KR102265538B1 - 락토바실러스 플란타럼 kbl396 균주 및 그 용도 - Google Patents

락토바실러스 플란타럼 kbl396 균주 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물, 및 이의 식의약적 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 균주 및 조성물은 신경계 질환의 개선, 특히 정신 장애 및 신경퇴행성질환의 개선에 효과가 탁월하고, 인체에 부작용의 위험이 없어 신경계 질환의 개선을 위한 용도로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

락토바실러스 플란타럼 KBL396 균주 및 그 용도{Lactobacillus plantarum KBL396 and Use Thereof}
본 발명은 신규 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) 균주 및 그 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 신규 프로바이오틱인 락토바실러스 플란타럼 KBL396 균주, 이의 생균체, 사균체, 배양물, 파쇄물 또는 추출물을 함유하는 조성물 및 이의 인간의 정신건강 개선을 위한 식의약적 용도에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)는 장내 미생물 균형에 도움을 주는 항균 활성과 효소 활성을 가진 미생물 및 상기 미생물이 생산하는 생산물을 말한다. 아울러 프로바이오틱스는 건조세포나 발효산물 형태로 사람이나 동물에 공급되어, 장내 균총을 개선하는 단일 또는 복합 균주 형태의 생균으로 정의되고 있다. 프로바이오틱스가 갖추어야 할 특성은 인간의 장내를 서식지로 하고, 비병원성, 무독성의 특성을 가지며, 장으로 가는 동안 살아 남아야한다. 더 나아가 전달되는 식품 안에서 소비되기 전에 생존율과 활성을 유지하고, 감염 예방으로 사용되는 항생제에 대해 민감해야 하며, 항생제 내성을 갖는 플라스미드를 보유하지 않아야 한다. 또한, 장내 환경에서 산, 효소, 담즙에 대한 내성을 갖추어야 한다.
이러한 프로바이오틱스로는 소화효소(amylase, protease, lipase, cellulase, phosphatase) 생성능력이 우수한 바실러스 종(Bacillus sp.), 젖산을 생성하는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.), 가축의 분변에 남아있는 악취 유발물질(암모니아, 황화수소, 아민류 등)을 대사과정에 이용하여 악취유발을 막는 광합성 박테리아(Photosynthetic bacteria) 등을 그 예로 들 수 있다. 최근 프로바이오틱스는 장 건강 개선을 비롯한 다양한 건강 기능 개선 효과가 보고되면서 기존 화합물에 기초한 치료제를 대체할 수 있는 주요한 치료 물질로 각광받고 있다.
신경계 질환으로써, 현대사회에 급증하는 스트레스 등으로 인해 불안, 우울, 정신분열, 인지 장애 등을 포함하는 정신 장애와, 노화와 관련이 있고 종종 다른 신경학적 결손과 함께 기억력, 운동 능력, 인지 능력 및 감각 능력 중의 하나 이상의 퇴화 또는 손실이 동반되는 중추신경계(CNS) 및/또는 말초 신경계(PNS)의 신경 세포의 점차적인 소실을 특징으로 신경 퇴행성 질환이 증가하고 있다.
정신 장애를 겪는 환자들은 심할 경우 자살 사고로 이어질 수 있고, 특히 우울증 환자의 과반수 이상이 자살을 고려하는 것으로 보고된 바 있으며, 실제로 10 내지 15%의 환자들이 자살을 시행하는 것으로 알려져 있다. 우울증은 의욕 저하와 우울감을 주요 증상으로 하고 다양한 정신적 및 신체적 증상을 일으켜 일상 기능의 저하를 가져오는 질환으로, 평생 유병률 중 약 15~20%가 우울장애라고 보고되고 있다. 우울증의 발명 원인에 대해서는 아직 명확하게 밝혀져 있지 않으나, 다른 정신 질환과 같이 다양한 생화학적, 유전적 그리고 환경적 요인이 질병을 야기시키는 것으로 알려져 있다. 우울증의 평생 유병률은 여성의 경우 10~25%, 남성의 경우 5~12% 정도로, 여성에서 그 빈도수가 2배 정도 많다.
이처럼 우울증이 오늘날 대표적인 고빈도 질환으로 발병하고 있는데, 우울증은 심신을 동시에 악화시키는 질환으로, 적절히 치료되지 않으면 몇 개월에서 몇 년 동안 지속되면서 인간관계의 와해나 직업적인 생산성의 상실, 무능감에 빠져 죽음에 이를 수도 있어, 환자 개인뿐 아니라 가족, 사회에까지 큰 부담을 줄 수 있다.
상기와 같은 우울증의 심각성이 보고되고는 있지만, 아직까지 우울증의 원인과 항우울제의 작용 메커니즘이 완벽하게 밝혀져 있지는 않다. 다만 일반적으로 중추신경계의 시냅스 내의 모노아민계 신경전달 물질인 세로토닌(serotonin, 5-HT)이 부족하면 우울증이 유발된다는 것이 학계에 널리 알려져 있다(Sodhi MS et al, Int Rev Neurobiol 2004, 59, 111-174).
현재 임상에 사용되는 항우울제는 대부분 모노아민계 신경전달물질의 작용을 강화하는 약물들로, 신경세포의 세로토닌이나 노르에피네프린의 재흡수를 억제하는 물질(SSRI, SNRI, TCAs 계열 등), 모노아민 산화효소 억제제(monoamine oxidase inhibitors)와 같이 세로토닌이나 도파민 등의 분해를 억제하는 물질이다. 하지만, 현재 우리나라의 우울증 환자 중 약 10-25%만이 항우울제 치료를 받고 있으며, 이중 40% 가량은 부작용 등으로 인해 순응도가 떨어져 치료를 중단하는 것으로 알려져 있고, 나아가 항우울제를 복용하더라도 반응이 없는 비반응군(non-responder)이 33%에 달하는 것으로 보고되고 있어, 보다 효과적인 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
또한, 신경 퇴행성 질환은 다양한 원인에 의해 뇌기능이 손상되면서 이전에 비해 인지 기능이 지속적이고 전반적으로 저하되어 일상생활에 상당한 지장을 초래하는 증상으로, 이러한 인지장애는 점진적으로 정신 황폐를 야기하고 결국 죽음을 초래하는, 기억, 인지, 추론, 판단 및 감정 안정의 진행성 손실을 임상적인 특징으로 한다.
이러한 질환의 하나의 예로서 알츠하이머병(AD)은 노인들의 진행성 정신적 기능상실(치매)의 통상적인 원인이고 미국에서 의학적 사망 원인 중 4번째로 간주된다. 특히, 알츠하이머병은 기억을 포함한 인지 작용에서 기본적인 역할을 하는 전뇌 기저부에서 콜린성 뉴런의 퇴행과 연계되어 있다(Becker et al. , Drug Development Research, 1988, 12, 163-195). 또한, 인지 장애 및 퇴행성 뇌 장애는 다양한 인종 및 종족에서 세계적으로 발견되었고, 주요한 공공의 건강 문제가 되었다. 현재 이들 질병은 미국에서만 약 2백만 내지 3백만 명에 영향을 미치고 있는 것으로 추정되고 있으나, 현재 사용되는 약물 처치로는 치료가 불가능하고 인간 수명이 증가함에 따라 전 세계적으로 증가하고 있어, 초기에 예방할 수 있도록 주의를 기울이는 것이 중요하다고 할 수 있다.
