ES2624673T3 - Bacteria ácido láctica, composición que la contiene y su uso - Google Patents

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Abstract

Una bacteria ácido láctica aislada, que es Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128 y que está depositada en la DSMZ con el N.º de Referencia DSM 28632.

Description

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DESCRIPCION
Bacteria acido lactica, composicion que la contiene y su uso Antecedentes de la invencion
1. Campo de la invencion
Esta invencion se refiere una bacteria acido lactica, y mas en particular se refiere a una nueva cepa de bacteria acido lactica para la profilaxis o el tratamiento de un trastorno inducido por estres o un trastorno gastrointestinal funcional en un sujeto.
2. Descripcion de la tecnica relacionada
Los trastornos gastrointestinales funcionales (TGIF) son el problema mas comun en la especialidad de la gastroenterologla. Se dan como resultado de un funcionamiento anomalo del tracto GI, y se definen mediante complejos sintomaticos abdominales cronicos, tales como dolor abdominal, diarrea, estrenimiento, e hinchazon. De acuerdo con los criterios de Roma III, se han identificado mas de 20 trastornos GI funcionales. Los TGIF incluyen, pero no se limitan a, dolor abdominal funcional, slndrome del intestino irritable (SII), estrenimiento, diarrea funcional y dispepsia funcional.
El slndrome del intestino irritable es un trastorno gastrointestinal funcional. Aproximadamente el 4-30 % de las personas en todo el mundo padecen SII. El SII se ha caracterizado por dos slntomas principales: dolor abdominal (dolor cronico) y alteracion de los habitos intestinales. De acuerdo con el slntoma predominante, el SII se puede clasificar dentro de cuatro subgrupos: SII con diarrea (SII-D), SII con estrenimiento (SII-E), SII mixto (SII-M), y SII no subtipificado (SII-NS). En los pacientes con SII, aproximadamente el 30 % de los pacientes padecen SII tras una inflamacion gastrointestinal, y aquellos pertenecen a un SII posinfeccioso/inflamatorio. Ademas, el factor principal en la motivacion de los pacientes para buscar atencion medica y que causa una reduccion significativa en la calidad de vida es el dolor abdominal, que se asocia a hipersensibilidad visceral (HV). La hipersensibilidad visceral se considera que es uno de los principales mecanismos que causan trastornos gastrointestinales funcionales. Ademas, los estudios recientes muestran que la hipersensibilidad visceral es altamente especlfica para el SII.
La hipersensibilidad visceral se define como el aumento de la intensidad de la sensibilidad y la disminucion de los umbrales para el dolor visceral en los pacientes. La HV persistente se asocia a una sensibilizacion neuronal, que se manifiesta como un aumento en la excitabilidad neuronal. Los neurotransmisores, tales como serotonina (5- hidroxitriptamina, 5-HT), desempenan papeles importantes en la sensibilizacion neuronal. La serotonina es un neurotransmisor monoamina. Un estudio previo ha demostrado que, en ratas despiertas, con una inyeccion subcutanea de 5-hidroxitriptofano (5-HTP), un precursor de serotonina, se inducla la HV. El sitio predominante de slntesis y almacenamiento de serotonina son las celulas enterocromafines de la mucosa intestinal. La serotonina liberada por las celulas enterocromafines activa los reflejos neurales asociados a la secrecion, la motilidad, y la sensibilidad intestinal. Segun estudios cllnicos, los pacientes con SII estan normalmente acompanados de una anomalla del metabolismo de serotonina. Ademas, se han usado antagonistas del receptor de serotonina de manera amplia como un farmaco terapeutico, indicando que la patologla del SII se asocia a la serotonina.
La disminucion del umbral de dolor en una prueba de distension rectal, que representa una hipersensibilidad visceral, es un sello distintivo de los pacientes con SII. En estudios con animales, el umbral de dolor colorrectal se puede controlar mediante senales de electromiografla (EMG) que responden a una distension barostatica, y una mayor respuesta de la senal EMG representa una mayor sensibilidad al dolor. Ademas de HV, se ha demostrado un aumento de la expresion de la sustancia P en la medula espinal como un biomarcador que representa sensibilidad dolorosa visceral durante la distension colorrectal en un modelo de rata con SII.
Hay diversos metodos terapeuticos para mejorar los slntomas del SII, que incluyen, como antagonistas del receptor de la serotonina, farmacos antidepresivos, farmacos procineticos, farmacos antiespasmodicos y probioticos. Los probioticos son microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio en la salud del hospedador. Debido a la ausencia de efectos secundarios farmacologicos, parece que los probioticos son un metodo posible para el tratamiento del SII. Ademas, se ha descrito que los probioticos especlficos confieren efectos beneficiosos en los slntomas de estrenimiento.
El estrenimiento, un trastorno gastrointestinal funcional en todo el mundo, se define como el paso infrecuente o diflcil de las deposiciones. El estrenimiento tiene varias causas, que incluyen compuestos qulmicos, habitos dieteticos, composicion de la flora intestinal, embarazo, y estres psicologico. Aunque se han identificado muchos tipos de farmacos purgantes, la mayorla de estos farmacos tienen posiblemente efectos secundarios adversos tales como la tolerancia inducida, la melanosis coli, o el colon catartico. Existe una disbiosis de la flora intestinal en pacientes con estrenimiento, que se puede mejorar mediante el consumo de probioticos. Ademas, las bacterias probioticas, especialmente lactobacilos y bifidobacterias, pueden disminuir el pH del colon, produciendo acido lactico, acido acetico, y otros. Un pH mas bajo tiende a aumentar el peristaltismo del colon y, en consecuencia, a disminuir el
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tiempo de transito del colon, con un efecto beneficioso en el tratamiento de los slntomas de estrenimiento.
Los probioticos pueden hacer que el huesped obtenga beneficios saludables al mantener el equilibrio de la flora intestinal, reforzando la funcion de barrera mucosa y modulando el sistema inmunitario. Existen muchas pruebas que indican que los probioticos pueden actuar como una forma terapeutica de enfermedades, incluyendo enfermedades infecciosas, alergia, cancer y enterocolitis necrosante. Vale la pena investigar adicionalmente el uso de probioticos en el tratamiento de trastornos gastrointestinales funcionales.
Entre estas, las bacterias acido lacticas (en lo sucesivo en el presente documento denominadas a veces BAL), las especies microbianas mas importantes que se usan como probioticos, se han reconocido como alternativas de prevencion o tratamiento para la salud intestinal debido a su competencia para regular la microbiota intestinal del hospedador. Ademas, en los ultimos anos, tambien aparecen mas pruebas de que las BAL son capaces de alterar las respuestas mentales y flsicas del hospedador frente al estres psicologico.
