 농도를 최저저해농도((MIC)로 설정하였다. 그 결과, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주에 대한 최소저해농도는 EFSA에서 권장하는 최소저해농도 이하로 나타났고, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 항생제 감수성을 갖고 있는 것으로 확인되었다.
(2) 용혈 활성 평가
균주가 용혈 활성을 가지고 있는 경우 숙주의 적혈구를 파괴시키므로 프로바오틱스로 사용되는 유산균은 용혈 활성을 가지지 않아야 한다.
혈액 한천 배지(TSA blood agar)에 균주를 도말하고 37℃에서 24 hr 동안 배양한후 투과광으로 용혈반응을 확인하였다. 혈액 한천 배지(TSA blood agar)는 TSA 한천 배지를 멸균하고 40~50℃로 냉각시킨 후에 멸균된 양 혈액(sheep blood)을 5% 첨가하여 제조하였다. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 용혈 활성이 없는 것으로 확인되었다.
(3) 생체 유래 아민(Biogenic amine) 생성 평가
L-tyrosine, L-histidine, L-ornithine, L-phenylalanine, L-lysine과 같은 아미노산을 각각 첨가한 decarboxylase 배지(Tryptone : 0.5 wt%; yeast extract : 0.5 wt%; beef extract : 0.5 wt%; sodium chloride : 0.25 wt%; glucose : 0.05 wt%; tween 80 : 0.1 wt%, MgSO4 : 0.02 wt%; MnSO4 : 0.005 wt%; FeSO4 : 0.004 wt%; Ammonium citrate : 0.2 wt%; Thiamine : 0.001 wt%; dipotassium phosphate : 0.2 wt%; calcium carbonate : 0.01 wt%; pyridoxal 5-phosphate : 0.005 wt%; Amino acid(one of the amino acid listed above) : 1 wt%; bromocresol purple : 0.006 wt%; agar 2 wt%; pH : 5.3)에 시험 균주를 접종하고 37℃에서 16~24 hr 동안 배양한 후, 콜로니 주변의 보라색 색소 생성 유무로 생체 유래 아민 생성 여부를 확인하였다. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 생체 유래 아민을 생성하지 않는 것으로 확인되었다.
(4) D-Lactate 생산 여부
인체는 L-lactate를 대사할 수 있지만, L-lactate의 이성질체인 D-lactate를 대사할 수 없다. 유산균의 경우, L-lactate를 D-lactate로 변환하는 효소인 DL-lactate recamase를 가지고 있고, 유산균의 DL-lactate recamase 활성이 강한 경우, 유산균을 섭취하는 신생아, 어린아이 및 선천성 단장증후군환자에게 D-Lactate가 축적되어 산독증(acidosis)을 유발시킬 수 있다.
시험 균주를 37℃에서 24 hr 동안 배양한 후 상등액을 회수하고, D-lactate enzyme test kit(Megazyme, Ireland)를 사용하여 D-lactate 함량을 측정하였다. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 안전하다고 알려진 LGG(Lactobacillus rhamnosus GG) 유산균보다 D-lactate 생산성이 높지 않은 것으로 확인되었다.
(5) 담즙산 분해능(Bile salt deconjugation) 평가
담즙산(Bile salt)은 지방을 유화시키고 lipase의 작용을 촉진하여 지방산 분해에 도움을 준다. 프로바이오틱스에 존재하는 담즙산 가수분해효소(bile salt hydrolase)는 담즙산(bile salt)로부터 프로바이오틱스를 보호하여 장내 정착을 늘리기도 하지만, 담즙산(bile salt)을 분해(deconjugation)시켜 담즙산(bile salt)의 지방 유화 기능을 없애기 때문에 지방산 분해를 어렵게 한다. 또한, 분해된 담즙산은 다른 장내 미생물의 대사에 의해 독성을 가진 2차 대사산물을 전환되며, 이는 잠재적으로 위험성을 가질 수 있다.
0.5% TDCA(taurodeoxycholic acid)가 첨가된 MRS 한천 배지에 시험 균주를 도말하고, 혐기 조건 및 37℃에서 48 hr 동안 배양한 후, 콜로니 주변에 불투명한 하얀색 콜로니의 형성 여부를 관찰였다. 하얀색 콜로니가 형성되면 양성으로 판단한다. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 하얀색 콜로니가 형성되지 않았고 음성으로 판정되었다.