이러한 배경 하에, 신경계 질환에 대한 효과적인 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1620163호
1. Sodhi MS et al., Int Rev Neurobiol 2004, 59, 111-174. 2. Becker et al., Drug Development Research, 1988, 12, 163-195.
위와 같은 문제점들을 해결하고자, 본 발명자들은 프로바이오틱스의 건강증진 효과가 속 (genus)과 종 (species)의 일반적 특징이라 보기 어렵고 특정의 균주 (strain) 특이적인 효과에 해당함을 고려하여 (Report of a joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, London Ontario, Canada, 2002), 다양한 프로바이오틱스 균주를 스크리닝하여 신경계 질환 개선에 우수한 효과를 나타내는 균주를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 신규 유산균을 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 신규 유산균의 다양한 식의약적 용도를 제공하는 것에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 동물 사료용 첨가제를 제공한다.
본 발명은 또한 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 치료학적으로 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 신경계 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물은 인체에서 독성이 없이 안전하고 치료제로써 부정적 인식없이 용이하게 접근할 수 있는 장점과 더불어, 종래 신경계 질환 치료제들이 갖는 부작용의 위험이 없이 신경계 질환의 개선에 우수한 효과를 나타내어 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 다양한 락토바실러스 속, 비피도박테리움 속 균주가 세로토닌 생합성 경로의 율속효소인 TPH-1의 발현에 미치는 영향을 비교한 결과(A)와 상업적으로 판매되고 있는 균주들과 대비하여 락토바실러스 플란타럼 KBL396 균주가 TPH-1의 발현에 미치는 영향 차이를 확인한 결과(B)이다.
도 2는 Y-MAZE 테스트를 위한 실험기구의 모식도(A) 및 Y-MAZE 테스트에 따른 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주 투여의 변경 행동력 개선을 측정한 결과(B)이다.
도 3은 Y-MAZE 테스트에서 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주 투여에 의한 TPH-2 유전자 발현 증가 및 세로토닌 (5-HT) 농도 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 사회적 공격(social defeat)에 의해 동물모델에 스트레스를 유발시키기 위한 케이지(A) 및 사회적 회피 실험(social avoidance test)을 위한 실험 박스의 모식도(B)이다.
도 5는 C57BL/6 마우스에 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주 투여시 사회적 공격에 의해 유도된 스트레스 회복력 개선 효과를 사회적 회피 실험으로 확인한 결과이다.
도 6은 꼬리 매달기 실험 방법을 나타낸 모식도(A) 및 C57BL/6 마우스에 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주 투여시 사회적 공격에 의한 유도된 스트레스에 대한 회복력을 꼬리 매달기 실험으로 확인한 결과(B)이다.
도 7은 사회적 회피 실험(Social Avoidance Test) 동물모델의 뇌에서 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주 투여시 염증성 사이토카인인 IL-1ß의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 사회적 회피 실험(Social Avoidance Test) 동물모델에서 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주 투여시 비장에서의 CD4/CD8 비율 변화 및 CD3+CD4+ 내 FOXP3+CD25 세포의 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주에 동결보호제를 처리하여 동결건조에 따른 생존율 변화를 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 인간에서 유래한 다양한 프로바이오틱스 균주의 세로토닌 생합성 능력을 비교하였고, 그 중에서도 락토바실러스 플란타럼 KBL396 균주가 세로토닌 생합성에 특히 탁월한 효과를 보이는 것을 확인하였으며 이의 신경계 질환에 대한 우수한 예방, 개선 및 치료 효과를 확인하였다. 또한 상기 균주의 16s rDNA를 분석한 결과, 상기 균주가 종래 공지된 바 없는 신규한 균주임을 확인하였다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16s rDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
<서열번호 1>
TATCAGTACGTGCTATAATGCAGTCGACGACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGGAGTACGGCCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGGAGCATGTGGGTTTAATTCAAAGCTACGCGAAGAAACCTTACCCAGGTTTTGACATACTAATGCAAATTCTAAAGAGATTAGAACGTTTCCCTTCCGGGGACATGGGATACCGGGTGGGTGCATGGGTTGGTCGTCAGCTTCGTGGTCGTGAGAATGTTTGGGTTTAAGTTCCCCGAAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTAGAACCAGCCGCCTAATGGCACCACCATGCG
본 발명에 따른 균주는 세로토닌 분비 증가, 염증성 사이토카인 발현 억제, 장내 유해균의 감소 및 항산화 작용으로 구성된 군으부터 선택되는 어느 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 균주는 탄소원으로 D-리보스, D-갈락토스, D-글루코스, D-프럭토스, D-만노스, 만니톨, 솔비톨, α-메틸-D-만노사이드, α-메틸-D-글루코사이드, N-아세틸-글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스큘린(esculin), 살리신(salicin), 셀로바이오스, 말토스, 락토스, 멜리바이오스(melibiose), 수크로스, 트레할로스, 메레지토즈(melezitoze) 및 젠티오바이오스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 균주는 류신 아릴아미다제, 발린 아릴아미다제, α-글루코시다제 및 ß글루코시다제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 효소 활성을 가진다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주는 인체에서 독성이 없이 안전하고 치료제로써 부정적 인식없이 용이하게 접근할 수 있는 장점과 더불어, 종래 신경계 질환 치료제들이 갖는 부작용의 위험없이 신경계 질환의 개선에 우수한 효과를 나타내어 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, “배양물”은 유산균을 공지의 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 상기 산물은 유산균을 포함할 수 있다. 상기 배지는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 MRS 액체 배지, GAM 액체 배지, MRS 한천 배지, GAM 한천 배지, BL 한천 배지일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 용어, “파쇄물”은 유산균을 효소 처리, 균질화 또는 초음파 처리 등으로 파괴된 유산균을 의미한다. 또한, 본 발명에서 용어, “추출물”은 유산균을 공지의 추출용매로 추출하여 수득한 산물을 의미한다. 또한 본발명에서 용어, “생균체”는 본 발명의 신규한 유산균 그 자체를 의미하고, “사균체”는 가열, 가압 또는 약물처리 등으로 살균 처리된 유산균을 의미한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 신경계 질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 가지며, 장내 균총의 회복, 항산화 효과, 면역 조절 효과 등을 통해 약학 조성물로써 우수한 효과를 나타낸다.
본 발명의 약학 조성물은 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 동결건조제를 더 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 극심한 위장 장애, 현기증, 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다.
