CN112204129A - 植物乳杆菌kbl396菌株及其用途 - Google Patents

植物乳杆菌kbl396菌株及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新型乳酸菌菌株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum KBL396)KCTC13278BP、包含选自由菌株的培养物、菌株的裂解物和菌株的提取物组成的组中的至少一种的组合物、其在食品和药品中的用途。根据本发明的菌株和组合物对改善神经障碍，特别是精神障碍和神经退行性障碍表现出优异的作用，并且在人体中没有副作用的风险，从而发现可以用于改善神经系统障碍。

Description

植物乳杆菌KBL396菌株及其用途
技术领域
本发明涉及一种新型植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396菌株及其用途，更具体地说，涉及一种新型益生菌植物乳杆菌KBL396菌株、包含其活细胞、杀死的细胞、培养物、裂解物或提取物的组合物、以及其用于改善人精神健康的食品和药用用途。
背景技术
益生菌是指具有抗微生物活性和酶促活性以帮助平衡肠道微生物和由微生物产生的产物的微生物。另外，益生菌被定义为以干细胞或发酵产物的形式提供给人或动物以改善肠道菌群的单一或复杂菌株形式的活细胞。益生菌必须具备的特征是，以人的肠道为栖息地，具有非致病性和无毒的特性，并能在进入肠道时存活。此外，它在被递送的食品中在食用之前必须保持生活力和活性，对用于预防感染的抗生素敏感，并且没有抗生素抗性质粒。而且，它必须对肠道环境中的酸、酶和胆汁有抗性。
这些益生菌包括：芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其具有优异的产生消化酶(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、磷酸酶)的能力；乳杆菌属(Lactobacillus sp.)，其能产生乳酸；以及光合细菌，其通过在代谢过程中利用动物粪便中残留的导致臭味的物质(氨、硫化氢、胺等)来防止臭味。近来，由于据报道益生菌可改善各种健康功能，包括改善肠道健康，因此它已作为一种可以代替基于常规化合物的治疗剂的主要治疗剂而备受关注。
作为神经系统疾病，由于现代社会中压力的迅速增加，包括焦虑症、抑郁症、精神分裂症、认知障碍等在内的精神障碍以及神经退行性疾病正在增加，所述神经退行性疾病以与衰老相关并且通常伴随记忆力、运动能力、认知能力和感觉能力中的至少一种的退化或损失的中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统(PNS)的神经元逐渐丧失为特征，并伴有其它神经缺陷。
据报道，精神障碍患者在严重的情况下可能导致自杀事故，特别地，一半以上的抑郁症患者考虑自杀，实际上，已知有10％至15％的患者自杀。抑郁症是一种以意志下降和抑郁为主要症状，并引起多种精神和身体症状并降低了日常功能的疾病，据报道，生活中抑郁症的患病率约有15％至20％。抑郁症的病因尚不清楚，但是众所周知，就像其他精神疾病一样，各种生化、遗传和环境因素都会导致疾病。女性的抑郁症患病率约为10％至25％，男性约为5％至12％，而女性的抑郁症患病率有两倍之高。
如此，抑郁症是当今代表性的高频疾病，而抑郁症是一种同时使身心恶化的疾病，如果不加以治疗，可能会持续数月至数年，并导致人际关系的崩溃或职业性生产力的丧失以及无能感而导致死亡，因此不仅给患者而且对家庭和社会都造成沉重负担。
尽管已经报道了抑郁症的上述的严重程度，但是尚未完全理解抑郁症的原因和抗抑郁药的作用机理。但是一般来说，在学术界众所周知的是，抑郁症是由血清素(5-HT)缺乏引起的，血清素是中枢神经系统突触中的单胺类神经递质(Sodhi MS等人，Int RevNeurobiol 2004，59，111-174)。
当前临床实践中使用的大多数抗抑郁药是增强单胺类神经递质的作用的药物，以及抑制血清素或多巴胺分解的物质，例如抑制神经元中血清素或去甲肾上腺素再吸收的物质(SSRI、SNRI、TCA等)和单胺氧化酶抑制剂。然而，目前，只有约10-25％的韩国抑郁症患者正在接受抗抑郁药治疗，并且由于因副作用等而导致的依从性降低，已知其中约40％的患者会停止治疗，此外，据报道即使服用抗抑郁药也没有反应的无反应者占33％，因此需要开发一种新的更有效的治疗剂。
另外，神经退行性疾病是由于各种原因导致脑功能受损，并且与先前的疾病相比认知功能持续而全面地恶化，从而导致日常生活的重大破坏的症状，并且这种认知损伤具有记忆力、认知力、推理力、判断力和情绪稳定性渐进性丧失的临床特征，逐渐导致精神崩溃并最终导致死亡。
作为这样的疾病的例子，阿尔茨海默病(AD)是老年人中进行性精神功能紊乱(痴呆)的常见原因，并且被认为是美国医疗死亡的第四大主要原因。特别地，阿尔茨海默病与前脑基底部胆碱能神经元的变性有关，所述前脑基底部胆碱能神经元在包括记忆在内的认知行为中起着基本作用(Becker等人，药物开发研究(Drug Development Research)，1988，12，163-195)。此外，全世界各种族和部落都发现了认知障碍和退行性脑障碍，并已成为主要的公共卫生问题。目前，仅在美国，估计这些疾病就影响约200万人至300万人，但是无法使用目前使用的药物进行治疗，而且随着人类寿命的增加，该疾病在世界范围内也在增加，因此，重要的是要在早期阶段加以预防。
在这种背景下，迫切需要开发一种用于神经系统疾病的有效治疗剂。
发明内容
考虑到益生菌的健康增强作用不是属和种的普遍特征，并且对某种菌株具有特异性(FAO/WHO联合工作组起草的食品中益生菌评估指南的报告，2002年，加拿大安大略省伦敦)，为了解决上述问题，本发明人通过筛选各种益生菌菌株，鉴定出对神经系统疾病的改善显示出优异作用的菌株，并完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种新型乳酸菌。
另外，本发明的另一个目的是提供新型乳酸菌的各种食品和药用用途。
为了实现上述目的，本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396(KCTC13278BP)。
本发明还提供了药物组合物，其包含选自由菌株、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
本发明还提供了用于预防或治疗神经系统疾病的药物组合物，其包含选自由菌株、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
本发明还提供了用于预防或改善神经系统疾病的食品组合物，其包含选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
本发明还提供了用于动物饲料的添加剂，其包含选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
本发明还提供了预防或治疗神经系统疾病的方法，该方法包括将选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种以治疗有效量施用至有需要的受试者。
本发明还提供了用于预防或治疗神经系统疾病的组合物，其包含选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
本发明还提供了包含选自由菌株、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种的组合物在制备用于预防或治疗神经系统疾病的药物中的用途。