(6) 뮤신 분해능 평가
시험 균주의 뮤신 분해 여부는 0.3% 돼지 위 뮤신(porcine gastric mucin)이 첨가된 한천 배지를 사용하여 확인하였다. 상기 배지에 시험 균주를 도말하고, 혐기 조건 및 37℃에서 48 hr 동안 배양하였다. 이후, 배양 플레이트를 착색제(0.1% Amido black을 포함하는 3.5 M acetic acid)로 30분 동안 착색하고 콜로니 주변에 뮤신 분해 영역(mucin lysis zone)이 나타날 때까지 1.2M 아세트산으로 세척하였다. 뮤신 분해 활성은 뮤신 분해 영역의 크기로 정의되며, 양성 대조군과 비교하여 시험 균주의 뮤신 분해 여부를 판단하였다. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 뮤신을 분해하지 않는 것으로 확인되었다.
(7) 인간 상피조직 유사 세포 라인에 대한 부착능 평가
인간 상피조직 유사 세포주인 HT-29 세포주를 미생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 상피세포 부착능 실험에 사용하였으며, [Tuo et al., 2013]에 기재된 방법을 참조하여 실험을 수행하였다.
먼저, 20%(v/v)의 비활성화 FBS(fetal bovine serum), 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎎/㎖의 스트렙토마이신 항생제가 첨가된 DMEM 배지에 HT-29 세포를 접종하고 37℃의 온도 및 5%의 CO2 농도 환경을 가진 배양기에서 배양하였다. 이후, 잘 분화된 HT-29 세포를 12-웰 플레이트(Well Plates)에 웰당 2×105 cells의 양으로 분주하고 매일 배지를 교환하면서 24 hr 동안 배양하여 80%가 채워진 단일층(monolayer)을 형성시켰다. 이후, HT-29 세포 단일층을 PBS로 3번 세척하고 항생제가 없는 DMEM 배지로 교환한 후, 시험 균주를 최종 농도가 1×108 CFU/mL가 되게 접종하고, 37℃의 온도 및 5%의 CO2 농도 환경에서 2 hr 동안 배양하였다. 이후, 세포 단일층을 PBS로 3번 세척하여 부착되지 않은 시험 균주를 제거하고 1% Triton-X 100 용액 200 ㎕를 첨가하여 시험 균주가 부착된 세포 단일층을 파쇄하였다. 이후, 파쇄액 1 ㎖를 연속희석법을 이용하여 MRS 한천 배지에 도포한 후 37℃에서 48 hr 동안 배양한 후 균수를 확인하였다. 시험 균주의 부착능은 부착된 시험 균주의 콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU)를 계산하여 평가하였다. 시험 균주의 HT-29 세포주에 대한 부착 %는 아래의 식을 사용하였다.
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 HT-29 세포에 대해 약 5.09%의 부착능을 나타내었고, LGG(Lactobacillus rhamnosus GG) 유산균보다 장 상피세포 부착능이 우수한 것으로 확인되었다.
하기 표 2에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주 및 대조군으로 사용된 LGG(Lactobacillus rhamnosus GG) 유산균의 프로바이오틱 특성 중 안전성에 대한 평가 결과를 정리하였다.
| 안전성 평가 항목 | Lactobacillus sakei MJM60958 | LGG | |
| Antibiotics | Ampicillin | 1 | 1 |
| Vancomycin | 256 (NR) | 512 (NR) | |
| Gentamycin | 16 | 32 (R) | |
| Kanamycin | 2 | R | |
| Streptomycin | 1 | 32 (R) | |
| Tetracycline | 1 | 1 | |
| Clindamycin | 1 | 1 | |
| Erythromycin | 1 | 1 | |
| Chloramphenicol | 1 | 4 | |
| D-lactate production | - | - | |
| Bile salt deconjugation | - | - | |
| Bioamine production | L-Histidine | - | - |
| L-Tyrosine | - | - | |
| L-phenylalanine | - | - | |
| Arginine | - | - | |
| Tryptophan | - | - | |
| L-ornithine | - | - | |
| Mucin degradation | - | - | |
| Hemolytic activity | - | - | |
| Adhesion to HT-29 (%) | 5.09 | 3.19 | |
* NR : not required; R : resistant
(8) 구강-위장관 통과 조건에서의 내성 평가
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주에 대해 다음과 같이 구강-위장관 통과 내성 어세이(Oro-gastrointestinal transit tolerance assay)를 수행하였다.