본 발명에 따른 조성물은 신규한 유산균 이외에 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 부형제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 동결보호제 등을 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명의 조성물이 경구 투여를 위한 고형 제제로 제제화된 경우 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 포함할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 조성물이 경구 투여를 위한 액상 제제로 제제화된 경우 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 포함하며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제, 등을 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 조성물이 비경구 투여를 위한 제제로 제제화된 경우 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 좌제를 포함할 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 유효성분인 신규한 유산균 등의 함량은 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 99 중량%, 구체적으로 0.1 내지 75 중량%, 보다 구체적으로 0.5 내지 50 중량%일 수 있다.
본 발명에서 이용되는 동결보호제는 동결건조 동안 프로바이오틱 제형을 보존하고, 품질수명(shelf-life)을 향상시키기 위해 이용된다. 본 발명에서 사용된 동결 보호제는 일반적인 당류를 포함할 수 있다. 당류는 모노-, 디-, 올리고- 또는 폴리 사카라이드, 또는 적어도 2 개 이상의 사카라이드의 혼합물일 수 있다.
예를 들어, 수크로스, 말토오스, 말토덱스트린, 트레할로스, 만니톨, 솔비톨, 이눌린, 글리세롤, DMSO, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 2-메틸-2,4-펜탄디올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리글리세롤, 탈지유, 우유 단백질, 유청 단백질, 베타인, 아도니톨, 락토오스 또는 이의 어떤 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 동결보호제가 이용될 수 있다.
바람직하게, 동결보호제로 수크로즈, 탈지유 및 솔비톨로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 수크로즈, 탈지유 및 솔비톨을 포함할 수 있으며, 구체적으로 조성물 총 중량에 대하여 수크로즈 2 내지 20 중량 %, 솔비톨 2 내지 20 중량 % 및 탈지유 5 내지 30 중량 %를 포함할 수 있다. 동결보호제의 첨가에 의하여 동결건조된 유산균은 현저히 증가한 생존율, 저장안정성, 내산성 및 내담즙성을 나타낼 수 있다.
또한, 동결 건조시킨 본 발명에 따른 조성물에, 리보플라빈(riboflavin), 리보플라빈 인산염(riboflavin phosphate) 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염, 글루타시온(glutathion), 아스코르베이트(ascrobate), 글루카시온(glutathion) 및 시스테인과 같은 항산화제의 첨가는 보관 동안 균주의 생존율을 더 증가시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 “예방”은 본 발명의 약학 조성물의 투여로 신경계 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명의 약학 조성물의 투여로 신경계 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 “신경계 질환”이란 신경계의 병리로부터 유래하는 모든 병상을 포함한다. 이에 따라 본 발명은 신경, 신경정신, 정신, 신경변성, 신경퇴행과 관련된 급성 및/또는 만성의 질환에 대한 예방 또는 치료를 목적한다.
이러한 신경계 질환은 정신 장애 또는 신경 퇴행성 질환일 수 있다.
정신 장애의 비제한적인 예로는 스트레스로 인한 긴장, 불안, 우울증, 기분 장애, 불면증, 망상 장애, 강박 장애, 편두통, 기억 장애, 인지 장애, 주의력 장애 등을 들 수 있다. 또한, 신경 퇴행성 질환의 비제한적인 예로는 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s disease), 치매, 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 인체에서 독성이 없이 안전하고 치료제로써 부정적 인식없이 용이하게 접근할 수 있는 장점과 더불어, 종래 신경계 질환 치료제들이 갖는 부작용의 위험이 없이 신경계 질환의 개선에 우수한 효과를 나타내어 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 일구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 세로토닌 생합성을 유도하여 신경계 질환에 대한 예방, 개선 및 치료 효과를 가진다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 인지능력 개선에 탁월한 효과를 나타낸다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 스트레스 환경에서, 긴장, 우울증, 불안 등의 증세의 개선에 우수한 효과를 나타낸다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 신경계의 염증 반응을 조절하여 신경계 질환의 예방, 치료 및 개선에 우수한 효과를 나타낸다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 염증 반응을 조절함으로써 신경계 질환에 우수한 예방, 개선 및 치료 효과를 나타낸다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 면역 불균형으로 인한 신경 및 뇌에서의 염증 반응을 조절함으로써 신경계 질환에 우수한 예방, 개선 및 치료 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 약제학적으로 유효한 양이어야 한다. “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 신경계 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 ㎏당 본 발명의 조성물을 1일 0.001 내지 1000 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎/㎏으로 투여할 수 있다.
상기와 같이 투여제를 투여할 경우, 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주를 1일 1x103 CFU/kg 내지 1x1011 CFU/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 특히, 경구용 단위 제형으로서 장용 피복된 장용성 제제로서 제공될 수 있다. 본 명세서에서의 "장용 피복"은 위산에 의해서는 분해되지 아니하여 피복이 유지되나, 소장에서는 충분히 분해되어 활성 성분이 소장내에 방출될 수 있도록 하는, 약제학상 허용 가능한 모든 종류의 공지의 피복을 포함한다. 본 발명의 "장용 피복"은 pH 1의 HCl 용액과 같은 인공 위즙을 36℃내지 38℃에서 접촉시킬 때, 2시간 이상 동안 그대로 유지되며, 바람직하게는 이후에 pH 6.8의 KH₂PO₄ 완충 용액과 같은 인공 장즙에서 30분 이내에 분해되는 피복을 지칭한다.
본 발명의 장용 피복은 1개의 코어(core)에 약 16 내지 30, 바람직하게는 16 내지 20 또는 25 mg 이하의 양으로 피복된다. 본 발명의 장용 피복의 두께가 5 내지 100 ㎛, 바람직하게는 20 내지 80 ㎛인 경우가 장용 피복으로서 만족스러운 결과를 나타낸다. 장용 피복의 재료는 공지의 고분자 물질들 중에서 적당히 선택된다. 적당한 고분자 물질은 다수의 공지 문헌(L. Lachman 외, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3판, 1986, pp. 365∼H. Sucker 외, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359; Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis, 4판, Vol. 7, pp. 739 ∼742, 및 766 ∼778, (SpringerVerlag, 1971); 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 13판, pp. 1689 ∼1691 (Mack Publ., Co., 1970))에 열거되어 있고, 셀룰로즈 에스테르 유도체, 셀룰로즈 에테르, 아크릴 수지의 메틸아크릴레이트 공중합체 및 말레산 및 프탈산 유도체의 공중합체가 이들에 포함될 수 있다.