本发明还提供了用于预防或改善神经系统疾病的食品组合物，其包含选自由菌株、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
附图说明
图1是比较各种乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌株对作为血清素生物合成途径的限速酶的TPH-1的表达的影响(A)，以及确认植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396菌株与商业上可获得的菌株相比对TPH-1的表达的影响的差异结果(B)。
图2是Y-MAZE测试的实验装置的示意图(A)，以及根据Y-MAZE测试测量施用植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)的改变作用功效(alteration action power)的改善的结果(B)。
图3示出了在Y-MAZE测试中确认通过施用植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)使Tph2基因表达增加和血清素(5-HT)浓度增加的结果。
图4是用于通过社会失败引起动物模型的应激的笼子(A)和用于社会回避测试的实验箱的示意图(B)。
图5是在将植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)施用至C57BL/6小鼠时确认改善由社会失败诱导的应激的恢复力的结果。
图6是示出了尾部悬挂实验的方法(A)和通过尾部悬挂实验确认将植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)施用至C57BL/6小鼠时由社会失败诱导的应激的恢复力的结果(B)的示意图。
图7是确认社会回避测试的动物模型的大脑中在施用植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)时炎性细胞因子IL-1β表达的变化的结果。
图8是确认在用于社会回避测试的动物模型中施用植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)时脾脏中CD4/CD8比率变化和CD3+CD4+中FOXP3+CD25细胞变化的结果。
图9是通过对植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)处理冷冻保护剂确认根据冻干的生活力变化的结果。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文使用的术语是本领域熟知的且通常使用的。
在本发明中，比较了来源于人类的各种益生菌菌株的血清素生物合成能力，并证实其中植物乳杆菌KBL396菌株特别显示出对血清素生物合成的优异作用，并且其预防、改善和治疗神经系统疾病的优异作用。另外，作为该菌株的16s rDNA的分析结果，确认该菌株为现有技术中未知的新型菌株。
根据本发明的实施方式，本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396(KCTC13278BP)。
根据本发明的菌株的特征是，该菌株包含由SEQ ID NO:1表示的16s rDNA序列。
<SEQ ID NO:1>
TATCAGTACGTGCTATAATGCAGTCGACGACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGGAGTACGGCCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGGAGCATGTGGGTTTAATTCAAAGCTACGCGAAGAAACCTTACCCAGGTTTTGACATACTAATGCAAATTCTAAAGAGATTAGAACGTTTCCCTTCCGGGGACATGGGATACCGGGTGGGTGCATGGGTTGGTCGTCAGCTTCGTGGTCGTGAGAATGTTTGGGTTTAAGTTCCCCGAAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTAGAACCAGCCGCCTAATGGCACCACCATGCG
根据本发明的菌株的特征为，表现出选自由血清素分泌增加、炎性细胞因子表达抑制、肠内有害细菌减少和抗氧化作用组成的组中的至少一种性质。
另外，根据本发明的菌株可以使用选自由D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、α-甲基-D-甘露糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰基-葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、马栗树皮甙、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松三糖和龙胆二糖组成的组中的至少一种作为碳源。
另外，根据本发明的菌株具有选自由亮氨酸芳基酰胺酶、缬氨酸芳基酰胺酶、α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成的组中的至少一种酶的活性。
根据本发明的植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)表现出对改善神经系统疾病的优异作用，而没有用于神经系统疾病的常规治疗剂的副作用的风险，另外表现出在人体中安全无毒性并且容易获得而没有作为治疗剂的负面认识的优势，因此，其在工业上可能非常有用。
根据本发明的另一种实施方式，本发明提供了一种药物组合物，其包含选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
在本文中，术语“培养物”是指通过在已知培养基中培养乳酸杆菌而获得的产物，并且该产物可以包括乳酸杆菌。培养基可以选自已知的液体培养基或固体培养基，例如，可以是MRS液体培养基、GAM液体培养基、MRS琼脂培养基、GAM琼脂培养基或BL琼脂培养基，但不限于此。在本文中，术语“裂解物”是指通过对乳酸杆菌进行酶处理、均质化或超声处理而破坏的乳酸杆菌。此外，在本文中，术语“提取物”是指通过用已知的提取溶剂提取乳酸杆菌而获得的产物。此外，在本文中，术语“活细胞”是指本发明的新型乳酸杆菌本身，“杀死的细胞”是指通过加热、加压或药物处理等杀灭的乳酸杆菌，
根据本发明的药物组合物在预防或治疗神经系统疾病方面具有优异的作用，并且通过恢复肠道菌群、抗氧化作用、免疫调节作用等表现出作为药物组合物的优异作用。
本发明的药物组合物可以进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂和/或冻干剂。
术语“药学上可接受的”是指生理上可接受的并且当施用于人时通常不会引起严重的胃肠道疾病、头晕、过敏反应或类似反应。
根据本发明的组合物除了新型乳酸杆菌外还可包含至少一种药学上可接受的赋形剂。本发明的组合物中包含的赋形剂可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等，但不限于此。
本发明的组合物可以通过常用方法配制成用于口服施用的制剂或用于肠胃外施用的制剂，当配制时，可以使用常用的填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、冷冻保护剂等来生产。