El estres es uno de los factores que inducen trastornos anlmicos y cambios neuroqulmicos, tanto en seres humanos como en animales. Los roedores sometidos a natacion forzada como un factor estresante agudo a menudo muestran una inmovilidad aumentada en la repeticion de la prueba al dla siguiente. Los estudios han demostrado que roedores expuestos a estres por privacion materna durante los primeros anos de vida, llevan a multiples anomallas que incluyen inflamaciones intestinales, comportamientos parecidos a la ansiedad y a la depresion en la edad adulta, funcion deteriorada del eje hipotalamico-hipofisario-adrenal (HHA), y neurotransmisores alterados en comparacion con sus controles de crianza normal. Los trastornos inducidos por estres incluyen, pero no se limitan a, ansiedad, depresion y slndrome del intestino irritable.
El tratamiento de los trastornos inducidos por estres mediante BAL puede ser un suplemento, aunque los medicamentos psiquiatricos convencionales como BAL han demostrado que tienen una influencia en el eje cerebro- intestino (ECI) del hospedador. Se demostro que los ratones libres de germenes carecen de un aumento de la actividad motora y una disminucion de la ansiedad ha puesto el enfasis en el papel clave de la microbiota intestinal normal en el desarrollo cerebral. Un estudio previo demostro que Lactobacillus rhamnosus alteraba las funciones del sistema nervioso central en ratones sanos a traves del nervio vago, y las ratas separadas de su madre con la cepa probiotica Bifidobacterium infantis hablan invertido los deficits conductuales en la prueba de natacion forzada (PNF) y hablan restablecido el nivel basal de noradrenalina (NA) en el tronco encefalico. Los estudios mencionados anteriormente sostienen que se pueden desarrollar probioticos como tratamiento para los trastornos psiquiatricos y neurotransmisores.
Muchos estudios han demostrado que los metodos de production y fabrication y el vehlculo de alimentos pueden influir en las propiedades de las cepas probioticas, y que tienen un impacto en los resultados de estudios de intervention cllnica. En el presente documento, los autores de la invention identificaron una cepa de bacteria acido lactica que mostraba la posibilidad de prevenir o tratar trastornos psiquiatricos y trastornos gastrointestinales funcionales.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona una bacteria acido lactica aislada, que es Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128 (en lo sucesivo en el presente documento denominada a veces PS 128) y que esta depositada en la DSMZ con el N.° de Referencia DSM 28632.
En un aspecto de la presente solicitud, se proporciona una composition que comprende Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128 y un vehlculo.
En una realization, el vehlculo es un excipiente o un diluyente fisiologicamente aceptables. Los ejemplos de excipientes o diluyentes fisiologicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, lactosa, almidon, dextrina, ciclodextrina, carboximetil almidon de sodio, propionato de almidon carboxilado, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, maltodextrina y estearato de magnesio.
En un aspecto de la presente solicitud, se proporciona un metodo para prevenir o tratar un trastorno inducido por estres o un trastorno psiquiatrico en un sujeto, que comprende una etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128. Preferentemente, el trastorno inducido por estres o el trastorno psiquiatrico se selecciona del grupo que consiste en ansiedad, depresion y slndrome del intestino irritable.
En una realizacion adicional de la presente solicitud, tras la administration de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128, disminuyo estadlsticamente de forma significativa el nivel de corticosterona serica en el sujeto. Ademas, tras la administracion de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128, aumento estadlsticamente de forma significativa el nivel de neurotransmisor en el sujeto. Preferentemente, el neurotransmisor es dopamina.
En un aspecto de la presente solicitud, se proporciona un metodo para prevenir o tratar un trastorno gastrointestinal funcional en un sujeto que comprende una etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de Lactobacillus
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En otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para prevenir o tratar la hipersensibilidad visceral en un sujeto que comprende una etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128. Preferentemente, la hipersensibilidad visceral se asocia a un trastorno gastrointestinal funcional.
En una realizacion, el trastorno gastrointestinal funcional se selecciona entre el grupo que consiste en dolor abdominal funcional, slndrome del intestino irritable, estrenimiento, diarrea funcional y dispepsia funcional. En una realizacion preferente, el trastorno gastrointestinal funcional es dolor abdominal funcional, slndrome del intestino irritable o estrenimiento.
En otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para prevenir o tratar el dolor abdominal funcional, el slndrome del intestino irritable o el estrenimiento en un sujeto, que comprende una etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128.
En una realizacion adicional de la presente solicitud, tras la administration de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128, disminuyo estadlsticamente de forma significativa el nivel de un biomarcador de sensibilidad dolorosa en el sujeto. Preferentemente, el biomarcador es la sustancia P. Ademas, tras la administracion de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128, una senal de electromiografla disminuye estadlsticamente de forma significativa en el sujeto.
En una realizacion preferente, la bacteria acido lactica aislada se administra por via oral al sujeto.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es una fotografla de electroforesis que muestra los perfiles de ERIC-PCR de cepas de Lactobacillus plantarum, en donde M representa la escalera de ADN; DSM 27445 representa Lactobacillus plantarum subsp. plantarum; ATCC 14917T representa Lactobacillus plantarum subsp. plantarum; y ATCC 17638T representa Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis.
Las Figuras 2A y 2B muestran que la PS 128 aumenta la distancia total recorrida en la prueba de campo abierto y normaliza el comportamiento de tipo depresivo en la prueba de natation forzada de los ratones (*p<0,05 en comparacion con el grupo control; $p<0,05 en comparacion con el grupo de estres).
La Figura 3 muestra la concentration de corticosterona serica (*p<0,05 en comparacion con el grupo control; $p<0,05 en comparacion con el grupo de estres).
Las Figuras 4A a 4C muestran alteraciones de PS 128 en la ruta dopaminergica de la corteza prefrontal de ratones (*p<0,05 en comparacion con el grupo control; $p<0,05 en comparacion con el grupo de estres).
La Figura 5A muestra un cronograma experimental para evaluar el efecto de PS 128 en la hipersensibilidad visceral inducida por 5-HTP y la Figura 5B muestra los procedimientos experimentales de la prueba de hipersensibilidad visceral.
Las Figuras 6A a 6C muestran las senales de electromiografla (EMG) que responden a una estimulacion de DCR (n=8, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,0001, basal frente a 5-HTP).