먼저, 구강 통과 스트레스를 주기 위해, 150 ㎎/ℓ의 라이소자임(lysozyme)을 포함하는 전해질 용액(NaCl, 6.2g/ℓ; KCl, 2.2g/ℓ; CaCl2, 0.22g/ℓ; NaHCO3, 1.2g/ℓ)에서 시험 균주를 1×109 CFU/㎖의 양으로 접종하고 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 이후, 구강 통과 스트레스 조건에서 배양된 균체를 원심분리(1,800 × g, 5분) 하여 구강 스트레스 용액으로부터 분리하고, 위 통과 스트레스를 주기 위해 분리된 균체를 0.3% 펩신(pepsin)을 포함하고 pH가 3인 전해질 용액에 접종한 후 37℃에서 1 hr 동안 배양하였다. 이후, 위 통과 스트레스 조건에서 배양된 균체를 원심분리(1,800 × g, 5분) 하여 위 스트레스 용액으로부터 분리하고, 소장 통과 스트레스를 주기 위해 분리된 균체를 0.1% 판크레아틴(pancreatin) 및 0.3% 담즙염(bile oxgall)을 포함하고 pH가 7인 전해질 용액(NaCl, 5g/ℓ; KCl, 0.6g/ℓ; CaCl2, 0.25g/ℓ)에 접종하고 37℃에서 2 hr 동안 배양하였다.
각각의 스트레스가 가해진 조건에서 배양이 완료된 후 배양액을 샘플링하고 샘플링된 균주 배양액을 적정 배수로 희석하여 현탁액을 제조하고, 균주 현탁액을 MRS 한천 배지에 도포한 후 37℃에서 48 hr 동안 배양하여 콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU)를 계산하였다. 각각의 스트레스 처리 후에도 생존하는 균주의 수를 Log10 CFU의 스케일로 표시하였고, 그 결과를 하기 표 3에 정리하였다.
| OGI transit | 스트레스 여부 | 균주 생존수 (Log10 CFU/mL) | |
| Lactobacillus sakei MJM60958 | LGG | ||
| Initial | 9.05 | 9.12 | |
| Oral stress | - | 9.04 | 9.09 |
| + | 9.04 | 9.00 | |
| Gastric stress (pH3) | - | 9.03 | 9.07 |
| + | 8.86 | 8.84 | |
| Gastric stress (pH2) | - | 9.04 | 9.05 |
| + | 8.44 | 8.74 | |
| Intestinal stress | - | 9.03 | 9.08 |
| + | 7.16 | 7.79 | |
상기 표 3에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 구강-위장관 통과 조건 스트레스에 대해 대조군으로 사용된 LGG(Lactobacillus rhamnosus GG) 유산균과 유사한 수준의 저항성을 갖는 것으로 확인되었다.
(9) 항균 활성 평가
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 항균 활성을 한천 웰 확산 어세이(agar well diffusion assay)로 측정하였다. 시험 균주를 MRS 액체 배지에 접종하고 24 hr 동안 배양한 후 상등액을 회수하였다. 이후, 상등액을 필터로 멸균하고 병원균이 깔려있는 플레이트 위에 웰을 이용하여 상등액 100 ㎕를 로딩하였다. 이후, 37℃에서 배양한 후 병원균의 성장 저해 구역 직경을 측정하였다. 하기 표 4에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 항균 활성 평가 결과를 정리하였다.
| 병원균 | Diameter of Zone Inhibition (mm) | |
| Lactobacillus sakei MJM60958 | LGG | |
| Salmonella gallinarum KCTC 2931 | 10 | 10 |
| Escherichia coli K99 | 4 | 8 |
| Escherichia coli O1 KCTC 2441 | 8 | 8 |
| Escherichia coli 0138 | 6 | 6 |
| Escherichia coli ATCC25922 | 6 | 8 |
| Salmonella choleraesuis KCTC 2932 | 10 | 8 |
| Salmonella typhi KCTC 2514 | 6 | 8 |
| Pseudomonas aeruginosa KCCM 11802 | 10 | 10 |
상기 표 4에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 다양한 장내 병원균에 대해 항균 활성을 나타내었다.