当将本发明的组合物配制成用于口服施用的固体制剂时，包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，这样的固体制剂除了活性成分以外还可以包含至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶等。另外，除了简单的赋形剂外，它还可以包含润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石等，但不限于此。
当将本发明的组合物配制成用于口服施用的液体制剂时，包括混悬剂、口服液、乳化剂和糖浆剂等，除了常用的简单稀释剂(例如水和液体石蜡)外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂，但不限于此。
当将本发明的组合物配制成用于肠胃外施用的制剂时，可包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳化剂和栓剂。作为非水溶剂和混悬剂，可包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等。作为栓剂的基础化合物，可以使用维比索尔(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、亮叶肉实(laurinum)、甘油明胶等。
作为本发明的药物组合物的有效成分，新型乳酸杆菌等的含量可以根据其具体形式、使用目的以及组合物方面在各种范围内进行调整。在根据本发明的药物组合物中，活性成分的含量没有太大限制，例如，基于组合物的总重量，活性成分的含量可以为0.01至99重量％，具体地为0.1至75重量％，更具体地为0.5至50重量％。
用于本发明的冷冻保护剂用于在冻干过程中保存益生菌制剂并改善保质期。用于本发明的冷冻保护剂可以包含一般的糖。糖可以是单糖、二糖、寡糖或多糖，或者是至少两种或更多种糖的混合物。
例如，可以使用选自由蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、菊粉、甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、2-甲基-2,4-戊二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甘油、脱脂乳、乳蛋白、乳清蛋白、甜菜碱、侧金盏花醇、乳糖或其任何组合组成的组中的冷冻保护剂。
优选地，冷冻保护剂可以包括选自由蔗糖、脱脂乳和山梨糖醇组成的组中的至少一种。更优选地，可以包含蔗糖、脱脂乳和山梨糖醇，具体地，基于组合物的总重量，可包含2至20重量％的蔗糖、2至20重量％的山梨糖醇和5至30重量％的脱脂牛奶。通过添加冷冻保护剂，冻干的乳酸杆菌可以显示出显著提高的生活力、储存稳定性、抗酸性和抗胆汁性。
另外，向根据本发明的冻干组合物中添加抗氧化剂(例如核黄素、磷酸核黄素或其生理学上可接受的盐、谷胱甘肽、抗坏血酸盐、谷胱甘肽和半胱氨酸)可以进一步提高菌株在储存过程中的生活力。
根据本发明的另一种实施方式，本发明提供了用于预防或治疗神经系统疾病的药物组合物，其包含选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
在本文中，术语“预防”是指通过施用本发明的药物组合物来抑制神经系统疾病的症状或延迟进展的所有行动。
在本文中，术语“治疗”是指通过施用本发明的药物组合物来改善或有益地改变神经系统疾病症状的所有行动。
本文中，“神经系统疾病”包括来源于神经系统病理的所有病理状况。因此，本发明的目的是预防或治疗与神经、神经精神病学、精神病学、神经病和神经退变有关的急性和/或慢性疾病。
这种神经系统疾病可能是精神疾病或神经退行性疾病。
精神障碍的非限制性实例可以包括应激引起的紧张、焦虑、抑郁、情感障碍、失眠、妄想性障碍、强迫症、偏头痛、记忆障碍、认知障碍、注意力障碍等。此外，神经退行性疾病的非限制性实例包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓小脑萎缩症、图雷特氏综合征、弗里德里希共济失调症、马查多-约瑟夫病、痴呆、肌张力障碍、进行性核上性麻痹等。
根据本发明的用于预防或治疗神经系统疾病的药物组合物对改善神经系统疾病表现出优异作用，而没有神经系统疾病的常规治疗剂的副作用的风险，另外表现出在人体中无毒性、安全并且容易获得而没有作为治疗剂的负面认知的优势，因此，其在工业上可能非常有用。根据本发明的一种实施方式，本发明的组合物通过诱导血清素的生物合成而具有预防、改善和治疗神经系统疾病的作用。根据本发明的另一种实施方式，本发明的组合物对认知能力的改善表现出优异的作用。根据本发明的其他实施方式，本发明的组合物对改善在应激环境下的症状(例如紧张、抑郁、焦虑等)表现出优异的作用。根据本发明的其他实施方式，本发明的组合物通过调节神经系统的炎性反应在预防、治疗和改善神经系统疾病方面表现出优异的作用。根据本发明的其他实施方式，本发明的组合物通过调节炎性反应在预防、改善和治疗神经系统疾病方面显示出优异的作用。根据本发明的其他实施方式，本发明的组合物通过调节由于免疫失衡导致的神经和脑的炎性反应在预防、改善和治疗神经系统疾病方面显示出优异的作用。
根据本发明的药物组合物的剂量应为药学有效量。“药学有效量”是指以适用于医学治疗的合理的受益/风险比，足以预防或治疗神经系统疾病的量。有效剂量水平可以由本领域技术人员根据诸如配制方法、患者的状况和体重、患者的性别、年龄、疾病程度、药物形式、施用途径和时期、排泄率、反应敏感性等因素来选择。如本领域技术人员所认识的，可以根据治疗途径、赋形剂的使用以及能够与其他药物一起使用的可能性来改变有效剂量。但是，为了获得更好的作用，在口服施用制剂的情况下，本发明的药物组合物可以以每天0.001至1000mg/kg，优选0.01至100mg/kg的量施用至成人。
当如上施用施用制剂时，本发明的植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)可以以每天1×103CFU/kg至1×1011CFU/kg的量施用。施用可以每天进行一次，也可以分数次进行。该剂量无意在任何方面限制本发明的范围。
本发明的药物组合物可以通过各种途径施用至哺乳动物，包括小鼠、家畜、人等。具体地，本发明的药物组合物可以口服或肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内施加或注射)，但是口服施用是优选的。用于口服施用的固体制剂可以包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂等。
本发明的药物组合物可以作为肠溶衣包衣的肠溶制剂的形式提供，特别是作为口服单位制剂的形式提供。本文中，“肠溶衣”包括已知的所有种类的药学上可接受的包衣，所述包衣不会被胃酸分解，因此得以保留，但是在小肠中被充分分解，并使活性成分释放到小肠中。本发明的“肠溶衣”是指在36℃至38℃下与人工胃液(例如pH 1的HCl溶液)接触时保持原样2小时以上，优选地，之后在人工肠液(例如pH 6.8的KH2PO4缓冲溶液)中则在30分钟内分解的包衣。
本发明的肠溶衣的包衣量为每1个芯约16至30mg，优选16至20mg或25mg。当本发明的肠溶衣的厚度为5至100μm，优选为20至80μm时，显示出令人满意的结果。肠溶衣的材料适当地选自已知的聚合物物质。在许多文献(L.Lachman等人，工业药学的理论与实践(TheTheory and Practice of Industrial Pharmacy)，第三版，1986，pp.365-373；H.Sucker等人，制药技术(Pharmazeutische Technologie)，Thieme，1991，355-359；黑格斯制药实践手册(Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis)，第4版，第7卷，739-742和766-778(SpringerVerlag，1971年)；和雷明顿药学科学(Remington's PharmaceuticalSciences)，第13版，1689-1691(Mack Publ.，Co.，1970)中列出了适当的聚合物物质，可包括纤维素酯衍生物、纤维素醚、丙烯酸树脂的丙烯酸甲酯共聚物以及马来酸和邻苯二甲酸衍生物的共聚物。