La Figura 7 muestra el analisis de transferencia de western del nivel de la sustancia P al nivel L6-S1 de la medula espinal, que se aislo de una rata con o sin administracion de PS 128 (n=3, ***p<0,0001).
Las Figuras 8A y 8B muestran los efectos de la PS 128 administrada por via oral en el peso de las deposiciones en ratones normales (A) y estrenidos de forma experimental (n=6, **p<0,01, *p< 0,05).
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
Los siguientes ejemplos se usan para ilustrar la presente invencion. Un experto en la materia puede concebir facilmente las otras ventajas y efectos de la presente invencion. La presente invencion tambien se puede implementar mediante diferentes casos especlficos que se promulguen o se apliquen, los detalles de las instrucciones tambien se pueden basar en diferentes perspectivas y aplicaciones en diversas modificaciones y los cambios no se alejan del esplritu de la creation.
Se han usado muchos ejemplos para ilustrar la presente invencion. Los ejemplos presentados a continuation no deben tomarse como un llmite para el alcance de la invencion.
Ejemplos
EJEMPLO 1. Aislamiento de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128 y discrimination de las nuevas cepas bacterianas usando perfiles ERIC-PCR
Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128 se aislo de fu-tsai, productos tradicionales de mostaza fermentada de Taiwan.
La ERIC-PCR se realizo para distinguir adicionalmente las subespecies de bacterias con alta similitud de secuencia.
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El perfil ERIC-PCR de las cepas de Lactobacillus plantarum se llevo a cabo con las condiciones indicadas en la Tablas 1 y 2. Como moldes se usaron los ADN extraidos de PS 128 y de tres cepas de Lactobacillus plantarum. Los productos de amplification obtenidos se sometieron a electroforesis y los patrones se compararon tal como se muestra en la Figura 1, en donde se usaron los cebadores representados por la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.
ERIC1R: (5’- ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC -31) SEQ ID NO: 1 ERIC2: (5’- AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG -3’) SEQ ID NO: 2
Tabla 1. Composition de la solution de reaction de la PCR (25 pl por tubo de PCR)
Componente
Volumen
ddH2O
16,3 pl
Tampon de PCR 10x
2,5 pl
dNTP
2,0 pl
MgCl2 (25 mM)
1,0 pl
cebador (GTG)5 (10 pM)
2,0 pl
rTaq polimerasa
0,2 pl
molde de ADN (10 pM)
1,0 pl
Tabla 2. Condiciones de la PCR
Temperatura
Tiempo Ciclo
94 °C
5 min
94 °C
30 s 35 ciclos
45 °C
1 min
65 °C
6 min
65 °C
10 min
Tal como se muestra en la Figura 1, el carril M representa la escalera de ADN (250-10000 pb); DSM 27445 representa Lactobacillus plantarum subsp. plantarum; ATCC 14917T representa Lactobacillus plantarum subsp. plantarum; y ATCC 17638T representa Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis.
Tal como se indica mediante flechas blancas, las bandas de la PS 128 son unicas en position entre las de DSM 27445, ATCC 1491 7T o ATCC 17638T y por lo tanto, el resultado de la Figura 1 muestra que aunque la PS 128, DSM 227445 y ATCC 14917T pertenecen todas a Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, son, no obstante, diferentes cepas bacterianas. Por consiguiente, la PS 128 representa una nueva cepa de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum.
Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128 se ha depositado bajo el Tratado de Budapest en el Leibniz Institute DSMZ- Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares (Inhoffenstr. 7 B, D-38124 Braunschweig, Alemania) el 31 de marzo de 2014 y la Autoridad Depositaria Internacional la ha otorgado el Numero de Referencia DSM 28632 de la DSMZ. Este material biologico se sometio a la prueba de viabilidad y la ha superado.
EJEMPLO 2. Tipificacion del Indice Analrtico de Perfil (API, siglas del ingles Analytical Profile Index)
La utilization de azucar para la PS 128 usada en la presente invention se investigo usando el kit API 50 CHL (bioMerieux, Francia), y los resultados se muestran en la Tabla 3. La prueba de fermentation indica que la PS 128 alberga una propiedad bioqmmica similar a la de Lactobacillus plantarum subsp. plantarum.
Tabla 3: Resultados de la prueba de fermentaciona
Tiras de sustrato de hidratos de carbono
PS 128
CONTROL
Glicerol
Eritritol
D-Arabinosa
L-Arabinosa
+
D-Ribosa
+
D-Xilosa
+
L-Xilosa
D-Adonitol
Metil-p-D-Xilopiranosido
D-Galactosa
+
D-Glucosa
+
D-Fructosa
+
D-Manosa
+
L-Sorbosa
-
L-Ramnosa
+
Dulcitol
-
Inositol
-
D-Manitol
+
D-Sorbitol
+
Metil-a-D-manopiranosido
+
Metil-a-D-glucopiranosido
-
N-Acetil glucosamina
+
Amigdalina
+
Arbutina
+
Citrato ferrico de esculina
+
Salicina
+
D-Celobiosa
+
D-Maltosa
+
D-Lactosa (origen bovino)
+
D-Melibiosa
+
D-Sacarosa (sacarosa)
+
D-Trehalosa
+
Inulina
+
D-Melezitosa
+
D-Rafinosa
+
Amidon (almidon)
-
Glucogeno
-
Xilitol
-
Gentiobiosa
+
D-Turanosa
+
D-Lixosa
-
D-Tagatosa
+
D-Fucosa
-
L-Fucosa
-
D-Arabitol
-
L-Arabitol
-
Gluconato de potasio
+
2-cetogluconato de potasio
-
5-cetogluconato de potasio
-
a- +, positivo; -, negativo;
EJEMPLO 3. Alternancias de comportamientos, niveles de hormona de estres y de neurotransmisores en ratones estresados mediante Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128
5 (1) Preparacion de la PS 128
Se inoculo la PS 128 en medio de cultivo (leche desnatada al 10 %, levadura en polvo al 1 %, tween 80 al 0,1 %, y glucosa al 2 %), se cultivo a 37 °C durante 18 horas y se recogio mediante centrifugacion. La PS 128 se embebio y se liofilizo con agentes protectores (leche desnatada al 1 %, azucar al 2 %, oligofructosa al 2 %, maltodextrina al 10 3 %, y glicerol al 2 %) y excipientes a una concentracion final de 1x 1011 unidades formadoras de colonias (UFC) por
gramo de polvo. El polvo de la PS 128 se almaceno a -20 °C y se almaceno a -20 °C hasta su uso.