본 발명의 장용 피복은 장용 피복 용액을 코어에 분무하는 통상적인 장용 피복법을 사용하여 제조될 수 있다. 장용 피복 공정에 사용되는 적당한 용매로는 에탄올과 같은 알콜, 아세톤과 같은 케톤, 다이클로로메탄(CH2Cl2)과 같은 할로겐화 탄화수소 용매이며 이들 용매들의 혼합 용매가 사용될 수도 있다. 디(di)-n-부틸프탈레이트 또는 트리아세틴과 같은 연화제를 1 대 약 0.05 내지 약 0.3 (코팅 재료 대 연화제)의 비율로 피복 용액에 첨가한다. 분무 과정을 연속적으로 수행하는 것이 적절하며 피복의 조건을 고려하여 분무량을 조절하는 것이 가능하다. 분무압은 다양하게 조절할 수 있고, 일반적으로 약 1 내지 약 1.5 바(bar)의 분무압으로 만족할만한 결과가 얻어진다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 점안제, 안연고제, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 국소 투여를 위한 제제는 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 신경계 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 신경계 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 식품용 또는 식품 첨가용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 신경계 질환 예방 또는 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 건강기능식품 또는 기능성 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강기능식품 및 기능성 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본 발명에 따른 상기 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 기능성 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 신경계 질환 증상의 개선 또는 예방용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본 발명의 신경계 질환 증상의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 100중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1중량% 내지 99중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 10g, 바람직하게는 0.01g 내지 1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에 는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 적어도 하나 이상의 부형제 및/또는 동결건조제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 락토바실러스 플란타럼 KBL396 균주를 독립적으로 또는 허용 가능한 담체에 첨가하거나, 인간 또는 동물이 섭취하기에 적합한 조성물 형태로 제조될 수 있다. 즉, 다른 프로바이오틱 세균을 함유하지 않은 식품 및 이미 몇 가지의 프로바이오틱 세균을 함유한 식품에 첨가되어 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품을 제조함에 있어서, 본 발명의 균주와 함께 사용 가능한 다른 미생물들은 인간이나 동물이 섭취하기에 적합하고 섭취시 병원성 유해세균을 억제하거나 포유동물 장관 내의 미생물 균형을 개선시킬 수 있는 프로바이오틱 활성을 갖는 것들이면, 특별히 제한되지 않는다. 그러한 프로바이오틱 미생물의 예로는 사카로미세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 피치아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis)를 포함하는 효모(yeast), 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조퍼스(Rhizopus), 뮤코(Mucor), 페니실린(Penicillium) 등과 같은 곰팡이 및 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 류코노스톡(Leuconostoc), 락토코커스(Lactococcus), 바실러스(Bacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 그로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 페디오코커스(Pediococcus) 속에 속하는 세균 등이 있다. 적당한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예로는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbruckii), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 파시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici)등을 들 수 있다. 바람직하게는, 우수한 프로바이오틱 활성을 가지면서 동시에 신경계 질환 개선 효과가 뛰어난 프로바이오틱 미생물 혼합균을 본 발명의 식품용 조성물에 추가로 포함함으로써 그 효과를 더욱 증진시킬 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물에 사용될 수 있는 담체의 예로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등일 수 있으며 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 KBL396은 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 동물 사료용 첨가제를 제공한다.
본 발명의 동물 사료용 첨가제는 적어도 하나 이상의 부형제 및/또는 동결건조제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 동물 사료용 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 상기 락토바실러스 플란타럼 KBL396 균주 이외에 비병원성의 다른 미생물을 더 포함할 수도 있다. 첨가할 수 있는 미생물로는 예컨대 단백질 분해효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스(Lactobacillus) 균주, 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(Slyter, L. L. J. Animal Sci.1976, 43. 910-926) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(Johnson, D. E et al. J. Anim. Sci.,1983, 56, 735-739 ; Williams, P. E. V. et al,1990, 211) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 동물 사료용 첨가제는 상기 락토바실러스 플란타럼 KBL396 이외에 하나 이상의 효소제제를 더 포함할 수도 있다. 첨가되는 효소제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며 효소제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이틱 애시드(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 α-1,4-글리코시드 결합(glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라제(xylase), 말토스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 KBL396 균주는 동물 사료용 첨가제로 사용함에 있어서, 사료용 원료로는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등이 사용될 수 있으며, 이들은 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 제한없이 사용할 수 있다. 가공과정은, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 사료원료가 충진된 상태에서 가압 하에 일정한 배출구로 압축되는 공정으로, 단백질의 경우에는 변성이 되어 이용성이 증가되는 압출 성형(extrusion)을 사용하는 것이 바람직하다. 압출성형(extrusion)은 열처리 과정을 통해 단백질을 변성시키고 항효소인자를 파괴시키는 등의 장점을 갖는다. 또한, 대두 단백질과 같은 경우에는 압출 성형을 통해서 단백질의 소화율을 향상시키고 대두에 존재하는 단백질 분해효소의 저해제중의 하나인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 항 영양인자들을 불활성화시키며 단백질 분해효소에 의한 소화율 향상을 증가시켜 대두 단백의 영양적 가치를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 치료학적으로 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "치료학적으로 유효량(또는, 유효한 양)"은 바람직한 효과를 전달하기에는 매우 충분하지만 의학적 판단 범위 내에서 심각한 부작용을 충분히 방지할 정도의 적절한 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 의하여 체내에 투여되는 미생물의 양은 투여 경로, 투여 대상을 고려하여 적절하게 조정될 수 있다.
상기 “투여”는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 신규한 유산균을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 개체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다. 또한 이와 같은 개체들에는 알레르기 질환의 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 개체들이 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명은 신경계 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 세로토닌 생합성 유도능을 갖는 프로바이오틱 균주의 스크리닝
많은 선행문헌들에서 세로토닌이 신경계 질환, 특히 정신 장애에 주요한 역할을 담당하는 것으로 보고되어 있다. 유아 및 성인 유래의 분변에서 분리한 47종의 프로바이오틱 균주(락토바실러스 속 19종, 비피도박테리움 속 28종) 및 프로바이오틱스 제품으로 판매중인 락토바실러스 플란타럼 종의 2종 균주를 이용하여 세로토닌 생합성 유도능을 평가하였다. 세로토닌 생합성 유도능은 장크롬친화성(enterochromaffin cell) 세포주인 RIN14B에 각 균주를 처리하고 세로토닌 생합성 경로의 율속효소(rate-limiting enzyme)인 TPH-1(tryptophan hydroxylase-1)의 발현이 각 균주에 의해 얼마나 촉진되는지를 관찰하여 확인하였다.
1-1. 균주의 배양 및 배양액의 준비
신경계 질환에 유효한 효과를 보이는 신규 균주를 스크리닝하기 위하여, 건강한 한국인 남녀 성인 혹은 유아의 분변으로부터 분리한 47종의 후보 유산균들을 사용하였다. 이들 후보 유산균들을 각각 0.5% 시스테인을 첨가한 MRS 배지에서 배양하고, 24시간 간격으로 총 2회의 계대배양(subculture)을 통해 활성화시킨 후, 각 균주의 대사산물을 포함하는 배양액(culture supernatant)을 실험에 사용하였다. 배양액을 수득한 뒤 원심분리(13,000Xg, 5분, 4℃)하여 얻은 상층액의 pH를 7.0으로 보정한 뒤, 0.22μm 기공 크기의 필터를 이용하여 멸균하고, 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.