本发明的肠溶衣可以使用将肠溶衣溶液喷涂到芯上的普通肠溶衣方法来制备。作为用于肠溶衣过程的合适溶剂，可以使用醇类如乙醇、酮类如丙酮、卤代烃类溶剂如二氯甲烷(CH2Cl2)，以及这些溶剂的混合溶剂。将软化剂(例如邻苯二甲酸二正丁酯或三乙酸甘油酯)以1比约0.05至约0.3的比例(包衣材料比软化剂)添加至包衣溶液中。它适合连续进行喷涂过程，并且可以根据包衣条件调节喷涂量。喷涂压力可以进行各种调节，并且通常，通过约1至约1.5巴的喷涂压力可以获得令人满意的结果。
口服液制剂是混悬剂、口服液、乳化剂、糖浆剂、气雾剂等，并且除了常用的简单稀释剂、水和液体石蜡以外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。作为肠胃外施用的制剂，可以通过配制为以外用液体和无菌注射剂的形式使用，例如无菌水溶液、液体、非水溶剂、混悬剂、乳剂、滴眼剂、眼药膏、糖浆剂、栓剂、气雾剂。根据通常使用的方法进行灭菌。取决于临床处方，用于局部施用的制剂可以是无水的或水性的。作为非水溶剂和混悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等。
根据本发明的用于预防或治疗神经系统疾病的药物组合物可以进一步包含已知的具有预防或治疗神经系统疾病的作用的活性成分中的至少一种。
根据本发明的另一种实施方式，本发明提供了用于预防或改善神经系统疾病的食品组合物，其包含选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
根据本发明的食品组合物的特征为用于食品或食品添加剂的组合物，但不限于此，并且可以容易地用作对神经系统疾病的预防或改善有作用的食品，例如食品的主要成分、补充成分、食品添加剂、保健功能性食品或功能性饮料。
食品是指天然产品或含有一种或多种营养素的加工产品，优选是指经过一些加工后即可直接食用的产品，通常含义上，包括所有食品、食品添加剂、保健功能性食品和功能性饮料。
要添加到根据本发明的食品组合物中的食品包括例如各种食品、饮料、口香糖、茶、维生素复合物、功能性食品等。此外，本发明的食品包括特殊营养食品(例如配方食品、婴幼儿食品等)、加工肉制品、鱼产品、豆腐、果冻食品、面条(例如拉面、面条等)、面包、保健补充食品、调味料(例如酱油、大豆酱、红辣椒酱、混合酱等)、调味酱、甜食(例如零食)、糖果、巧克力、口香糖、冰淇淋、乳制品(例如发酵乳、奶酪等)、其他加工食品、泡菜、腌制食品(各种泡菜、腌制蔬菜等)、饮料(例如水果饮料、蔬菜饮料、豆奶制品、发酵饮料等)和天然调味品(例如拉面汤等)、但不限于此。食品、饮料或食品添加剂可以通过常规的制备方法来制备。
保健功能性食品是指通过物理、生化或生物技术方法等为特定目的提供附加值以发挥和表达相应食品功能的一组食品，或食品组成经设计和加工以充分表达与生物防御节律控制、疾病预防和恢复等有关的身体控制功能的食品。功能食品可以包含食品可接受的食品补充添加剂，并且可以进一步包含在功能食品的制造中通常使用的适当的载体、赋形剂和稀释剂。
本文中，功能性饮料是指为缓解口渴或享受口感而饮用的总称，除了作为必要组分以指定的比例包含用于改善或预防神经系统疾病的症状的组合物以外，对其他成分没有特别限制，作为普通饮料，它可以包含各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加组分。
此外，除了上述食品之外，包含本发明的用于改善或预防神经系统疾病的症状的食品组合物的食品可以包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸盐及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、用于碳酸饮料的碳酸化剂等，所述组分可以单独使用或组合使用。
在含有本发明的食品组合物的食品中，根据本发明的组合物的量可以为占全部食品重量的0.001重量％至100重量％，优选为1重量％至99重量％，在饮料的情况下，基于100ml，则其含量可以为0.001g至10g，优选0.01g至1g的比例，但对于出于健康和卫生目的或健康控制的长期摄入，量可以小于所述范围，而由于活性成分在安全性方面没有问题，所以可以以超过该范围的量使用，因此不限于该范围。
本发明的食品组合物可以进一步包含赋形剂和/或冻干剂中的至少一种。
本发明的食品组合物可以以适于将植物乳杆菌KBL396菌株独立地或以可接受的载体或被人或动物摄取的组合物添加的组合物形式制备。换句话说，可以通过将它添加到不包含其他益生菌的食品和已经包含各种益生菌的食品中来使用。例如，在制备本发明的食品时，与本发明的菌株一起使用的其他微生物没有特别限制，只要它们适合被人或动物摄取并且被摄取时具有可以抑制有害的致病性细菌或改善哺乳动物肠道中微生物平衡的益生菌活性即可。作为这些益生菌微生物的实例，有酵母菌，包括酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和球拟酵母属(Torulopsis)；霉菌，例如曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、青霉菌属(Penicillium)；细菌，属于乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)等。合适的益生菌微生物的具体实例包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、消化乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruckii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸片球菌(Lactococcus lactis)等。优选地，通过在本发明的用于食品的组合物中另外包含具有优异的益生菌活性且同时具有改善神经系统疾病的优异作用的益生菌微生物混合细菌，可以进一步增强作用。在本发明的用于食品的组合物中使用的载体的实例可以包括填充剂、高纤维添加剂、包囊剂、脂质等，并且载体的实例在本领域中是充分已知的。本发明的植物乳杆菌KBL396可以是冻干或胶囊化形式或培养混悬剂或干燥粉末的形式。
根据本发明的其他实施方式，本发明提供了用于动物饲料的添加剂，其包含选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
本发明的用于动物饲料的添加剂可以进一步包含赋形剂和/或冻干剂中的至少一种。
本发明的用于动物饲料的添加剂可以是干燥的或液体制剂的形式，并且除了植物乳杆菌KBL396菌株外还可以包含其他非致病性微生物。作为要添加的微生物，例如，可以使用诸如能够产生蛋白酶、脂肪酶和碳酸酯转化酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的枯草杆菌、在诸如牛胃的厌氧条件下具有生理活性和有机物分解能力的乳杆菌属(Lactobacillus)菌株、诸如显示出增加牲畜体重、增加产奶量和提高饲料消化率的作用的米曲霉(Aspergillus oryzae)的丝状真菌(Slyter,L.L.J.Animal Sci.1976,43.910-926)和诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母菌(Johnson,D.E等人J.Anim.Sci.,1983,56,735-739；Williams,P.E.V.等人,1990,211)等。