(2) Animales y alojamiento
15 Se adquirieron machos C57BL/6JNarl o hembras C57BL/6JNarl con fecha de gestacion controlada, de ocho semanas de vida, procedentes del National Laboratory Animal Center (NLAC, Taipei, Taiwan) y se alojaron en jaulas con filtro en la parte superior con dieta alimenticia (LabDiet Autoclavable Rodent Diet 5010, PMI Nutrition International, Brentwood, Ee.UU) y agua a voluntad en una sala especlfica libre de patogenos en el Laboratory Animal Center, de la National Yang-Ming University en condiciones estandar (temperatura de 22 °C, humedad al 5020 60 % y un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad) durante aproximadamente una semana hasta la entrega. Todos los
procedimientos experimentales con animales fueron revisados y aprobados por el Comite de Gestion de Animales de la National Yang-Ming University.
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(3) Estres en los primeros anos de vida
El estres por privacion materna durante los primeros anos de vida en un ambiente hipotermico se modified a partir de estudios previos (Millstein y Holmes 2007, Desbonnet, Garrett et al. 2010). En resumen, los neonatos se separaron de sus madres y de sus companeros de camada 3 horas (11:00-14:00) al dla entre los dlas posnatales (DP) 2-14 a temperatura ambiente (~22 °C). Las siguientes 2 semanas no se les molesto salvo para acondicionar la jaula una vez por semana, las crlas estresadas se destetaron y se asignaron aleatoriamente 5-6 ratones por jaula. Solo se usaron las crlas macho para el experimento (n=12 para los grupos de estres, n=12 para el estres+109). Los ratones que no se sometieron a estres en los primeros anos de vida sirvieron como grupos de control (control, n=10).
(4) Diseno experimental y muestreo
A los ratones se les administro solucion salina o PS 128 (109 UFC en 0,2 ml de solucion salina/raton/dla) durante 4 semanas a partir del destete (DP28) hasta las 8 semanas de vida. Se sometieron a una baterla de pruebas conductuales que inclulan la PCA y la PNF secuenciadas desde las menos hasta las mas estresantes llevadas a cabo en fase de luz. El dla del sacrificio, los ratones se sometieron a una extraccion de sangre retro-orbital seguida de una dislocation cervical que tuvo lugar entre las 11:00 y las 14:00 horas para minimizar los efectos del ritmo circadiano. El cerebro se extrajo rapidamente y la region especlfica de la corteza prefrontal se disecciono en hielo y se congelo en nitrogeno llquido o se preservo en tampon de acido perclorico al 0,6 %, despues se almaceno a - 80 °C hasta su uso.
(5) Prueba de campo abierto (PCA)
La prueba de campo abierto (PCA) es una medida comun del comportamiento exploratorio y la actividad general tanto en ratones como en ratas, en la que se puede medir tanto la calidad como la cantidad de actividad.
Se controlo y calculo la actividad locomotora mediante un sistema de actividad de campo abierto (Tru Scan activity system, Coulbourn Instruments, PA, EE.UU) compuesto por una palestra (25,4 x 25,4 x 38 cm) con dos anillos sensores de haz fotonico fuera de la pared de plexiglas. Se coloco a cada raton en la misma esquina de la palestra durante 10 minutos para medir varias actividades, incluyendo la distancia total recorrida. La caja se lavo con agua y etanol al 70 % despues de cada carrera, y se devolvio al raton a su jaula. Las actividades se grabaron de forma automatica y se cuantificaron con el programa informatico Tru Scan 2.2 (Coulbourn Instruments).
(6) Prueba de natation forzada (PNF)
La prueba de natacion forzada es una prueba conductual en roedores que se utiliza para evaluar farmacos antidepresivos, la eficacia antidepresiva de nuevos compuestos y las manipulaciones experimentales que se enfocan a interpretar o a prevenir estados de tipo depresivo.
Las PNF se evaluaron tal como se describe anteriormente (Cryan, Dalvi et al. 2001) con modificaciones. En resumen, la inmovilidad se calculo durante 4 minutos (1-5 minutos) de una unica prueba de natacion forzada de 6 minutos, en la que los ratones se pusieron en un cilindro acrllico transparente (30 cm de alto x 10 cm de diametro interno, que contenla 15 cm de profundidad de agua con una temperatura ajustada a 23 ± 1 °C), se grabaron con una camara y se analizaron adicionalmente con un programa informatico de seguimiento de video EthoVision (Noldus Information Technology, Wageningen, Palses Bajos). Los ratones se secaron con papel de seda tras la prueba y se devolvieron a su jaula. La inmovilidad se calculo durante 1 a 5 minutos con los mismos parametros para evitar errores humanos.
Tal como se muestra en las figuras 2A a 2B, en la PCA, los ratones estresados hablan recorrido una distancia total similar en comparacion con los del control (Figura 2A) mientras que tenlan un mejor tiempo de inmovilizacion en la PNF (Figura 2B). La administration de la PS 128 a los ratones estresados aumento de manera significativa la distancia total recorrida en la PCA y disminuyo la inmovilidad en la PNF (Figuras 2A y 2B) a grados similares a los de los ratones control. *p<0,05 en comparacion con el grupo control; $p<0,05 en comparacion con el grupo de estres.
(7) Determination de la corticosterona serica
El nivel de corticosterona en plasma es un indicador de la activation del eje hipotalamico-hipofisario-adrenal, la respuesta basica en la interaction cuerpo-cerebro con estres o miedo.
El suero se obtuvo de muestras de sangre centrifugadas a 4 °C, 3000xg durante 10 minutos que se extrajeron de los ratones antes del sacrifico. El suero se diluyo de manera apropiada y despues se aplico a un kit comercial CORT EIA (Cayman, EE.UU), las concentraciones se interpolaron mediante patrones proporcionados en el kit.
Tal como se muestra en la Figura 3, midiendo el nivel serico, los inventores descubrieron que la cortisona estaba significativamente elevada en los ratones estresados y se invirtio mediante la administracion de PS 128 (estres+109).
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*p<0,05 en comparacion con el grupo control; $p<0,05 en comparacion con el grupo de estres.
(8) Cuantificacion de monoaminas y sus metabolitos mediante HPLC-ECD
La HPLC-ECD tiene un alto rendimiento para las mediciones habituales de muestras biologicas o ambientales, tales como catecolaminas (dopamina, norepinefrina, y epinefrina), monoaminas (por ejemplo, serotonina, dopamina, norepinefrina, y epinefrina) acetilcolina, glutamato, glicina, GABA, y otros.