3. 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 동물모델을 이용한 락토바실러스 사케이(
Lactobacillus sakei
) MJM60958 균주의 지방간 개선 효능 검증
(1) 실험동물 및 사양관리
7주령된 C57BL/6 암컷 마우스를 7일 동안 적응 기간을 거치게 한 후 본 실험에 사용하였다. 실험동물을 4 마리씩 마우스용 케이지에 수용하고 22±2℃의 온도, 55±5%의 습도 및 12시간 단위로 명암 주기(light-dark cycle)가 조절된 사육실에서 사육하였다. 적응 기간 동안 모든 실험동물에거 설치류 pellet 사료와 물을 자유 급식하였다.
(2) 실험군 분리 및 약물 투여
적응 기간이 경과한 후 실험동물을 군당 8마리씩 5개의 군으로 구분하고, 각 군의 실험동물을 12주 동안 미리 설계한 조건으로 처리하였다. 투여 시작일에 사료 섭취에 따른 체중 사이를 줄이기 위해 12 hr 동안 사료 급여를 제한하였으며, 물은 자유롭게 급여하였다. 정상군(Control Group)의 실험동물에는 일반사료(normal diets)를 급여하였다. 고지방사료 급여군(HFD Group)의 실험동물에는 고지방사료(high-fat diets, HFD)를 급여하여 비알코올성 지방간을 유도하였다. 고지방사료(high-fat diets, HFD)는 지방 45%, 탄수화물 35% 및 단백질 20%로 구성되어 있다. 실리마린 급여군(Silymarin Group)의 실험동물에는 고지방사료(high-fat diets, HFD)를 급여하여 비알코올성 지방간을 유도하고 동시에 실리마린(Silymarin)을 50㎎/㎏ B.W.의 용량으로 1일 1회 경구투여하였다. MJM60958 저용량 급여군[MJM60958(108) Group]의 실험동물에는 고지방사료(high-fat diets, HFD)를 급여하여 비알코올성 지방간을 유도하고 동시에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 1×108 CFUs/mice의 용량으로 1일 1회 경구투여하였다. MJM60958 고용량 급여군[MJM60958(109) Group]의 실험동물에는 고지방사료(high-fat diets, HFD)를 급여하여 비알코올성 지방간을 유도하고 동시에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 1×109 CFUs/mice의 용량으로 1일 1회 경구투여하였다. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 MRS 배지에서 24 hr 동안 배양하고 균체를 회수한 후 PBS로 2번 세척하고 증류수에 현탁하여 매일 신선하게 준비하고 실험동물에 경구투여하였다. 정상군(Control Group) 및 고지방사료 급여군(HFD Group)의 실험동물에는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주 대신 비이클로 사용되는 증류수를 경구투여하였다. 12주 동안의 처리가 경과한 후 실험동물을 3% 이소플루란(isoflurane) 용액으로 마취하고 혈액을 채취하고, 경추 탈구 방식으로 희생시켰다. 희생된 실험동물로부터 간(Liver), 신장(Kidney) 및 부고환 주위 지방(Epidydimal fat) 등을 적출하였다. 필요한 장기를 10% 포르말린으로 고정시키거나 액체질소로 급냉한 후 -80℃의 저온 냉장고에서 보관하면서 향후 분석에 사용하였다.
(3) 체중 및 장기 무게의 변화
12주 동안의 처리가 경과한 후 실험동물의 체중과 장기(간, 신장 및 부고환 주위 지방)의 무게를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 5에 정리하였다.
| 측정 항목 | 실험군 구분 | ||||
| Control | HFD | Silymarin | MJM60958(108) | MJM60958(109) | |
| Bodyweight (g) | 30.35 | 42.93 | 33.78 | 39.89 | 34.14 |
| Epidydimal fat weight (g) | 0.22 | 0.34 | 0.30 | 0.33 | 0.31 |
| Kidney weight (g) | 0.18 | 0.2 | 0.18 | 0.20 | 0.17 |
| Liver weight (g) | 1.28 | 1.77 | 1.20 | 1.30 | 1.24 |
| Liver weight/Body weight (%) | 4.09 | 4.44 | 3.73 | 3.29 | 3.63 |
상기 표 5에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD Group)에 비해 실험동물의 체중, 간 무게 등이 크게 감소하였다. 또한, 고지방사료 급여군(HFD Group)의 실험동물은 간의 색상이 하얀색으로 전형적인 지방간의 형태를 보였으나, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군의 실험동물은 간의 색상이 정상군(Control Group)의 실험동물과 유사한 수준으로 회복되었다.