除了植物乳杆菌KBL396以外，本发明的用于动物饲料的添加剂可进一步包含至少一种酶制剂。要添加的酶制剂可能为干燥或液态状态，作为酶制剂，可以使用脂解酶(例如脂肪酶)、通过分解植酸产生磷酸盐和肌醇磷酸盐的植酸酶、水解淀粉和糖原等中包含的α-1,4-糖苷键的酶即淀粉酶、水解有机磷酸酯的酶即磷酸酶、分解纤维素的羧甲基纤维素酶、分解木糖的木糖酶、将麦芽糖分解成两个分子的葡萄糖的麦芽糖酶以及诸如通过水解蔗糖来产生葡萄糖-果糖混合物的转化酶的生糖原酶等。
当本发明的植物乳杆菌KBL396菌株用作动物饲料的添加剂时，作为饲料的原料，除了各种谷物和大豆蛋白外，还可以使用花生、豌豆、甜菜、果肉、谷物副产品、动物内脏粉末和鱼粉等，并且可以使用未加工的或加工的那些而没有限制。加工过程不必限于此，例如，在填充饲料原料的同时在压力下压缩至特定出口的过程，并且在蛋白质的情况下，优选使用挤出，这使蛋白质变性并提高利用率。挤出具有通过热处理过程等使蛋白质变性和破坏抗酶因子的优点。另外，在大豆蛋白的情况下，通过挤出可以提高蛋白的消化率，并且可以使诸如作为大豆中存在的蛋白酶抑制剂之一的胰蛋白酶抑制剂的抗营养因子失活，可以提高蛋白酶对消化率的增强作用，并且可以提高大豆蛋白的营养价值。
在本发明的其他实施方式中，本发明提供了一种预防或治疗神经系统疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种施用至有需要的受试者。
在本文中，术语“治疗有效量(或有效剂量)”是指非常足以产生优选作用，但恰能防止在医学判断范围内的严重副作用的合适量。考虑到施用途径和施用受试者，可以适当地调节要通过本发明的组合物向体内施用的微生物的量。
“施用”是指通过任何适当的方法提供本发明的处方药物组合物。然后，受试者是指动物，并且通常可以是可以通过使用本发明的新型乳酸杆菌进行治疗而显示出有益作用的哺乳动物。作为受试者的优选实例，可以包括诸如人类的灵长类动物。另外，这样的受试者可以包括具有过敏性疾病的症状或有过敏性疾病风险的所有受试者。
在本发明的其他实施方式中，本发明提供了用于预防或治疗神经系统疾病的组合物，其包含选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种。
本发明的其他实施方式提供了包含选自由植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、菌株培养物、菌株裂解物和菌株提取物组成的组中的至少一种的组合物在制备用于预防或治疗神经系统疾病的药物中的用途。
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，并且对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1.筛选具有诱导血清素生物合成能力的益生菌菌株
在许多先前的文献中，已经报道了血清素在神经系统疾病，特别是精神障碍中起重要作用。使用从婴儿和成人粪便中分离出的47种益生菌菌株(19种为乳杆菌属(Lactobacillus spp.)，28种为双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.))和2种作为益生菌产品出售的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，评估了诱导血清素生物合成的能力。通过将每种菌株处理至肠嗜铬细胞系RIN14B，并观察血清素生物合成途径的限速酶TPH-1(色氨酸羟化酶-1)基因的表达提升多少，确认诱导血清素生物合成的能力。
1-1.菌株的培养和培养上清液的制备
为了筛选对神经系统疾病显示有效的新型菌株，使用了从健康的韩国男性和女性成人或婴儿的粪便中分离出的47种候选乳酸菌。将这些候选乳酸菌分别在添加有0.5％半胱氨酸的MRS培养基中培养，并通过每隔24小时传代培养两次而被活化，然后将包含每种菌株的代谢物的培养上清液用于实验。获得培养上清液后，将通过离心(13,000×g，5分钟，4℃)获得的上清液的pH值校准至7.0，然后使用孔径为0.22μm的过滤器灭菌，并在使用前在4℃下保存。
用于筛选新型菌株的乳酸菌菌株分别被命名为KBL346、KBL642、KBL342、KBL649、KBL351、KBL633、KBL663、KBL621、KBL647、KBL640、KBL646、KBL639、KBL402、KBL600、KBL591、KBL538、KBL501、KBL652、KBL662、KBL389、KBL613、KBL544、KBL391、KBL395、KBL648、KBL497、KBL384、KBL354、KBL500、KBL362、KBL612、KBL664、KBL397、KBL545、KBL363、KBL374、KBL375、KBL385、KBL665、KBL481、KBL381、KBL605、KBL383、KBL624、KBL585、KBL365或KBL39。在所述菌株中，19种菌株KBL346、KBL342、KBL351、KBL402、KBL389、KBL391、KBL395、KBL384、KBL354、KBL362、KBL397、KBL363、KBL374、KBL375、KBL385、KBL381、KBL383、KBL365和KBL396被确认为乳杆菌属(Lactobacillus spp.)菌株，28种菌株KBL642、KBL649、KBL633、KBL663、KBL621、KBL647、KBL640、KBL646、KBL639、KBL600、KBL591、KBL538、KBL501、KBL652、KBL662、KBL613、KBL544、KBL648、KBL497、KBL500、KBL612、KBL664、KBL545、KBL665、KBL481、KBL605、KBL624和KBL585被确认为双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)菌株。
另外，作为商业上可获得的产品，分别购买了由植物乳杆菌PS128单菌株产品组成的Solace(Oryx Biomedical公司，弗里蒙特，CA，美国)和由植物乳杆菌299v单菌株产品组成的植物乳杆菌(L.plantarum)(Quest Vitamins Limited公司,金斯敦,赫里福德,英国)。通过与候选乳酸菌相同过程的培养和活化过程获得每种菌株的培养上清液以用于实验。
1-2.RIN14B细胞系的培养
将RIN14B(ATCC CRL-2059)细胞在添加了10％FBS、青霉素(100μg/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640培养基中在37℃和5％CO2的条件下培养，每3天传代一次。将RIN14B细胞系在24孔板中以4×105个细胞/孔等分，然后处理细菌培养上清液。
1-3.菌株培养上清液的处理
从在实施例1-2的24孔板中等分的RIN14B细胞系中去除培养基后，用PBS(500μl/孔)洗涤一次。然后，将产物用500μl实施例1-1中制备的菌株培养上清液或500μl具有诱导血清素合成能力的稀释的脱氧胆酸盐作为阳性对照组进行处理，所述稀释的脱氧胆酸盐被校准至pH为7.0并在过滤器灭菌的MRS培养基中稀释至终浓度为25μM。在37℃和5％CO2的条件下培养1小时后，收集细胞和上清液以测量TPH1(色氨酸羟化酶-1)酶的表达。
1-4.根据qRT-PCR方法测量Tph 1表达