Los neurotransmisores a medir incluyen dopamina (DA) y sus metabolitos, acido dihidroxifenilacetico (DC) y acido homovanllico (AHV). El sistema de cromatografla llquida de alto rendimiento con detector electroqulmico (HPLC- ECD, siglas del ingles high performance liquid chromatography-electrochemical detector) comprende una microbomba (CMA-100, CMA, Stockhom, Suecia), un inyector en llnea (CMA-160), una bomba Microtech LC- (Microtech Scientific, Sunnyvale, CA), y un detector electroqulmico BAS-4C (Bioanalytical Systems, Inc., West Lafeyette, IN) tal como se describe anteriormente (Cheng, Kuo et al. 2000). Para el analisis se uso una columna de fase inversa (Kinetex C18, 2,6 pm, 100 x 2,1 mm D.I., Phenomenex, EE.UU). El potencial para el electrodo de trabajo de carbono vltreo se configuro a +650 mV con respecto a un electrodo de referencia de Ag/AgCl a temperatura ambiente (25 °C). La fase movil que contenla NaH2PO4, 0,1 M, metanol al 8 %, SOS 0,74 mM, EDTA 0,03 mM y KCl
2 mM, se ajusto a pH 3,74 con H3PO4. Los cerebros completos se congelaron en hielo seco inmediatamente despues de extraerlos de los ratones con dislocacion cervical. La corteza prefrontal se disecciono y se preservo en tampon de acido perclorico al 0,6 % y se almaceno a -80 °C hasta su homogeneizado por ultrasonido y se centrifugo a 12000xg, 10 minutos. Los sobrenadantes se filtraron con una membrana de PVDF de 0,22 m (filtro de jeringa de 4 mm, Millex-GV, Millipore, EE.UU) antes de analizar. Los sobrenadantes diluidos de forma adecuada se inyectaron (20 pl) en el sistema cromatografico a un caudal de 0,2 ml/min. Las concentraciones de monoaminas se interpolaron mediante los siguientes patrones: DA, DC y AHV (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU) que variaban de 1 a 100 ng/ml.
Tal como se muestra en las Figuras 4A a 4C, aplicando el protocolo de estres en los primeros anos de vida, se alteraron los neurotransmisores en la corteza prefrontal. En la ruta dopaminergica, la propia dopamina se redujo y el nivel de su metabolito, DC, fue similar al del grupo control (Figuras 4A y 4B) mientras que el otro metabolito, AHV, disminuyo de manera significativa (Figura 4C). La administracion de PS 128 aumento de manera significativa los niveles de dopamina, DC y AHV de los ratones estresados (Figuras 4A a 4C). *p<0,05 en comparacion con el grupo control; $p<0,05 en comparacion con el grupo de estres.
EJEMPLO 4. Alternancias de la hipersensibilidad visceral y de los niveles de sustancia P en ratas mediante Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128
Un estudio previo ha demostrado que, en ratas despiertas, con una inyeccion subcutanea de 5-hidroxitriptofano (5- HTP), un precursor de serotonina, se inducla la HV. En este estudio, el modelo de HV inducida por 5-HTP se uso para evaluar los efectos de mejora de una cepa probiotica, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128, en ratas.
(1) Preparacion de PS 128
Se inoculo PS 128 en medio de cultivo (leche desnatada al 10 %, levadura en polvo al 1 %, tween 80 al 0,1 %, y glucosa al 2 %), se cultivo a 37 °C durante 18 horas y se recogio mediante centrifugacion. La PS 128 se embebio y se liofilizo con agentes protectores (leche desnatada al 1 %, azucar al 2 %, oligofructosa al 2 %, maltodextrina al
3 %, y glicerol al 2 %) y excipientes a una concentracion final de 1x1011 unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de polvo. El polvo de la PS 128 se almaceno a -20 °C y se disolvio en 5x109 UFC/ml en solucion salina antes del tratamiento animal.
(2) Animales y alojamiento
Se adquirieron ratas Sprague-Dawley (SD) macho de seis a ocho semanas de vida (220 a 330 g) procedentes del National Laboratory Animal Center (NLAC, Taipei, Taiwan). Las ratas se alojaron con una temperatura y humedad constantes con ciclos de 12 horas de luz-oscuridad, y se les dio libre acceso a comida y agua. Todos los procedimientos experimentales con animales fueron revisados y aprobados por el Comite de Gestion de Animales de la National Yang-Ming University.
(3) Procedimiento experimental
En referencia a la Figura 5A, las ratas se anestesiaron primero con isoflurano para la implantacion del electrodo. Tras la cirugla para insertar el electrodo, las ratas se alojaron individualmente. Tras aproximadamente 7-10 dlas despues de la cirugla, las ratas se sometieron a una prueba distension colorrectal (DCR) para la deteccion de la hipersensibilidad basal y visceral inducida mediante inyeccion de 5-HTP. Esta prueba se diseno para verificar la hipersensibilidad visceral de 5-HTP en las ratas macho despiertas sin administracion de bacterias. El dla 10, a las ratas se les administro PS218 por via oral (aproximadamente 109 UFC en 0,2 ml de solucion salina al dla) o solucion
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salina (200 |jl al dla) durante dos semanas seguido de un experimento de DCR. Despues de esto, se pudo realizar otra prueba de DCR para determinar el efecto de PS 128 en la HV. El procedimiento de DCR se realizo con grabacion simultanea de electromiografla (EMG). El area bajo la curva (ABC) de la EMG se calculo como un parametro. Para detectar el nivel de protelna de la sustancia P en la medula espinal mediante transferencia de western, las ratas se anestesiaron con pentobarbital sodico (65 mg/kg, inyeccion intraperitoneal) y se perfundieron por via transcardiaca con solucion salina. Se aislo el nivel L6-S1 de la medula espinal de ratas sensibles a sensacion abdominal.
(4) Implantacion del electrodo
Las ratas se anestesiaron con isoflurano. Se implantaron electrodos fabricados con alambre de acero inoxidable recubierto de teflon (A-M systems inc.) en el musculo oblicuo externo abdominal de las ratas al menos 7 dlas antes de la experimentation. Los electrodos se exteriorizaron en la parte posterior del cuello.
(5) Prueba de distension colorrectal (DCR)
La distension colorrectal (DCR) es un metodo ampliamente usado y reproducible para evaluar la sensibilidad visceral. La medicion de las senales de electromiografla es uno de los elementos de evaluation en DCR y es el elemento de prueba cuantitativa mas preciso.