(4) 혈중 생화학 지표 분석 및 혈중 Leptin, Adiponectin, IL-1β, TNF-α 함량 측정
실험동물로부터 채취한 혈액을 2000×g의 조건으로 10분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하고, 자동혈액분석기를 사용하여 혈청 수준에서 AST(aspartate aminotransferase), ALT(aspartate aminotransferase), 총콜레스테롤(total cholesterol, TCHO), 중성지방(triglyceride, TG), 요산(uric acid, UA), BUN(urea nitrogen) 및 크레아틴(creatine, CRE) 함량을 분석하였다. 또한, ELISA 키트를 이용하여 혈청 수준에서 Leptin, Adiponectin, IL-1β 및 TNF-α의 함량을 측정하였다.
도 3은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 혈중 생화학 지표 등의 분석 결과로 나타낸 것이다. 도 3의 A는 실험동물의 혈청 ALT(aspartate aminotransferase) 함량을 나타낸 것이고, B는 실험동물의 혈청 AST(aspartate aminotransferase) 함량을 나타낸 것이고, C는 실험동물의 혈청 중성지방(triglyceride, TG) 함량을 나타낸 것이고, D는 실험동물의 혈청 총콜레스테롤(total cholesterol, TCHO) 함량을 나타낸 것이고, E는 실험동물의 혈청 크레아틴(creatine, CRE) 함량을 나타낸 것이고, F는 실험동물의 혈청 BUN(urea nitrogen)을 나타낸 것이고, G는 실험동물의 혈청 요산(uric acid, UA) 함량을 나타낸 것이고, H는 실험동물의 혈청 Leptin 함량을 나타낸 것이고, I는 실험동물의 혈청 Adiponectin 함량을 나타낸 것이고, J는 실험동물의 혈청 IL-1β 함량을 나타낸 것이고, K는 실험동물의 혈청 TNF-α 함량을 나타낸 것이다. 도 3에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군에서는 간손상 지표인 ALT, AST, TG, TCHO 가 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD Group)에 비해 유의적으로 감소하였다. 또한, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD Group)에 비해 렙틴 함량이 유의적으로 감소하였고 아디포넥틴 함량은 증가하였다. 또한, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD Group)에 비해 염증성 사이토카인인 IL-1β 및 TNF-α 함량이 감소하였다. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물의 지방대사 조절인자를 변화시키고 염증을 완화시키는 것으로 확인되었다.
(5) 조직병리학적 관찰
장기 중량 측정 후 간의 외좌엽을 10% 중성 포르말린(formalin)으로 고정한 다음 파라핀(paraffin) 포매를 실시하고, 5 ㎛ 두께의 연속절편을 제작하였다. 이 후 연속절편을 hematoxylin-eosin (H&E)으로 염색하고, computer image analysis system (CaseViewer by 3DHITECH, Budapest, Hungary)을 이용하여 400배로 확대하고 분석하였다. 분석한 이미지에 대해 간세포 내의 지방 소포 비율에 기초하여 다음과 같이 총 4개의 수준으로 지방증 등급(steatosis grade)을 매겼다.
* level 0 (정상, <5%); level 1 (경증, 5 - 33%); level 2 (중간, 34 - 66%); level 3 (중증, > 66%)
도 4는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 H&E로 염색된 간 절편의 조직병리학적 관찰 결과로 나타낸 것이다. 도 4에서 A는 정상군(Control Group)에 대한 결과이고, B는 고지방사료 급여군(HFD Group)에 대한 결과이고, C는 실리마린 급여군(Silymarin Group)에 대한 결과이고, D는 MJM60958 저용량 급여군[MJM60958(108) Group]에 대한 결과이고, E는 MJM60958 고용량 급여군[MJM60958(109) Group]에 대한 결과이다. 도 4에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD Group)에 비해 지방이 축적된 간세포가 현저히 줄어들고 정량적 결과인 지방증 등급(steatosis grade)이 현저히 감소하였다.
(6) 대변 샘플의 분석
실험동물을 희생시킨 후, 맹장을 즉시 적출하여 대변을 수집하고 -80℃에서 보관하였다. 메타지놈 부넉을 실시하기 위해 ExgeneTM Stool DNA mini kit를 이용하여 수집한 대변에서 DNA를 추출하였다. 이후, 세균의 16S rRNA 유전자의 V3-V4 구간을 바코드된 범용 프라이머 341F 및 805R을 이용하여 증폭하고 미생물 군집을 분석하였다.