위 신규 균주 스크리닝에 사용된 유산균주들을 각각 KBL346, KBL642, KBL342, KBL649, KBL351, KBL633, KBL663, KBL621, KBL647, KBL640, KBL646, KBL639, KBL402, KBL600, KBL591, KBL538, KBL501, KBL652, KBL662, KBL389, KBL613, KBL544, KBL391, KBL395, KBL648, KBL497, KBL384, KBL354, KBL500, KBL362, KBL612, KBL664, KBL397, KBL545, KBL363, KBL374, KBL375, KBL385, KBL665, KBL481, KBL381, KBL605, KBL383, KBL624, KBL585, KBL365, 또는 KBL396으로 명명하였다. 위 균주 중 KBL346, KBL342, KBL351, KBL402, KBL389, KBL391, KBL395, KBL384, KBL354, KBL362, KBL397, KBL363, KBL374, KBL375, KBL385, KBL381, KBL383, KBL365, KBL396의 19종의 균주는 락토바실러스 속 균주로, KBL642, KBL649, KBL633, KBL663, KBL621, KBL647, KBL640, KBL646, KBL639, KBL600, KBL591, KBL538, KBL501, KBL652, KBL662, KBL613, KBL544, KBL648, KBL497, KBL500, KBL612, KBL664, KBL545, KBL665, KBL481, KBL605, KBL624, KBL585의 28종의 균주는 비피도박테리움 속 균주로 확인되었다.
또한, 상업적으로 판매 중인 제품으로 락토바실러스 플란타럼 PS128 단일 균주로 구성된 Solace (Oryx Biomedical Inc., Fremont, CA, USA) 제품과 락토바실러스 플란타럼 299v 단일 균주로 구성된 L.plantarum (Quest Vitamins Limited, Kingstone, Hereford, UK) 제품을 각각 구입하여, 락토바실러스 플란타럼 균주를 후보 유산균과 동일한 과정의 배양 및 활성화 과정을 거쳐 배양액을 수득하여 실험에 사용하였다.
1-2. RIN14B 세포주의 배양
RIN14B(ATCC CRL-2059) 세포주는 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, 페니실린(100 μg/ml), 스트렙토마이신(100 μg/ml)이 첨가된 RPMI 1640 배지로 배양하며 3일에 한 번씩 계대배양하였다. RIN14B 세포주를 24웰 플레이트에 4×105 cells/웰씩 분주하고 24시간 배양한 후, 균주 배양액을 처리하였다.
1-3. 균주배양액의 처리
실시예 1-2에서 24웰 플레이트에 분주해 둔 RIN14B 세포주로부터 배지를 제거한 후, PBS(500 μl/웰)로 1회 세척하였다. 이후 실시예 1-1에서 준비한 균주 배양액 500 μl를 처리하거나, 양성대조군으로 세로토닌 합성 유도능이 보고된 데옥시콜레이트(deoxycholate)의 pH를 7.0으로 보정 후 필터로 멸균한 MRS 배지에 희석하여 최종 농도가 25 μM이 되도록 500 μl 처리하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양한 뒤, 세포와 상층액을 수거하여 TPH-1(Tryptophan hydroxylase-1) 효소의 발현량을 확인하였다.
1-4. qRT - PCR법에 따른 TPH-1 발현량 측정
TPH-1(Tryptophan hydroxylase-1)의 발현량을 확인하기 위하여 Easy-spin?? Total RNA Extraction Kit (Intron)을 사용하여 제조자 방식에 따라 실시예 1-3에서 얻어진 세포의 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA에서 High-Capacity RNA-to-cDNA™Kit를 사용하여 제조자 방식에 따라 cDNA를 합성한 후, Rotor-Gene Q(QIAGEN), Rotorgene SYBR Green PCR 키트 또는 Quantstudio 5 (Thermofisher), Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 qRT-PCR(quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다.
TPH-1발현양은 하기 표 1에 기재된 바와 같이, Tph-1 F 및 Tph1 R 프라이머를 사용하거나, Tph-1A F 및 Tph-1A R 프라이머를 사용한 측정값을 Rat B-actin F 및 Rat B-actin R 프라이머로 측정한 β측정값 대비 상대 발현량 차이로 계산하였다(delta-delata CT analysis). qRT-PCR에 사용한 프라이머와 온도 조건은 각각 하기 표 1 및 표 2에 정리하였다.
프라이머 서열
Tph-1 F ggctttgaggtcctctttcca (서열번호 2)
Tph-1 R ccccctttctgaggaatggtc (서열번호 3)
Tph-1A F accctgggatgtgcttcatg (서열번호 4)
Tph-1A R gcgttctgcaaagcaacaga (서열번호 5)
Rat B-actin F cagccttccttcctgggtatg (서열번호 6)
Rat B-actin R tagagccaccaatccacacag (서열번호 7)
온도 시간 사이클
95℃ 5 분 1 사이클
94℃ 15 초
50 사이클
60℃ 30 초
72℃ 30 초
위 조건 하에 수행한 실험 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1A(Rotor-Gene Q(QIAGEN), Rotorgene SYBR Green PCR 키트 사용, Tph-1 F 및 Tph1 R 프라이머)에서 볼 수 있듯이, KBL396 균주를 처리한 군에서 다른 균주를 처리한 군 및 25 μM의 데옥시 콜레이트를 처리한 군에 비해 최대 2~4배 많은 TPH-1 발현량을 나타내었다.
또한, 상업적으로 이용가능한 락토바실러스 플랜타럼 균주와 비교한 결과를 도 1B(Quantstudio 5 (Thermofisher), Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), Tph-1A F 및 Tph-1A R 프라이머 사용)에 나타내었다. 도 1B와 같이, 본 발명에 따른 균주로 KBL396 균주가 TPH-1 발현 유도능이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다 (Q1, 락토바실러스 플란타럼 299v; S1, 락토바실러스 플란타럼 PS128).
위 결과를 통해서 정상적인 한국인 성인 여성의 분변에서 분리한 균주로 삼성서울병원에서 임상연구 승인 (IRB No. 144-2011-07-11) 하에 공여자의 동의를 받아 채취한 균주인 KBL396 균주가 우수한 세로토닌 합성 유도능을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 2. KBL396 균주가 포함된 사료의 제조 및 동물모델에의 사료 투여
실시예 1을 통하여 KBL396 균주가 세로토닌 생합성에 우수한 효과를 나타냄을 in vitro에서 확인한 바, KBL396 균주가 생체 내에서도 신경계 질환에 우수한 효과를 나타내는지 확인해 보고자, 전임상 실험으로 동물모델을 이용한 실험을 진행하고자 하였으며, 이를 위하여 KBL396 균주가 포함된 사료를 제조하고, 이를 동물모델에 투여하였다.
2-1. 사료의 제조
위관영양법(Oral gavage)의 경우 실험동물에게 큰 스트레스를 초래하며, 이와 같은 스트레스가 실험결과의 객관성에 영향(bias)을 줄 수 있어, 동물모델에는 상기 균주를 섞어 제조한 사료의 형태로 투여하는 실험을 계획하였다.
균주의 투여를 위해 사용된 사료는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. KBL396 균주는 MRS배지에서 24시간동안 배양하여 활성화시키고, 새로운 MRS배지에 1% 접종하여 (v/v) 24시간 동안 계대 배양하였다. 이후 배양액을 6000rpm, 4℃의 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고, 4℃, 1x PBS로 펠렛(pellet)을 풀어주었다. 이때 1x PBS는 배양액 부피의 50% 이상을 넣어주어 충분히 풀어줄 수 있도록 하였다. 이후 앞서와 동일한 조건으로 원심분리하고, 세척(Washing)을 2회 반복하여 준 뒤, 펠렛을 1x PBS로 풀어주었다(균주 농축액).