En referencia a la Figura 5B, Las pruebas de DCR se llevaron a cabo antes y despues de la inyeccion subcutanea de 5-HTP (5 mg/kg) para determinar la hipersensibilidad visceral inducida por 5-HTP.
Para la prueba de DCR, las ratas se colocaron en tuneles de plastico (6 cm de diametro, 25 cm de longitud). Durante 3 dlas antes de la prueba, las ratas se entrenaron para las condiciones experimentales colocandolas individualmente en el tunel durante 3 horas al dla. El globo de distension colorrectal (DCR) estaba compuesto de un dedo de un guante de latex (de 7 cm de longitud) unido a un cateter rectal (Medtronic Inc.). El globo se inflo y se dejo durante toda la noche para ayudar a equilibrar la tension en su pared. El dispositivo inflable se introdujo a traves del canal anal por completo en el recto en ratas conscientes y se aseguro a la base de la cola. Despues se conecto el tubo a un barostato (Medtronic Inc.). El colon se distendio inflando el globo a la presion deseada (20, 40, o 60 mm Hg) durante intervalos de 10 segundos con intervalos de 30 segundos entre las distensiones. Las distensiones se repitieron 4 veces para cada protocolo experimental con intervalos de 5 minutos entre cada serie. Con un dispositivo de EMG se grabo la respuesta a la DCR. Los analisis de la senal de EMG se trataron con Spike 2 (Cambridge Electronic Design Limited) como un reflejo visceromotor (area/s).
Tal como se muestra en la Figura 6A, el reflejo visceromotor se calculo a partir de la senal de la EMG sin procesar y aumenta de forma gradual de un modo dependiente de la presion en todos los grupos. La inyeccion subcutanea de 5-HTP aumento significativamente la senal de EMG en respuesta a la DCR con respecto a la senal basal en ratas.
Tal como se muestra en la Figura 6B, con dos semanas de administration de solucion salina, las senales de EMG todavla eran significativamente elevadas tras la inyeccion de 5-HTP mientras que las ratas con dos semanas de administracion de PS 128 pudieron inhibir el aumento de senal de EMG inducida con 5-HTP.
Ademas, para confirmar el efecto de la administracion de PS 128 sobre la inhibition del aumento de la senal de EMG, se calculo la diferencia del aumento de la EMG tras la inyeccion de 5-HTP entre el dla 10 y el dla 24. A continuation se muestra la formula de la diferencia de la EMG:
Diferencia de EMG = (La diferencia del aumento de EMG tras la inyeccion de 5-HTP el dla 24) - (La diferencia del aumento de EMG tras la inyeccion de 5-HTP el dla 10)
Tal como se muestra en la Figura 6C, tras la administracion de solucion salina, hubo mas aumento de la senal de EMG el dla 24 en comparacion con el del dla 10 en todas las estimulaciones de distension por presion. En el grupo de PS 128, sin embargo, hubo un menor aumento de la senal de EMG el dla 24 en comparacion con el del dla 10 en todas las estimulaciones de distension por presion. Estos datos indican que PS 128 tuvo una posibilidad para mejorar la HV inducida mediante inyeccion de 5-HTP.
(6) Transferencia de Western
Para confirmar el efecto de PS 128 sobre el peptido de la neurona espinal asociado a la sensibilidad dolorosa por transferencia de Western, se extrajeron las protelnas totales en el tejido del nivel L6-S1 de la medula espinal con un kit comercial de extraction de protelnas (EC21 Inc.). Las extracciones se fraccionaron en geles de poliacrilamida al 10 % y despues se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Roche Ltd.) mediante electroforesis, seguido de un bloqueo durante 1 hora con tampon de bloqueo, TBST que contenla leche desnatada al 5 %, y se incubaron con el antisuero primario de la sustancia P (1:1000; GeneTex inc.) en tampon de bloqueo durante toda una noche a 4 °C. Tras lavar dos veces con TBST, la membrana se incubo con anti-IgG de rata en cabra conjugado con HRP (1:5000; Santa Cruz Biotechnology, inc.) en tampon de bloqueo. El complejo anticuerpo-protelna se
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visualizo con el sustrato HRP quimioluminiscente de Western Immobilon™ (Millipore inc.) y se detecto con un analizador de imagenes luminiscente (FUJIFILM Holdings Corporation).
La sustancia P es un biomarcador de la sensibilidad dolorosa en la medula espinal de las ratas. Se sugirio que un nivel de expresion anomalo de la sustancia P se implica en la patogenesis del SII. Ademas, la ruta neural que contiene la sustancia P se considera como una de las rutas neurales que desempena un papel en la regulacion de la funcion gastrointestinal. Tal como se muestra en la Figura 7, en las ratas con administracion oral de solucion salina durante dos semanas se hallaron altos niveles de produccion de sustancia P en el nivel L6-S1 de la medula espinal tras la inyeccion de 5-HTP seguida del experimento de DCR, mientras que las ratas control, sin inyeccion de 5-HTP, tenlan una produccion de nivel basal. La administracion de PS 128 de dos semanas inhibio el aumento de la produccion de sustancia P inducido mediante la inyeccion de 5-HTP. Es decir, con una administracion de PS 128, se invirtio el nivel de sustancia P casi hasta el nivel de ratas sin inyeccion de 5-HTP.
EJEMPLO 5. Efecto laxante de PS 128
La loperamida es un agonista del receptor de p-opioide, que inhibe la liberacion de acetilcolina endogena como resultado de inhibiciones de adenilciclasa mediante protelna G en el plexo mienterico. Se estima que la loperamida actua de manera directa en el sistema nervioso intestinal para inducir estrenimiento y se usa con frecuencia en ratones modelo de estrenimiento.
Se examino adicionalmente el efecto laxante de PS 128 sobre la evacuacion en ratones tanto normales como con estrenimiento inducido por loperamida. A los ratones se les administro placebo por via oral (0,2 ml de solucion salina/raton/dla) o PS 128 (109 UFC en 0,2 ml de solucion salina/raton/dla). Despues de 2 semanas, se midieron los pesos humedos de las deposiciones de cada raton durante 3 horas. Para los ratones estrenidos de forma experimental, se administro clorhidrato de loperamida (5 mg/kg) por via oral, y tras 30 minutos, se inicio la medicion y se midieron los pesos humedos de las deposiciones de cada raton estrenido de forma experimental durante 3 horas. Tal como se muestra en la Figura 8, los pesos humedos de las deposiciones de los grupos de PS 128 aumentaron de forma significativa en comparacion con los de los grupos de placebo, sugiriendo de este modo el efecto laxante de PS 128. Estos resultados sugieren que PS 128 tiene la posibilidad de aliviar el estrenimiento.