도 5는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 맹장 미생물총 조성 및 맹장 내 단쇄 지방산(SCFAs) 분석 결과로 나타낸 것이다. 도 5에서 MJM60958은 MJM60958 고용량 급여군[MJM60958(109) Group]을 나타낸다. 도 5에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD Group)에 비해 문(phylum) 수준에서는 Firmicutes 및 Actinobacteria 비율이 각각 4.6%, 0.6% 감소되고, Venrrucomicrobia 및 Tenericutes 비율이 각각 3.85%, 1.033%로 증가되어 장내 미생물 다양성이 회복된 것으로 확인되었다. 또한, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD Group)에 비해 과(family) 수준에서는 Akkermansiaceae 및 Ruminococcaceae의 풍부도가 각각 3.35% 및 1.68%로 증가되었고, Clostridiales vadinBB60 group, Clostridiaceae 1, Atopobiaceae, Lachnospiraceae 및 Peptostreptococcaceae의 풍부도가 각각 2.5%, 0.32%, 0.1%, 1.34%, 및 0.45%로 감소하였다. 고지방사료 급여로 실험동물의 혈중 생화학 지표가 악화되고 비알코올성 지방간이 발생되었으나, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 투여로 실험동물의 장내 미생물 균총 변화가 이루어지고, 혈중 생화학 지표가 회복되며 비알코올성 지방간이 개선되는 것으로 사료된다.
(7) RNA 추출 및 RT-qPCR(Reverse Transcription-Quantitative Polymerase Chain Reaction) 분석
간조직에서 지방 합성과 지방 대사에 관련된 유전자의 발현량을 RT-qPCR 분석 방법으로 확인하였다. Trizol 시약을 사용하여 간조직에서 RNA를 추출하고, TaKaRa Kit를 사용하여 역전사를 수행하고, Primescript 1st Strand cDNA Synthesis Kit를 사용하여 cDNA를 합성하였다. qPCR은 SYBR Green Master Mix를 이용하여 수행하였고, 타겟 유전자의 증폭을 위한 반응 프로그램은 stage 1 : 94℃(10분); stage 2 : 94℃(15초) 45회 반복 후 60℃(1분); stage 3 : 95℃(10초), 65℃(60초), 97℃(1초) 이었다. 타겟 유전자의 증폭을 위한 프라이머 정보를 하기 표 6에 정리하였다.
| 타겟 유전자 | 프라이머 종류 | 프라이머 염기서열(5'→3') |
| FAS | 정방향 | AGGGGTCGACCTGGTCCTCA |
| 역방향 | GCCATGCCCAGAGGGTGGTT | |
| ACC | 정방향 | AACATCCCGCACCTTCTTCTAC |
| 역방향 | CTTCCACAAACCAGCGTCTC | |
| PPARα | 정방향 | AGAGCCCCATCTGTCCTCTC |
| 역방향 | ACTGGTAGTCTGCAAAACCAAA | |
| CPT1A | 정방향 | TGGCATCATCACTGGTGTGTT |
| 역방향 | GTCTAGGGTCCGATTGATCTTTG | |
| IL-6 | 정방향 | ACAACCACGGCCTTCCCTACTT |
| 역방향 | CACGATTTCCCAGAGAACATGTG | |
| β-actin | 정방향 | ACAACCACGGCCTTCCCTACTT |
| 역방향 | CACGATTTCCCAGAGAACATGTG |
도 6은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 간조직 내 지방 합성 관련 유전자 및 지방 대사 관련 유전자의 발현량 분석 결과로 나타낸 것이다. 도 6에서 MJM60958 또는 60958은 MJM60958 고용량 급여군[MJM60958(109) Group]을 나타낸다. 도 6에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD Group)에 비해 간조직에서 지방 합성 관련 유전자인 FAS 및 ACC 유전자의 발현이 감소하였고 지방 대사 관련 유전자인 PPARα 및 CPT1A의 발현은 증가하였다.