为了测量Tph1(色氨酸羟化酶-1)的表达水平，根据制造商的方法，使用Easy-spin总RNA提取试剂盒(Intron公司)提取实施例1-3中获得的细胞的RNA。使用高容量RNA-到-cDNATM试剂盒，根据制造商的方法从提取的RNA中合成cDNA后，在Rotor-Gene Q(QIAGEN公司)上使用Rotorgene SYBR Green PCR试剂盒或在Quantstudio 5(Thermofisher公司)上使用Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems公司)进行qRT-PCR(定量实时聚合酶链式反应)。
Tph1表达量计算为使用Tph-1 F和Tph-1 R引物或Tph-1A F和Tph-1A R引物的测量值与大鼠B-肌动蛋白F和大鼠B-肌动蛋白R引物测量的β-肌动蛋白测量值相比的相对表达的差异，如表1所示(ΔΔCT分析)。用于qRT-PCR的引物和温度条件分别总结在下表1和表2中。
[表1]
引物 序列
Tph-1F ggctttgaggtcctctttcca(SEQ ID NO:2)
Tph-1R ccccctttctgaggaatggtc(SEQ ID NO:3)
Tph-1A F accctgggatgtgcttcatg(SEQ ID NO:4)
Tph-1A R gcgttctgcaaagcaacaga(SEQ ID NO:5)
大鼠B-肌动蛋白F cagccttccttcctgggtatg(SEQ ID NO:6)
大鼠B-肌动蛋白R tagagccaccaatccacacag(SEQ ID NO:7)
[表2]
Figure BDA0002611918790000181
在上述条件下进行的实验结果示于图1中。
如图1A所示(使用Rotorgene SYBR Green PCR试剂盒、Tph-1 F和Tph1R引物通过Rotor-Gene Q(QIAGEN公司)分析)，KBL396菌株处理组的Tph1表达最大为其他菌株处理组和25μM脱氧胆酸盐处理组的2至4倍。
另外，与商业上可获得的植物乳杆菌菌株相比的结果示于图1B(使用Tph-1A F和Tph-1A R引物通过Quantstudio 5(Thermofisher公司)用Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems公司)分析)中。如图1B所示，可以确认的是，本发明的菌株，即KBL396菌株具有优异的诱导Tph1表达的能力(Q1，植物乳杆菌299v；S1，植物乳杆菌PS128)。
通过以上结果，确认了从正常韩国成年女性的粪便中分离并且得到了捐赠者的同意和三星首尔医院临床研究(IRB 144-2011-07-11)的批准下收集的菌株，即KBL396菌株。
实施例2.包含KBL396菌株的饲料的制备和动物模型的饲料施用
通过实施例1确认了KBL396菌株对体外血清素生物合成具有优异的作用，为了确认KBL396菌株对体内的神经系统疾病是否具有优异的作用，通过临床前实验使用动物模型进行实验。为此，制备了包含KBL396菌株的饲料，并在动物模型中施用。
2-1.饲料的制备
由于经口强司法对实验动物造成很大的应激，并且这种应激可能影响实验结果的客观性(偏差)，因此计划了以通过混合菌株制备的饲料形式施用于动物模型的实验。
通过以下方法制备用于菌株施用的饲料。通过在MRS培养基中培养24小时来激活KBL396菌株，并通过在新的MRS培养基中接种1％来传代培养24小时。然后，将细胞培养物在6000rpm和4℃下离心20分钟，然后弃去上清液，并用4℃的1×PBS重悬沉淀物。然后，添加1×PBS超过培养上清液体积的50％，以充分释放。之后，在与上述相同的条件下离心，并重复洗涤两次，然后将沉淀物用1×PBS重悬(细菌浓缩物)。
将经过辐射灭菌的饲料粉碎成粉末状，与上述制备的‘细菌浓缩物’混合，等分成合适大小的小球，然后在-80℃下冷冻24小时。然后，将冷冻的饲料-细菌混合物冻干48至72小时，并在使用前保存在-80℃下。冻干饲料(‘含KBL396的饲料’)中所含KBL396菌株的量约为1×109CFU/g，对照组(‘含PBS的饲料’)以与通过混合菌株制备饲料相同的方法，通过混合与‘细菌浓缩物’相同重量的PBS来制备，并在保存-80℃下。
2-2.饲料施用
制备后将‘含PBS的饲料’和‘含KBL396菌株的饲料’保存在-80℃下，每天取出并在每天上午9点提供，每只C57BL/6小鼠供给3至5g饲料(根据周龄增加量)。当供给饲料时，收集剩余的饲料并计算饲料摄入量和菌株摄入量。观察动物模型，同时施用饲料28天或更长时间。
实施例3.通过施用KBL396菌株改善认知能力的作用(Y-迷宫(MAZE)实验)
在施用菌株28天后，通过进行Y-迷宫实验来测试由KBL396处理引起的认知能力改善的作用。用于本发明的动物模型是7周龄的C57BL/6小鼠，并且在PBS对照组和KBL396处理组中分别使用8只小鼠进行实验。
Y-迷宫实验是设计用于使用动物模型判断认知能力的行为实验。在实验中，Y迷宫的三个臂以120°角相互连接，每个臂分别命名为A、B和C，将实验动物放在一个臂中并允许自由移动8分钟，然后使用安装在天花板上的摄像头和与其连接的计算机程序观察并记录进入每个臂的次数和顺序。然后，当尾巴完全进入时，记录进入每个臂的次数和顺序，还记录了重新进入同一臂的情况。当按顺序(实际变化)，即按ABC、CAB、BAC等的顺序，进入3个彼此不同的臂时，给出1分，并通过以下公式计算变化行为百分比。
变化行为百分比＝实际变化/最大变化×100(最大变化：进入总次数-2)
结果示于图2。如图2所示，可以证实，与使用PBS对照的动物模型相比，在使用KBL396的动物模型中显示出改善认知能力的显著高的效果。
实施例4.通过KBL396菌株施用增加脑中血清素的作用
测试了KBL396菌株的施用是否可以增加脑中的血清素。
首先，脑组织血清素生物合成途径的限速酶TPH-2(色氨酸羟化酶2)的量由该酶的mRNA量确定。通过与实施例1-4相同的方法提取实施例3的动物模型中获得的脑组织中的RNA来合成cDNA。在合成的cDNA中，使用Rotor-Gene Q(QIAGEN公司)、Rotorgene SYBRGreen PCR试剂盒和以下TPH-2f、TPH-2r引物，确认了Tph2的表达水平。其他实验条件和通过与Gapdh基因表达比较的结果的分析与实施例1-4相同。
TPH-2f:5’CAGTCCACGAAGATTTCGACTT 3’(SEQ ID NO:8)
TPH-2r:5’GCAAGACAGCGGTAGTGTTCT 3’(SEQ ID NO:9)
在上述条件下进行的实验结果示于图3A中。通过测试施用KBL396的动物模型(KBL396)比施用PBS的动物模型(PBS)中Tph2基因表达显著更高，确认了血清素的生物合成得到促进。
接下来，为了直接测量脑组织中血清素的浓度，进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)。将5mm不锈钢珠(Qiagen公司)和T-PERTM组织蛋白提取试剂(Sigma公司)添加到在实施例3的动物模型中获得的脑组织中，并在30hz 10分钟的条件下使用Tissue lyser II(Qiagen公司)裂解组织。通过用溶解的混合物(4℃，11,000×g，15分钟)进行离心，获得水层的中间层，并在用于分析之前保存在-80℃下(‘水性样品’)。为了测量‘水性样品’中血清素的量，通过使用血清素超灵敏ELISA分析试剂盒(Eagle biosciences公司)根据制造商的方法制备样品，使用Spark 10M酶标仪(Tecan公司)对样品进行分析。
图3B示出了测量的血清素(5-HT)的分析结果。通过确认与施用PBS对照组的动物模型(PBS)相比，施用KBL396的动物模型(KBL396)中测得的血清素(5-HT)浓度为两倍多，从而证实了KBL396菌株实际上增加了大脑中血清素的浓度。
实施例5.根据KBL396菌株施用改善应激恢复力的作用(社会回避测试)