EJEMPLO 6: Analisis estadlstico
Se analizaron las diferencias entre los grupos experimentales con Prism version 6 (Prism, San Diego, CA). Todos los datos presentados en el presente documento se expresaron como la media ± la desviacion tlpica (DT). El analisis estadlstico de las Figuras 2, 3, 4 y 7 se calculo mediante ANOVA de una via seguido de una prueba post-hoc de Bonferroni. Se usaron pruebas f de dos muestras para analizar la diferencia de las senales de EMG (Figura 6) y el efecto laxante de PS 128 (Figura 8). Se considero que las diferencias eran estadlsticamente significativas si p<0,05. La diferencia estadlstica entre grupos se indica con un asterisco (*) o con un slmbolo de dolar ($) si p<0,05, ** si p<0,01, *** si p<0,0001.
La presente invencion descubre una posible cepa, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128, que ejerce beneficios en ratones estresados y se ha comunicado que administrando la cepa PS 128 de Lactobacillus, mejoraron los comportamientos de los ratones.
Ademas, la presente invencion tambien descubre que la PS 128 ejerce beneficios sobre la hipersensibilidad visceral y el estrenimiento, y que la PS 128 tambien elimina el aumento de senales de EMG e inhibe la elevada produccion de sustancia P en la medula espinal de las ratas tras la inyeccion de 5-HTP.
Por lo tanto, el metodo proporcionado por la presente invencion es util para la prevencion o el tratamiento de un trastorno inducido por estres o un trastorno gastrointestinal funcional mediante la administracion de una cepa PS 128 de Lactobacillus.
Aunque algunas de las realizaciones de la presente invencion se han descrito en detalle anteriormente, es, sin embargo, posible para aquellos expertos en la materia hacer diversas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares mostradas sin alejarse sustancialmente de las ensenanzas y ventajas de la presente invencion. Tales modificaciones y cambios estan abarcados en el esplritu y alcance de la presente invencion tal como se expone en la reivindicacion adjunta.
Cada una de las referencias enumeradas a continuacion y los numeros DSMZ y ATCC citados en la solicitud se incorporan por referencia tal como si se hubieran incorporado de forma individual.
Chen CL. (2013) "Visceral hypersensitivity in non-erosive reflux disease: neurogenic overwhelming in esophagus?" Dig Dis Sci. Ago;58(8):2131-2.
Collins SM. (2007). "Translating symptoms into mechanisms: functional GI disorders." Adv Physiol Educ. Dic;31 (4):329-31.
Drossman DA. (2006). "The functional gastrointestinal disorders and the Rome III process." Gastroenterology.
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65
Abr; 130(5):1377-90.
Keohane J, Quigley EM. (2006). "Functional dyspepsia: the role of visceral hypersensitivity in its pathogenesis." World J Gastroenterol. Mayo 7;12(17):2672-6.
Moshiree B, Zhou Q, Price DD, Verne GN. (2006). "Central sensitisation in visceral pain disorders.Gut." Jul;55(7):905-8.
Bouin M, Plourde V, Boivin M, Riberdy M, Lupien F, Laganiere M, Verrier P, Poitras P. Rectal distention testing in patients with irritable bowel syndrome: sensitivity, specificity, and predictive values of pain sensory thresholds. Gastroenterology 2002; 122: 1771-1777.
Chin J Dig Dis. 2006;7(4):211-8. Alternation of substance P-containing neural pathways in a rat model of irritable bowel syndrome with rectal distension.
Neri F, Cavallari G, Tsivian M, Bianchi E, Aldini R, Cevenini M, Guidetti E, Piras GL, Pariali M, Nardo B. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:896162. Effect of colic vein ligature in rats with loperamide-induced constipation.
Fausta Serafini, Francesca Turroni, Patricia Ruas-Madiedo, Gabriele Andrea Lugli, Christian Milani, Sabrina Duranti, Nicole Zamboni, Francesca Bottacini, Douwe van Sinderen, Abelardo Margolles, Marco Ventura, Kefir fermented milk and kefiran promote growth of Bifidobacterium bifidum PRL2010 and modulate its gene expression, International Journal of Food Microbiology, 2014, 178, 50-59.
Cheng, F. C., J. S. Kuo, H. M. Huang, D. Y. Yang, T. F. Wu and T. H. Tsai (2000). Determination of catecholamines in pheochromocytoma cell (PC-12) culture medium by microdialysis-microbore liquid chromatography. J Chromatogr A 870(1-2): 405-411.
Cryan, J. F., A. Dalvi, S. H. Jin, B. R. Hirsch, I. Lucki and S. A. Thomas (2001). Use of dopamine-beta- hydroxylase- deficient mice to determine the role of norepinephrine in the mechanism of action of antidepressant drugs. J Pharmacol Exp Ther 298(2): 651-657.
Desbonnet, L., L. Garrett, G. Clarke, B. Kiely, J. F. Cryan and T. G. Dinan (2010). Effects of the probiotic Bifidobacterium infantis in the maternal separation model of depression. Neuroscience 170(4): 1179-1188. Millstein, R. A. and A. Holmes (2007). Effects of repeated maternal separation on anxiety- and depression-related phenotypes in different mouse strains. Neurosci Biobehav Rev 31(1): 3-17.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> National Yang-Ming University
<120> BACTERIA ACIDO LACTICA, COMPOSICION QUE LA CONTIENE Y SU USO
<130> LOUBP/P56511EP
<150> US 14/259442 <151 > 23 de Abril de 2014
<150> US 14/690502 <151 > 20 de abril de 2015
<160>2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211 > 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador para ERIC-PCR <220>
<221 > misc_difference <222> (1)..(22)
<400> 1
atgtaagctc ctggggattc ac 22
<210>2 <211 > 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> cebador para ERIC-PCR <220>
<221 > misc_difference <222> (1)..(22)
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    REIVINDICACIONES
    1. Una bacteria acido lactica aislada, que es Lactobacillus plantarum subsp. plantarum PS 128 y que esta depositada en la DSMZ con el N.° de Referencia DsM 28632.
  2. 2. Una composition que comprende la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1, y un vehlculo.
  3. 3. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en la prevention o el tratamiento de un trastorno inducido por estres o un trastorno psiquiatrico en un sujeto.
  4. 4. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de la reivindicacion 3,
    en donde el trastorno inducido por estres o el trastorno psiquiatrico se seleccionan del grupo que consiste en ansiedad, depresion y slndrome del intestino irritable.