(8) 간조직 내 단백질 발현량 분석
간조직 내 단백질 발현량을 분석하기 위해 웨스턴블랏(western blot)을 실시하였다. 간조직을 액체질소를 사용하여 분말 형태로 분쇄한 후, RIPA lysis buffer를 이용하여 간조직으로부터 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질의 양을 BCA protein assay kit를 이용하여 정량화하였다. 이후, 40㎍의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 겔에 로딩하고 polyvinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인에 전이시켰다. 이후, 멤브레인을 3% BSA를 포함하는 Tris-buffered saline (TBS) 버퍼로 4℃에서 1 hr 동안 blocking 한 다음 각종 항체를 이용하여 타겟 단백질을 검출하고 ImageJ program을 사용하여 단백질 발현량을 정량화하였다. 타겟 단백질을 검출하기 위해 FAS antibody (1:200), SCREBP-1 antibody (1:1000), PPARα antibody (1:1000), β-actin antibody (1:1000)을 사용하였고, 2차 항체로 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibody (1:10,000)를 사용하였다.
도 7은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 간조직 내 지방 합성 단백질 및 지방 대사 관련 단백질의 발현량 분석 결과로 나타낸 것이다. 도 7에서 MJM60958은 MJM60958 고용량 급여군[MJM60958(109) Group]을 나타낸다. 도 7에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주가 투여된 실험군에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD Group)에 비해 간조직에서 지방 합성 관련 단백질인 FAS 및 SREBP-1의 발현이 감소하였고 지방 대사 관련 단백질인 PPARα의 발현은 증가하였다.
4. 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 동물모델을 이용한 락토바실러스 사케이(
Lactobacillus sakei
) MJM60958 균주 사균체의 지방간 개선 효능 검증
(1) 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체 제조
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 MRS 배지에 접종하고 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다. 이후, 회수한 균체를 PBS 버퍼로 세척하고 65℃에서 1 hr 동안 가열하고 실온에서 냉각하는 사이클을 3번 반복하여 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체를 제조하였다. 제조한 사균체를 MRS 한천 배지에 도포하고 배양한 후 균주의 사멸 여부를 확인하였다.
(2) 실험동물 및 사양관리
7주령된 C57BL/6 암컷 마우스를 7일 동안 적응 기간을 거치게 한 후 본 실험에 사용하였다. 실험동물을 4 마리씩 마우스용 케이지에 수용하고 22±2℃의 온도, 55±5%의 습도 및 12시간 단위로 명암 주기(light-dark cycle)가 조절된 사육실에서 사육하였다. 적응 기간 동안 모든 실험동물에거 설치류 pellet 사료와 물을 자유 급식하였다.
(3) 실험군 분리 및 약물 투여
적응 기간이 경과한 후 실험동물을 군당 12마리씩 6개의 군으로 구분하고, 각 군의 실험동물을 16주 동안 미리 설계한 조건으로 처리하였다. 투여 시작일에 사료 섭취에 따른 체중 사이를 줄이기 위해 12 hr 동안 사료 급여를 제한하였으며, 물은 자유롭게 급여하였다. 정상군(Control Group)의 실험동물에는 일반사료(normal diets)를 16주 동안 급여하였다. 고지방사료 급여군(HFD Group)의 실험동물에는 고지방사료(high-fat diets, HFD)를 16주 동안 급여하여 비알코올성 지방간을 유도하였다. 고지방사료(high-fat diets, HFD)는 지방 45%, 탄수화물 35% 및 단백질 20%로 구성되어 있다. 실리마린 급여군(Silymarin Group)의 실험동물에는 8주 동안 고지방사료(high-fat diets, HFD)를 급여하여 비알코올성 지방간을 유도하고 이후 나머지 8주 동안은 고지방사료(high-fat diets, HFD)의 급여와 동시에 실리마린(Silymarin)을 50㎎/㎏ B.W.의 용량으로 1일 1회 경구투여하였다. BNR17 급여군(BNR17 Group)의 실험동물에는 8주 동안 고지방사료(high-fat diets, HFD)를 급여하여 비알코올성 지방간을 유도하고 이후 나머지 8주 동안은 고지방사료(high-fat diets, HFD)의 급여와 동시에 상업적으로 시판되고 있는 항비만 유산균 제품인 BNR17 유산균을 1×109 CFUs/mice의 용량으로 1일 1회 경구투여하였다. MJM60958 생균 급여군(Live MJM60958 Group)의 실험동물에는 8주 동안 고지방사료(high-fat diets, HFD)를 급여하여 비알코올성 지방간을 유도하고 이후 나머지 8주 동안은 고지방사료(high-fat diets, HFD)의 급여와 동시에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 1×109 CFUs/mice의 용량으로 1일 1회 경구투여하였다. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주는 MRS 배지에서 24 hr 동안 배양하고 균체를 회수한 후 PBS로 2번 세척하고 증류수에 현탁하여 매일 신선하게 준비하고 실험동물에 경구투여하였다. MJM60958 사균체 급여군(HK MJM60958 Group)의 실험동물에는 8주 동안 고지방사료(high-fat diets, HFD)를 급여하여 비알코올성 지방간을 유도하고 이후 나머지 8주 동안은 고지방사료(high-fat diets, HFD)의 급여와 동시에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체를 1×109 CFUs/mice의 용량으로 1일 1회 경구투여하였다. 