방사선 멸균된 사료를 분쇄하여 분말형태로 만들어 준 뒤, 미리 준비한 균주농축액에 섞어 반죽하여 주고, 알맞은 크기로 빚어 -80℃에 24시간동안 얼려주었다. 이후 48-72 시간동안 동결건조하여 사용 전까지 -80℃에 보관하였다. 사료에 포함되어 있는 KBL396 균주의 양은 사료 1 g 당 약 1 x 109 CFU이 되도록 하였으며, 대조군도 동일한 질량의 PBS 시료를 섞어, 균주를 섞어 제조한 사료와 동일한 방법으로 제작하였으며, -80℃에 보관하였다.
2-2. 사료의 투여
‘PBS가 포함된 사료' 및 'KBL396 균주가 포함된 사료'는 제조 후 -80℃에 보관하며 매일 새로이 꺼내어 매일 오전 9 시에 제공하였고, C57BL/6 마우스 한 마리 당 3-5 g의 사료를 공급(주령에 따라 그 양을 늘려주었음)하였다. 사료 공급 시 남은 사료는 수거하여 사료 섭취량 및 균주 섭취량을 계산하였다. 사료는 28 일 이상 투여하며 동물모델을 관찰하였다.
실시예 3. KBL396 균주 투여에 따른 인지 능력 개선 효과(Y-MAZE 실험)
28일간의 균 투여 이후 Y-maze 실험을 수행하여 KBL396 균주의 인지 능력 개선 효과를 확인하였다. 본 발명에서 사용한 동물모델은 7주령의 C57BL/6 마우스로, PBS 대조군, KBL396 균주 처리군 두 그룹 각각 8마리로 실험을 수행하였다.
Y-MAZE 실험은 동물모델을 이용한 인지능력 판단을 위하여 고안된 행동실험이다. 실험에는 Y자 모양의 120° 각도를 이루는 3개의 통로를 구성하고, 각 통로를 A, B, C로 정한 후, 한 통로에 실험동물을 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이도록 한 다음, 각 통로에 들어간 횟수와 순서를 천정에 설치된 카메라 및 이에 연결된 컴퓨터 프로그램으로 관찰하여 기록하였다. 이 때 각 통로에 들어간 횟수와 순서는 꼬리가 완전히 들어간 경우에 한하여 기록하였고, 반복하여 동일한 가지에 다시 들어간 경우도 기록하였다. 3개의 서로 다른 통로에 순차적으로 들어간 경우(실제 변경, actual alteration), 즉 ABC, CAB, BAC 등의 순서로 들어간 경우, 1점씩 부여하였으며, % 변경행동력(% alteration behavior)은 다음 식에 의해 계산하였다.
% 변경행동력 = 실제변경(actual alternation) / 최고변경(maximum alternation) × 100 (최고변경 : 총 입장횟수 - 2)
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 볼 수 있듯이, KBL396을 투여한 동물모델에서 PBS 대조군을 투여한 동물모델에 비하여 유의하게 높은 인지능력 개선 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 4. KBL396 균주 투여에 따른 뇌의 세로토닌 증가 효과
KBL396 균주 투여가 뇌의 세로토닌을 증가시킬 수 있는지를 확인하였다.
우선, 뇌조직의 세로토닌 생합성 경로의 율속효소인 TPH-2(tryptophan hydroxylase-2)의 양을 효소의 mRNA 양을 통해 확인하였다. 실시예 3의 동물 모델에서 얻어진 뇌 조직에서 실시예 1-4와 동일한 방법에 따라 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에서 Rotor-Gene Q(QIAGEN), Rotorgene SYBR Green PCR 키트 및 다음의 TPH-2f, TPH-2r 프라이머를 사용하여 TPH-2의 발현양을 확인하였다. 기타의 실험 조건 및 GAPDH 유전자 발현량과의 비교를 통한 결과의 분석은 실시예 1-4와 동일하게 진행되었다.
TPH-2f: 5' CAGTCCACGAAGATTTCGACTT 3' (서열번호 8)
TPH-2r: 5' GCAAGACAGCGGTAGTGTTCT 3' (서열번호 9)
위 조건하에 수행한 실험 결과를 도 3A에 나타내었다. KBL396을 투여한 동물모델 (KBL396)에서 PBS 대조군을 투여한 동물모델 (PBS)에 비하여 유의하게 높은 TPH2 유전자가 발현되고 있음을 확인하여, 세로토닌 생합성이 촉진될 수 있음을 확인하였다.
다음으로, 뇌조직의 세로토닌 농도를 직접 측정하기 위해 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 실시하였다. 실시예 3의 동물 모델에서 얻어진 뇌 조직에 stainless steel bead (5mm, Qiagen) 과 T-PER™Tissue Protein Extraction Reagent (Sigma)을 넣고 Tissue lyser II (Qiagen)를 사용하여 30hz의 조건에서 10분간 조직을 파쇄하였다. 파쇄된 혼합물로 원심분리를 수행(4℃, 11000 G, 15분)하여 중간층의 수용성 층을 수득하여 분석에 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다 ('수용성 시료'). '수용성 시료'의 세로토닌의 양을 측정하기 위해 Serotonin Ultrasensitive ELISA Assay Kit (Eagle biosciences)를 이용하여 제조자 방법에 따라 시료를 준비하여 Spark 10M Microplate Reader (Tecan)을 통해 분석하였다.
측정된 세로토닌 (5-HT)의 분석 결과를 도 3B에 나타내었다. KBL396을 투여한 동물모델 (KBL396)에서 PBS 대조군을 투여한 동물모델 (PBS)에 비하여 두배 이상 높은 농도의 세로토닌 (5-HT)가 측정됨을 확인하여, KBL396 균주가 뇌의 세로토닌 농도를 실제로 증가시킴을 확인하였다.
실시예 5. KBL396 균주 투여에 따른 스트레스 회복력 개선 효과(사회적 회피 실험)
사회적 회피 실험(Social Avoidance Test)은 동물모델을 이용하여 스트레스에 대한 영향을 평가하기 위하여 고안된 행동실험이다. 본 발명에서는 KBL396 균주의 스트레스 노출에 대한 저항성 증진 효과를 확인하기 위하여, 마우스에 스트레스를 유발시킨 후, KBL396 균주 투여에 따른 사회적 회피 실험을 진행하였다.
우선, 본 발명에서 사용한 동물모델은 7주령의 C57BL/6 마우스로, PBS 대조군, PBS+스트레스 처리군, KBL396 균주 처리군, KBL396 균주+스트레스 처리군의 네 그룹 각각 8마리로 실험을 수행하였다.