  5. 5. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de acuerdo con las reivindicaciones 3 y 4, en donde tras la administration, disminuyo de forma estadlsticamente significativa el nivel de corticosterona serica en el sujeto.
  6. 6. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de acuerdo con las reivindicaciones 3 y 4, en donde tras la administracion, aumento de forma estadlsticamente significativa el nivel de neurotransmisor en el sujeto.
  7. 7. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde el neurotransmisor es dopamina.
  8. 8. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en la prevencion o el tratamiento de un trastorno gastrointestinal funcional en un sujeto.
  9. 9. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en la prevencion o el tratamiento de la hipersensibilidad visceral en un sujeto.
  10. 10. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de acuerdo con la reivindicacion 9 en donde la hipersensibilidad visceral esta asociada a un trastorno gastrointestinal funcional.
  11. 11. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 10, en donde el trastorno gastrointestinal funcional se selecciona del grupo que consiste en dolor abdominal funcional, slndrome del intestino irritable, estrenimiento, diarrea funcional y dispepsia funcional.
  12. 12. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en la prevencion o el tratamiento de dolor abdominal funcional, slndrome del intestino irritable o estrenimiento en un sujeto.
  13. 13. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 12, en donde tras la administracion, un nivel de un biomarcador de sensibilidad dolorosa disminuye de forma estadlsticamente significativa en el sujeto, en donde de manera opcional el biomarcador es sustancia P.
  14. 14. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 12, en donde tras la administracion, una senal de electromiografla disminuye de forma estadlsticamente significativa en el sujeto.
  15. 15. Una cantidad eficaz de la bacteria acido lactica aislada de la reivindicacion 1 para su uso en un metodo de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 14, en donde la bacteria acido lactica aislada se administra al sujeto por via oral.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6933358B2 (ja) * 2016-04-06 2021-09-08 東海漬物株式会社 美肌促進剤
CN110023485B (zh) * 2016-07-19 2023-12-05 益福生医股份有限公司 利用乳酸菌预防或治疗运动障碍的方法
KR20180019474A (ko) * 2016-08-16 2018-02-26 주식회사 엠디헬스케어 락토바실러스 플란타룸 유래 소포를 포함하는 정신질환 예방 또는 치료용 조성물
CN107050062A (zh) * 2016-11-08 2017-08-18 江西益盟科技有限公司 治疗便秘的乳酸菌组合物及其制备方法
JP6986288B2 (ja) * 2017-01-13 2021-12-22 ベネド バイオメディカル カンパニー リミテッド 新規乳酸菌およびその応用
KR102089836B1 (ko) * 2017-03-15 2020-03-16 (주)바이오일레븐 트립토판분해효소 음성균과 인터페론 감마 형성을 유도하는 균주를 이용한 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 이를 이용한 치료방법
CN106906165B (zh) * 2017-04-25 2020-07-24 重庆第二师范学院 一种植物乳杆菌及其在制备预防便秘的食品中的应用
CN107267416A (zh) * 2017-07-05 2017-10-20 重庆第二师范学院 植物乳杆菌ys2及其在制备预防便秘的食品中的应用
WO2019119261A1 (en) * 2017-12-19 2019-06-27 Dupont Nutrition Biosciences Aps Probiotics for cognitive and mental health
KR20200112840A (ko) * 2017-12-19 2020-10-05 듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스 인지 및 정신 건강을 위한 프로바이오틱스
BR112020015599A2 (pt) * 2018-02-02 2021-01-05 Kobiolabs, Inc. Cepa de lactobacillus plantarum kbl396 e uso da mesma
CN111035661A (zh) * 2018-10-15 2020-04-21 深圳市华大农业应用研究院 植物乳杆菌的用途
TWI731279B (zh) 2018-11-21 2021-06-21 葡萄王生技股份有限公司 發酵乳桿菌gkf3、含其之組合物及改善精神失調之用途
ES2763350B2 (es) * 2018-11-28 2020-10-13 Consejo Superior Investigacion Cepa de christensenella minuta y uso de la misma
US20220040244A1 (en) * 2018-12-06 2022-02-10 Dupont Nutrition Biosciences Aps Probiotics for cognitive and mental health
EP3918054A4 (en) * 2019-01-28 2022-10-19 Bened Biomedical Co., Ltd. METHOD OF PROTECTING A PERSON FOR PHYSICAL TRAINING
BR112021014779A2 (pt) * 2019-02-01 2021-10-05 Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement Cepas de lactococcus lactis para a prevenção e/ou o tratamento de dor visceral
EP3918055A4 (en) * 2019-02-01 2022-10-19 Bened Biomedical Co., Ltd. METHOD FOR PREVENTING OR TREATING ABNORMAL EMOTION OR ABNORMAL BEHAVIOR IN A NON-HUMAN ANIMAL BY LACTIC BACTERIA
KR102148707B1 (ko) * 2019-02-22 2020-08-31 한국식품연구원 우울증 및 불안장애의 예방, 개선 또는 치료 효능을 갖는 김치 유산균 락토바실러스 사케아이
US20230035928A1 (en) * 2020-02-06 2023-02-02 Wang-Tso Lee Composition of lactic acid bacterium for use in preventing or treating rett syndrome
CN116367847A (zh) * 2020-10-22 2023-06-30 李旺祚 用于治疗芳香族l-氨基酸脱羧基酶缺乏症的乳酸菌
TW202241477A (zh) * 2020-12-16 2022-11-01 日商明治股份有限公司 腦組織之發炎改善用組成物
CN113215018A (zh) * 2021-02-04 2021-08-06 郑州大学 一株植物乳杆菌植物亚种及其在豆粕和北艾混合发酵中的应用
CN113564084A (zh) * 2021-08-13 2021-10-29 华东理工大学 植物乳杆菌x7022在预防和治疗便秘上的应用
WO2024089260A1 (en) * 2022-10-28 2024-05-02 Chr. Hansen A/S Lactiplantibacillus plantarum for use in addressing the symptoms of irritable bowel syndrome

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5725853A (en) * 1994-10-18 1998-03-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. 4 strain direct-fed microbial
US20050158294A1 (en) * 2003-12-19 2005-07-21 The Procter & Gamble Company Canine probiotic Bifidobacteria pseudolongum
WO2010021247A1 (ja) * 2008-08-21 2010-02-25 サントリーホールディングス株式会社 セロトニントランスポーター阻害活性を有する医薬品又は飲食品

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