社会回避测试是一项使用动物模型评估对应激的作用的行为实验。在本发明中，为了证实KBL396菌株对增强应激暴露抗性的作用，在诱导对小鼠的应激后，进行了根据KBL396菌株施用的社会回避实验。
首先，用于本发明的动物模型是7周龄的C57BL/6小鼠，并且在PBS对照组、PBS+应激诱导组、KBL396菌株处理组、KBL396菌株+应激诱导组四组中进行实验，每组8只小鼠。
施用‘含PBS的饲料’或‘含KBL396的饲料’，总共持续4周(28天)，并使小鼠暴露于应激。即使在暴露于应激的7天期间，也连续提供‘含PBS的饲料’或‘含KBL396的饲料’作为饲料。
图4是用于通过社会失败在动物模型中引起应激的笼子(A)和用于社会回避测试的实验箱(B)的示意图。为了对小鼠诱导应激，使C57BL/6小鼠与CD-1小鼠生活在具有透明边界壁的同一笼中，该透明边界壁由丙烯酸板制成，中间有一个孔。在7天的时间期间，将C57BL/6小鼠每天移动一次，使其与攻击性CD-1小鼠共居，并让其遭受CD-1小鼠的身体攻击(社会失败应激)。总共攻击5分钟后，将C57BL/6小鼠在其中新的CD-1小鼠在对侧的具有透明边界壁的笼子中放置24小时。由于C57BL/6小鼠暴露于CD-1小鼠的威胁下24小时并不断识别出侵略性CD-1小鼠的存在，C57BL/6小鼠在社会失败期间不仅要承受身体应激，还要承受精神应激。
然后，为了评估由应激暴露引起的行为改变，进行了社会回避测试。社会回避测试由在同一行为实验箱中进行的两组实验组成。在第一组中，将C57BL/6小鼠放在盒子中间使其自由移动3分钟。在第二组中，将CD-1小鼠放在可移动围墙中，并放在行为实验箱一侧的中间，然后观察C57BL/6小鼠的行为3分钟。然后，暴露于社会失败应激的C57BL/6小鼠在确认CD-1小鼠的存在时表现出逃逸到角落区域并保持静止的行为状态，测量C57BL/6小鼠停留在角落区域的时间以确定社会回避的程度。
结果示于图5中。从图5中可以看出，可以证实当在施用了本发明的KBL396的小鼠(KBL396+STR)中诱发社会攻击应激时，社会回避的程度显著改善。
实施例6.通过KBL396菌株施用改善抑郁症的作用(尾部悬挂测试)
实施例5中遭受社会攻击应激的C57BL/6小鼠表现出抑郁样行为，这是抑郁症研究领域的熟知的小鼠模型。在本发明中，为了确认通过施用KBL396而减轻抑郁的作用，对受到社会攻击应激的C57BL/6小鼠进行了尾部悬挂测试。
类似于实施例5的方法，进行KBL396的施用和通过应激暴露的抑郁症诱导，并且在接受社会攻击应激期间，同样地施用KBL396。
在一个分离的区域中，将遭受社会攻击应激的C57BL/6小鼠的尾巴用胶带粘在天花板上，胶带从尾巴末端约1cm处粘住，并在6分钟的总实验时间中的后4分钟内测量其静止时间。静止状态是指从悬挂状态开始的任何运动完全停止的状态。
尾部悬挂测试的结果示于图6中。如图6所示，可以确认，与诱导抑郁症的对照组(PBS+STR)相比，在施用KBL396的组(KBL396+STR)中，抑郁症表型恢复到与正常对照组相同水平，尽管其暴露于同样的应激。
从以上结果可以看出，KBL396菌株的施用具有改善认知能力的作用以及预防和治疗由应激引起的抑郁症的作用。
实施例7.根据KBL396菌株施用调节脑的炎性反应的作用
为了确认根据KBL396菌株施用调节脑的炎性反应的作用，通过提取在实施例5的动物模型中获得的脑组织的总蛋白并进行ELISA来确认炎性细胞因子IL-1β的量。通过与实施例4相同的方法，在实施例5的动物模型的脑组织中，获得了‘水性样品’。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce公司，美国)，根据制造商的方法测量‘水性样品’中的蛋白质浓度。为了测量IL-1β的量，根据制造商的方法使用小鼠IL-1βELISA试剂盒(Sigma Aldrich公司)制备样品，并通过与实施例4相同的方法进行分析。
测定的IL-1β的分析结果示于图7中。与正常小鼠(PBS)的脑相比，诱导抑郁症的小鼠(PBS+STR)的脑中炎性细胞因子之一IL-1β的浓度增加，但是在KBL396施用组(KBL396和KBL396+STR)的脑中，IL-1β的浓度维持在与正常对照组相似的水平，而与应激暴露无关。
实施例8.通过KBL396菌株施用调节应激诱导的免疫失衡的作用
认识到CD4+T细胞和CD8+T细胞分别有助于抗炎和促进炎症，而CD4/CD8 T细胞比率(即它们的相对比率)的降低导致抗炎性降低和免疫失衡，例如免疫衰老。此外，调节性T细胞(Treg)负责免疫调节，以防止免疫系统过度反应。当如上所述引起由T细胞调节的免疫失衡时，显示出炎性反应，特别是神经和脑中的炎性反应极有可能引起退行性脑疾病，例如痴呆和抑郁症等。为了证实KBL396处理如何影响参与免疫调节的T细胞，对实施例5的小鼠的脾脏组织和肠系膜淋巴结细胞进行了流式细胞术(荧光活化细胞分选，FACS)。
处死时，将组织存放于在冰上的含有10％灭活的FBS的RPMI1640培养基中。为了防止细胞损失，在处死后立即取样组织，然后通过70μm细胞过滤器过滤以获得单个细胞，然后用台盼蓝染色并计数活细胞的数目。然后，将约1×107个细胞移至96孔，并附着靶向每种免疫标记的荧光抗体。本文使用的免疫标志物是缀合FITC的抗小鼠CD3、缀合PerCP-Cy5.5的抗小鼠CD4、缀合PE的抗小鼠CD8、缀合PE的抗小鼠FOXP3、缀合APC的抗小鼠CD25单克隆抗体(均来自eBioscience公司)。然后，通过BD FACSVerseTM(BD bioscience公司)进行流式细胞术，并使用Flowjo软件(BD bioscience公司)鉴定免疫细胞。
流式细胞仪结果示于图8中。暴露于应激的小鼠(PBS+STR)易于发炎，因为与正常小鼠(PBS)相比，脾组织的CD4/CD8 T细胞比率降低，但是当施用KBL396细胞时(KBL396+STR)，该比率显著恢复(图8A)。此外，根据应激暴露(PBS+STR)，肠系膜淋巴结的Treg细胞的量也减少了，但是当施用KBL396细胞(KBL396+STR)时，它们的恢复与未受应激的小鼠相似(图8B)。因此，证实了通过施用KBL396可以减轻由应激暴露引起的免疫失衡。
实施例9.确认KBL396菌株的碳源可利用性和酶活性
使用API试剂盒(型号名称：API 50CHL；制造商：BioMerieux's公司，美国)通过糖发酵测试分析了植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)的生理特性即碳源可利用性，结果示于下表3中。在下表3中，“+”表示碳源可利用性为正的情况。
另外，使用API试剂盒(型号名称：API-ZYM CHL；制造商：BioMerieux's公司，美国)通过酶活性实验分析了植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)的生理特性之一即酶活性，结果示于下表4中。在下表4中，“+”表示存在酶活性的情况。
[表3]
Figure BDA0002611918790000241
[表4]
Figure BDA0002611918790000251
实施例10.KBL396菌株的配制
在通过离心收获从发酵罐操作中获得的KBL396菌株之后，丢弃剩余的培养基上清液，并用1×PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤以除去培养基的残余物。作为用于冷冻保护剂(CPA)的稳定制剂，将菌株用脱脂牛奶、蔗糖和山梨糖醇处理(基于制剂的总重量，脱脂牛奶11％+蔗糖4.29％+山梨糖醇5.69％)，并处理1×PBS作为阴性对照组进行冻干。将通过离心收获的菌株浓缩至去除上清液的20倍，并处理冷冻保护剂(CPA)，在-80℃下冷冻过夜24小时后，对于完整的菌株，进行两次细磨，并测定其生活力。根据冷冻前和冻干后的CFU计数结果计算冻干的生活力。