총 4주(28일)간 'PBS가 포함된 사료' 또는 'KBL396 균주가 포함된 사료'를 투여하고 마우스를 스트레스에 노출시켜 주었다. 스트레스에 노출되는 7일의 기간 동안에도, 사료는 'PBS가 포함된 사료' 또는 'KBL396 균주가 포함된 사료'를 지속적으로 제공하였다.
도 4는 사회적 공격(social defeat)에 의해 동물모델에 스트레스를 유발시키기 위한 케이지(A) 및 사회적 회피 실험(social avoidance test)을 위한 실험 박스의 모식도(B)이다. 마우스에 스트레스를 유발하기 위하여 C57BL/6 마우스를 CD-1 마우스와 중앙에 구멍이 뚫린 아크릴판으로 제작된 투명한 경계벽을 사이에 두고 같은 케이지에서 생활하게 하였다. 7일의 기간 동안, 하루에 한번 C57BL/6 마우스를 크고 공격적인 CD-1 마우스가 있는 곳으로 옮기고, CD-1 마우스에 의해 물리적 공격을 받게 하였다(Social defeat stress). 총 5분간의 공격이 진행된 후, C57BL/6 마우스를 기존에 접촉하지 않은 새로운 CD-1 마우스와 투명한 경계벽을 사이에 두고 서로 반대편에서 24시간 동안 생활하게 하였다. 24시간 동안 C57BL/6. 마우스는 CD-1 마우스의 위협에 노출되고 공격자(aggressor) CD-1 마우스의 존재를 지속적으로 인식하게 되므로 사회적 공격(Social defeat) 시의 물리적 스트레스(physical stress) 뿐 아니라, 이후의 정신적 스트레스 (mental stress)에도 노출되게 하였다.
이후, 스트레스 노출에 따른 행동 변화를 평가하기 위하여 사회적 회피 실험을 진행하였다. 사회적 회피 실험은 동일한 행동 실험 박스에서 수행하였으며, 총 두 세트로 진행하였다. 첫번째 세트에서는 C57BL/6 마우스를 박스의 가운데에 두어 3분 동안 자유롭게 움직이게 하였다. 두번째 세트에서는 CD-1 마우스를 격리 용기(removable enclosure)에 가두고 행동 실험 박스의 한쪽 측면의 가운데에 위치시킨 후 3분 동안 C57BL/6 마우스의 행동을 관찰하였다. 이 때 물리적 공격(Social defeat stress)에 노출된 C57BL/6 마우스는 CD- 1 마우스의 존재를 확인하면 반대편 모서리(corner zone)로 도망쳐 움직이지 않는 행동양상을 나타내며, C57BL/6가 모서리(corner zone)에 머무는 시간을 측정하여 사회적 회피 정도를 판단하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 KBL396을 투여한 마우스에서는 사회적 공격 스트레스를 유발하였을 때(KBL396+STR), 사회적 회피 정도가 현저히 개선되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. KBL396 균주 투여에 따른 우울증 개선 효과(꼬리 매달기 실험)
실시예 5에서 사회적 공격 스트레스를 겪은 C57BL/6 마우스는 우울증 유사행동(depressive-like behavior)을 나타내며, 이는 학계에 이미 구축된 우울증 마우스 모델이다. 본 발명에서는 KBL396 균주의 투여에 따른 우울증 개선 효과를 확인하기 위하여 사회적 공격 스트레스를 겪은 C57BL/6 마우스에 꼬리 매달기 실험(tail suspension test)을 진행하였다.
구체적으로, 균주의 투여와 스트레스 노출을 통한 우울증의 유도는 실시예 5의 방법과 유사하게 수행하였으며, 사회적 공격 스트레스를 받는 동안에도 균주는 동일하게 투여되었다.
사회적 공격 스트레스를 겪은 C57BL/6 마우스를 각각 분리된 구역에서 꼬리 끝 부분으로부터 약 1cm 떨어진 부분에 부착된 테이프에 의하여 거꾸로 매달고 실험시간 총 6분 중 마지막 4분 동안 부동시간을 측정하였다. 부동상태는 매달린 상태에서 아무런 움직임 없이 완전히 멈추어 있는 상태를 의미한다.
꼬리 매달기 실험 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 우울증이 유도된 대조군(PBS+STR)에 비해 KBL396 투여군(KBL396+STR)에서는 동일한 스트레스에 노출되었음에도 불구하고 정상 대조군과 동일한 수준으로 우울증이 회복되었음을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, KBL396 균주의 투여가 인지능력 개선 효과 및 스트레스에 따른 우울증의 예방 및 치료 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 7. KBL396 균주 투여에 따른 뇌의 염증 반응 조절 효과
KBL396 균주 투여에 따른 뇌의 염증 반응 조절 효과를 확인하기 위해 실시예 5의 동물 모델에서 얻어진 뇌조직의 총 단백질을 추출, ELISA를 수행하여 염증성 싸이토카인인 IL-1β의 양을 확인하였다. 실시예 5의 동물 모델 뇌 조직에서 실시예 4와 동일한 과정으로 '수용성 시료'를 수득하였다. '수용성 시료'의 단백질 농도 측정은 BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA)를 사용하여 제조자 방법에 따라 진행되었다. IL-1β의 양을 측정하기 위해 Mouse IL-1β ELISA kit (Sigma Aldrich)를 이용하여 제조자 방법에 따라 시료를 준비하여 실시예 4와 동일한 과정으로 분석하였다.
측정된 IL-1β의 분석 결과를 도 7에 나타내었다. 우울증이 유도된 마우스(PBS+STR)의 뇌에서는 정상 마우스(PBS)의 뇌에 비해 염증성 싸이토카인인 IL-1β 의 농도가 증가하였으나, KBL396 투여군(KBL396 및 KBL396+STR)의 뇌에서는 스트레스 노출 여부에 상관없이 정상 대조군과 유사한 수준으로 IL-1β 의 농도가 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. KBL396 균주 투여에 따른 스트레스 유발 면역 불균형 조절 효과
CD4+ T 세포는 항염증, CD8+ T 세포는 염증 촉진에 기여하는 것으로 인식되고 있으며 이들의 상대비인 CD4/CD8 T cell ratio의 감소는 감염 저항성의 감소 및 면역노화와 같은 면역 불균형을 초래한다. 또한, 조절 T 세포(regulatory T cells, Treg)는 면역계의 과도한 반응을 막기 위한 면역 조절의 역할을 담당한다. 이와 같이 T 세포들에 의해 조절되는 면역의 불균형이 초래될 경우 염증 반응이 나타나게 되며, 특히 신경 및 뇌에서의 염증 반응은 치매 등 퇴행성 뇌질환 및 우울증 등을 유발할 가능성이 높다. KBL396 균주가 면역 조절에 관여하는 T 세포들에 어떤 영향을 끼치는지 확인하기 위해 실시예 5의 마우스의 비장 (spleen) 조직 및 장간막림프절 세포로 유세포분석(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 수행하였다.