정상군(Control Group) 및 고지방사료 급여군(HFD Group)의 실험동물에는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주 대신 비이클로 사용되는 증류수를 8주 동안 경구투여하였다. 16주 동안의 처리가 경과한 후 실험동물을 3% 이소플루란(isoflurane) 용액으로 마취하고 혈액을 채취하고, 경추 탈구 방식으로 희생시켰다. 희생된 실험동물로부터 간(Liver), 신장(Kidney) 및 부고환 주위 지방(Epidydimal fat) 등을 적출하였다. 필요한 장기를 10% 포르말린으로 고정시키거나 액체질소로 급냉한 후 -80℃의 저온 냉장고에서 보관하면서 향후 분석에 사용하였다.
(4) 체중 및 장기 무게 등의 변화
도 8은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 체중(A), 몸무게 증가량(B), 간 무게(C), 간과 체중의 비율(D), 장간막 무게(E) 및 부고환 주변 지방 무게(F) 분석 결과로 나타낸 것이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에게 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체를 투여한 실험군(HK MJM60958)에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD)에 비해 체중(A), 몸무게 증가량(B), 간 무게(C), 간과 체중의 비율(D), 장간막 무게(E) 및 부고환 주변 지방 무게(F)가 감소하였고, 감소량은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 투여한 MJM60958 생균 급여군(Live MJM60958)과 유사하거나 더 큰 것으로 나타났다.
(5) 혈중 생화학 지표 분석
도 9는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체가 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에 미치는 영향을 혈청 수준에서 ALT(aspartate aminotransferase) 함량(A), AST(aspartate aminotransferase) 함량(B), 중성지방(triglyceride, TG) 함량(C) 및 총콜레스테롤(total cholesterol, TCHO) 함량(D) 분석 결과로 나타낸 것이다. 도 9에서 보이는 바와 같이 고지방식이에 의해 비알코올성 지방간이 유도된 실험동물에게 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주의 사균체를 투여한 실험군(HK MJM60958)에서는 음성 대조군인 고지방사료 급여군(HFD)에 비해 혈액 내 간손상 지표인 ALT 함량, AST 함량 등이 감소하였고, 감소량은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주를 투여한 MJM60668 생균 급여군(Live MJM60958)보다 큰 것으로 나타났다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (13)
- 지방간 개선 효능 및 병원균에 대한 항균 활성을 동시에 가지는 균주로서,
상기 균주는 지방 합성 관련 유전자인 FAS(fatty acid synthase) 및 ACC(acetyl-CoA carboxylase) 유전자의 발현 감소, 지방 대사 관련 유전자인 PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor alpha) 및 CPT1A(carnitine palmitoyltransferase 1a) 유전자의 발현 증가, 지방 합성 관련 단백질인 FAS(fatty acid synthase) 및 SREBP-1(sterol regulatory element-binding protein 1) 단백질의 발현 감소, 또는 지방 대사 관련 단백질인 PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor alpha) 단백질의 발현 증가를 통해 지방간을 개선시키고,
상기 균주는 병원균인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis)에 대해 락터바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG 유산균과 동일하거나 더 높은 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는,
락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP).
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간((non-alcoholic fatty liver)인 것을 특징으로 하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간((non-alcoholic fatty liver)인 것을 특징으로 하는 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)의 사균체를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 상기 지방간은 비알코올성 지방간((non-alcoholic fatty liver)인 것을 특징으로 하는 지방간 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) MJM60958 균주(수탁번호 : KACC 81232BP)의 사균체를 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간((non-alcoholic fatty liver)인 것을 특징으로 하는 지방간 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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