结果，如图9所示，虽然处理1×PBS显示出25.8％的生活力，但处理CPA时显示出95％的生活力，因此可以确认根据冻干的生活力确定增加的作用。
植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)的保藏信息
本发明的发明人于2017年5月29日将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396(KCTC13278BP)保藏于韩国典型培养物保藏中心(认可的保藏机构)(地址：韩国生命工学研究院，韩国56212全罗北道井邑市Ipsin-gil181)，且收到的保藏编号为KCTC13278BP。
如上所述，已经通过以上实施例描述了本发明，但是本发明不必限于此，并且可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下进行各种修改。因此，本发明的范围应解释为包括落入本发明所附权利要求书范围内的所有实施方式。
工业实用性
根据本发明的植物乳杆菌KBL396(KCTC13278BP)、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物表现出对改善神经系统疾病的优异作用，而没有用于神经系统疾病的常规治疗剂的副作用的风险，另外表现出在人体中安全无毒性并且容易获得而没有作为治疗剂的负面认识的优势，因此，其在工业上可能非常有用。
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
国际表格
依据细则第7.1条发出的原保藏证明
大韩民国08826首尔，冠岳区，冠岳路1，首尔大学，高光杓
Figure BDA0002611918790000271
*上述翻译文本与原文没有相违之处。代理师Lee,Cheo Young
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
国际表格
依据8.2条的国际标准的科学描述和/或建议的分类学命名的事后说明或修改有关证明
大韩民国08826首尔，冠岳区，冠岳路1，首尔大学，高光杓
Figure BDA0002611918790000281
附件：依据8.1条的科学描述和建议的分类学命名的事后说明或修改的文件*上述翻译文本与原文没有相违之处。代理师Lee,Cheo Young
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
国际表格
依据10.2条的国际标准的存活证明
大韩民国08826首尔，冠岳区，冠岳路1，首尔大学，高光杓
Figure BDA0002611918790000291
BP/4表(KCTC表17)
*上述翻译文本与原文没有相违之处。代理师Lee,Cheo Young
Figure IDA0002611918950000011
Figure IDA0002611918950000021
Figure IDA0002611918950000031
PCT/RO/134表
Figure QDA0002611918940000011

Claims (16)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396菌株(KCTC13278BP)。
2.根据权利要求1所述的菌株，其中，所述植物乳杆菌KBL396菌株(KCTC13278BP)包含由SEQ ID NO:1表示的16s rDNA序列。
3.根据权利要求1所述的菌株，其中，所述植物乳杆菌KBL396菌株(KCTC13278BP)表现出选自由血清素分泌增加、炎性细胞因子表达抑制、肠内有害细菌减少和抗氧化作用组成的组中的至少一种性质。
4.一种药物组合物，包含选自由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396菌株(KCTC13278BP)、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物组成的组中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于预防或治疗神经系统疾病。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述神经系统疾病是精神障碍或神经退行性疾病。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述精神障碍是选自由应激引起的紧张、焦虑、抑郁、情感障碍、失眠、妄想性障碍、强迫症、偏头痛、记忆障碍、认知障碍和注意力障碍组成的组中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述神经退行性疾病是选自由帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓小脑萎缩症、图雷特氏综合征、弗里德里希共济失调症、马查多-约瑟夫病、痴呆、肌张力障碍和进行性核上性麻痹组成的组中的至少一种。
9.根据权利要求4所述的药物组合物，进一步包含药学上可接受的赋形剂和/或冻干剂中的至少一种。
10.一种用于预防或改善神经系统疾病的食品组合物，包含选自由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396菌株(KCTC13278BP)、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物组成的组中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的食品组合物，进一步包含药学上可接受的赋形剂和/或冻干剂中的至少一种。
12.一种用于动物饲料的添加剂，包含选自由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396菌株(KCTC13278BP)、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物组成的组中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的用于动物饲料的添加剂，进一步包含药学上可接受的赋形剂和/或冻干剂中的至少一种。
14.一种预防或治疗神经系统疾病的方法，包括将选自由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KBL396菌株(KCTC13278BP)、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物组成的组中的至少一种以治疗有效量施用于有需要的受试者。
15.一种用于预防或治疗神经系统疾病的组合物，包含选自由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396菌株(KCTC13278BP)、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物组成的组中的至少一种。
16.包含选自由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KBL396菌株(KCTC13278BP)、所述菌株的培养物、所述菌株的裂解物和所述菌株的提取物组成的组中的至少一种的组合物在制备用于预防或治疗神经系统疾病的预防性或治疗性药物中的用途。
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