조직은 희생 시 10% inactivated FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에 담아 ice에 보관하였다. 세포의 손실을 막기 위해 희생 직후 샘플링한 조직을 70μm cell strainer에 걸러 단일 세포들을 얻은 뒤, trypan blue를 통해 염색하여 살아있는 세포의 수를 정량하였다. 이후 1x107 개의 세포를 96well 에 옮긴 뒤 확인하고자 하는 면역마커를 표적으로 하는 형광 항체를 붙여주었다. 여기에 사용된 면역마커는 각각 FITC-conjugated anti-mouse CD3, PerCP-Cy5.5-conjugated anti-mouse CD4, PE-conjugated anti-mouse CD8, PE-conjugated anti-mouse FOXP3, APC-conjugated anti-mouse CD25 monoclonal antibodies (이상 eBioscience) 이다. 이후 BD FACSVerse™(BD bioscience)를 통해 유세포분석을 수행하였고, Flowjo software (BD bioscience)를 사용하여 면역세포를 분석하였다.
유세포 분석 결과를 도 8에 제시하였다. 스트레스에 노출된 마우스 (PBS+STR)는 정상 마우스 (PBS)에 비해 비장 조직의 CD4/CD8 T 세포 비율이 감소하여 염증에 취약해졌으나, KBL396 균주를 투여시 (KBL396+STR) 비율이 유의하게 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 8A). 또한, 장간막림프절의 조절 T 세포의 양 역시 스트레스 노출에 따라 감소하였으나 (PBS+STR), KBL396 균주를 투여시 (KBL396+STR) 스트레스를 받지 않은 마우스에 유사하게 회복됨을 확인 할 수 있었다 (도 8B). 따라서 스트레스 노출에 따른 면역 불균형이 KBL396 균주 투여로 완화될 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. KBL396 균주의 탄소원 이용능 및 효소 활성 확인
락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주의 생리학적 특성 중 탄소원 이용성을 API Kit(모델명 : API 50 CHL; 제조사 : BioMerieux's, USA)에 의한 당 발효 시험으로 분석하였고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에서 "+"는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타낸다.
또한, 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주의 생리학적 특성 중 효소 활성을 API Kit(모델명 : API-ZYM CHL; 제조사 : BioMerieux's, USA)에 의한 효소 활성 실험으로 분석하였고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 하기 표 4에서 "+"는 효소 활성이 있는 경우를 나타낸다.
Figure 112019012904011-pat00001
Figure 112019012904011-pat00002
실시예 10. KBL396 균주의 제제
발효기를 가동하여 확보한 KBL396 균주를 원심분리기를 이용하여 수확한 후, 남은 배지 상층액을 폐기하고 1X PBS (phosphate buffer saline)으로 세척함으로써 배양액의 잔여물들을 제거하였다. 안정적인 동결건조를 위한 제형(CPA)으로 탈지유, 수크로즈 및 솔비톨(제형 총중량에 대하여 skim milk 11% + sucrose 4.29% + sorbitol 5.69%)으로 처리하였으며 음성대조군으로 1X PBS를 처리하여 동결건조를 진행하였다. 원심분리기로 수확한 균주는 제거한 상층액의 20배로 농축하여 동결보호제(CPA)를 처리하였으며 overnight -80℃로 24시간 동결한 후, 완료된 균주는 2차에 걸친 세밀 분쇄를 진행하고 생존율을 확인하였다. 동결건조 시의 생존율은 동결 전과 동결건조 후의 CFU 계수 결과로 확인하였다.
그 결과 도 9와 같이, 1X PBS를 처리한 결과 25.8%의 생존율을 보인 반면 CPA를 처리하였을 때는 95%의 생존율을 보여 동결건조에 따른 생존율의 확연한 증가 효과를 확인할 수 있었다.
락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주의 수탁 정보
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP를 2017년 5월 29일에 공인기탁기관인 한국생물자원센터(주소 : 대한민국 56212 전라북도 정읍시 입신길 181 한국 생명공학연구원)에 특허기탁하여 KCTC13278BP의 수탁번호를 부여받았다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13278BP
수탁일자 : 20170529
<110> Ko BioLabs, Inc. <120> Lactobacillus Plantarum KBL 396 and Use Thereof <130> P19-B033 <150> KR 10-2018-0013366 <151> 2018-02-02 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1492 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 1 tatcagtacg tgctataatg cagtcgacga ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga 60 tttacatttg agtgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg 120 gggataacac ctggaaacag atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag 180 cttgaaagat ggcttcggct atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt 240 ggggtaacgg ctcaccatgg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat 300 tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 360 gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc 420 tgttgttaaa gaagaacata tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag 480 aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540 ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg 600 gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa 660 ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 720 gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc 780 ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg 840 ctgcagctaa cgcattaagc attccgcctg ggggagtacg gcccgcaagg ctgaaactca 900 aaggaattga cggggggccc gcacaagcgg tgggagcatg tgggtttaat tcaaagctac 960 gcgaagaaac cttacccagg ttttgacata ctaatgcaaa ttctaaagag attagaacgt 1020 ttcccttccg gggacatggg ataccgggtg ggtgcatggg ttggtcgtca gcttcgtggt 1080 cgtgagaatg tttgggttta agttccccga aacgagcgca acccttatta tcagttgcca 1140 gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1200 cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa 1260 cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggattgta 1320 ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1380 tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc 1440 aaagtcggtg gggtaacctt tagaaccagc cgcctaatgg caccaccatg cg 1492 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tph-1 F Primer <400> 2 ggctttgagg tcctctttcc a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tph-1 R Primer <400> 3 ccccctttct gaggaatggt c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tph-1A F Primer <400> 4 accctgggat gtgcttcatg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tph-1A R Primer <400> 5 gcgttctgca aagcaacaga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat B-actin F Primer <400> 6 cagccttcct tcctgggtat g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat B-actin R Primer <400> 7 tagagccacc aatccacaca g 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPH-2f Primer <400> 8 cagtccacga agatttcgac tt 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPH-2r Primer <400> 9 gcaagacagc ggtagtgttc t 21

Claims (13)

  1. 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 정신 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 정신 장애는 우울증, 불안장애, 및 스트레스로 인한 긴장으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP는 서열번호 1로 표시되는 16s rDNA 서열을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP는 세로토닌 분비 증가, 및 염증성 사이토카인 IL-1β 발현 억제로 구성된 군으부터 선택되는 어느 하나 이상의 특성을 나타내는 것인, 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 동결건조제를 더 포함하는 약학 조성물.
  10. 락토바실러스 플란타럼 KBL396 (Lactobacillus plantarum KBL396) KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 정신 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 정신 장애는 우울증, 불안장애, 및 스트레스로 인한 긴장으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 식품 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 적어도 하나 이상의 부형제 및/또는 동결건조제를 더 포함하는 식품 조성물.
  12. 락토바실러스 플란타럼 KBL396 KCTC13278BP 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 동물의 정신 장애의 예방 또는 개선용 동물 사료용 첨가제로서,
    상기 정신 장애는 우울증, 불안장애, 및 스트레스로 인한 긴장으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 동물 사료용 첨가제.
  13. 제12항에 있어서, 적어도 하나 이상의 부형제 및/또는 동결건조제를 더 포함하는 동물 사료용 첨가제.
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