CN110023485B

CN110023485B - 利用乳酸菌预防或治疗运动障碍的方法

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Publication number: CN110023485B
Application number: CN201680087785.8A
Authority: CN
Inventors: 蔡英杰; 许智捷; 廖坚甫; 郑昀芳; 游淑婷
Original assignee: Shanghai Lianya Probiotic Biotechnology Co ltd; Bened Biomedical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Lianya Probiotic Biotechnology Co ltd; Bened Biomedical Co Ltd
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2036-07-19
Also published as: CN110023485A; WO2018014225A1; EP3487985B1; ES2967300T3; JP6878565B2; JP2019521157A; US11285179B2; EP3487985A4; US20190201461A1; EP3487985C0; EP3487985A1

Abstract

本发明意外地发现植物乳酸杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)PS128提供一种治疗或预防抽动性病症及基底神经节病症的有利效用。因此，本发明提供一种治疗或预防个体的运动障碍的方法，其包含向个体施用有效量的以DSMZ寄存编号DSM 28632寄存的植物乳酸杆菌植物亚种PS128的细胞。

Description

利用乳酸菌预防或治疗运动障碍的方法

技术领域

本发明涉及一种预防或治疗运动障碍的方法。详言之，本发明提供一种通过使用乳酸菌预防或治疗抽动性病症及基底神经节病症的方法。

背景技术

基底神经节包含多种皮质下核，包括纹状体、苍白球、黑质及丘脑下核，这些核位于脊椎动物前脑基底处。基底神经节核与包括皮质、丘脑及脑干的若干其他脑部区域强有力地互连。许多研究已表明其参与各种大脑功能，诸如控制自主运动性动作、过程学习、常规行为、眼睛运动、认知及情绪。多个及不同的神经病状与基底神经节功能障碍行为控制相关，包括过动性病症(hyperkinetic disorder)，诸如单侧抽搐(由丘脑下核损伤引起的身体一侧不可控运动)、肌张力障碍(由代谢、血管及结构异常引起的非自主性运动及意向运动减缓)、精神兴奋剂成瘾及亨廷顿氏病(Huntington's disease)(主要为纹状体损伤)；过动性病症，诸如帕金森氏病(Parkinson's disease)(黑质致密部中产生多巴胺的细胞的退化)；以及非运动性病症，诸如妥瑞症候群(Tourette syndrome)(由非运动回路的功能障碍引起的抽动性病症)、强迫症(OCD，不能控制思想或动作)(Maya Bronfeld, Neuroscience and Biobehavioral Reviews 37 (2013) 1101-1119；Sean C. Godar, Journal of Neuroscience Methods 238 (2014) 54-69；J. F. Cheer, Neuropharmacology 38 (1999) 533-541；A. M. Ouagazzal, Neuropsychopharmacology (2001) 第25卷, 第4期, 565-575；Toshihide Kuroki, Brain Research 972 (2003) 216-221；及Junji Ichikawa, Brain Research 698 (1995) 204-208)。

纹状体负责选择使用哪条通路。其接收来自皮质的输入，所述输入指示所要求的运动且将此转化成触发需要激发的运动皮质区的直接通路和需要抑制的区域的间接通路的信号。研究已确定基底神经节的主要作用为平衡激发和抑制。运动皮质中活性量使用两个不同通路调整：直接通路和间接通路。两个通路自皮质延伸，穿过基底神经节，接着经由丘脑回至运动皮质，不过其作用相反。直接通路引起丘脑将兴奋信号传送回至运动皮质，且因此增加活性。受接收来自直接通路的信号的运动皮质部分控制的肌肉变得更有活性，引起肌肉收缩，从而增强所需运动。间接通路引起丘脑将抑制信号传送至运动皮质，且因此抑制活性。受接收抑制信号的运动皮质区控制的肌肉松弛，阻止将干扰该运动的肌肉动作。

吉氏妥瑞症候群(GTS)亦称为妥瑞症候群(TS)或妥瑞氏病症，为一种在儿童中发作的遗传性神经病症，其常常与OCD及ADHD共存或并发。TS患者的特征在于存在多种运动性抽动和至少一种声音性抽动。抽动为涉及离散肌群的突然、重复、非节律性运动动作(运动性抽动)或发声(声音性抽动)。虽然TS的确切原因未知，但许多研究表明抽动由大脑的丘脑、基底神经节和额皮质中涉及大脑化学物质或神经递质(如多巴胺)的异常活性的功能障碍引起。

当控制运动的大脑区域中的神经细胞或神经元变弱及/或死亡时，则发生帕金森氏病(Parkinson's disease)。通常，这些神经元产生重要的大脑化学物质，称为多巴胺，但当神经元死亡或变弱时，其产生较少多巴胺。多巴胺的此不足引起帕金森患者的运动问题。

乳酸菌(LAB)为一组通常用于产生发酵食品的革兰氏阳性细菌。已经广泛研究LAB在膳食及临床应用中的益处。然而，LAB的效力随菌株变化。许多研究已展示产生及制造方法且食品载剂可影响益生菌菌株的特性，且对临床介入研究的结果有影响。近期研究已揭露肠微生物群经由不同通路(神经、免疫及内分泌)与中枢神经系统(CNS)通信，且引入脑肠轴(GBA)的想法。某些LAB菌株，亦称为“精神益生菌”，经由GBA影响大脑功能且改善行为改变。已展示瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus) ROO52减少啮齿动物中焦虑样行为(Ohland CL, Kish L, Bell H, Thiesen A, Hotte N, Pankiv E, Madsen KL (2013) Effects of Lactobacillus helveticus on murine behavior are dependent on diet and genotype and correlate with alterations in the gut microbiome. Psychoneuroendocrinology 38:1738 -1747)。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)JB-1可经由迷走神经减少小鼠中压力诱发的皮质酮及焦虑及抑郁相关的行为以及中枢GABA受体表达(Bravo JA, Forsythe P, Chew MV, Escaravage E, Savignac HM, Dinan TG, Bienenstock J, Cryan JF (2011) Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve. Proc Natl Acad Sci USA 108:16050 -16055)。热杀死短乳杆菌(Lactobacillusbrevis) SBC8803增加大鼠中传出胃迷走神经活性及传入肠迷走神经活性。洛德乳杆菌(Lactobacillusreuteri)可经由靶向肠感觉神经中的离子通道影响疼痛感觉(Horii Y, Nakakita Y, Misonou Y, Nakamura T, Nagai K (2015) The serotonin receptor mediates changes in autonomic neurotransmission and gastrointestinal transit induced by heat-killed Lactobacillus brevis SBC8803. Benef Microbes. 6(6) :817-22)。

已展示婴儿双叉杆菌(Bifidobacteriuminfantis) 35624减少大鼠模型中血浆皮质酮浓度及内脏疼痛(McKernan DP, Fitzgerald P, Dinan TG, Cryan JF. (2010) The probiotic Bifidobacterium infantis 35624 displays visceral antinociceptive effects in the rat. Neurogastroenterol Motil. 22(9): 1029-35, e268)。长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum) 1714减少压力、焦虑及抑郁相关的行为，而短型双叉杆菌(Bifidobacteriumbreve) 1205减少泛焦虑行为且诱导重量减轻(Savignac HM, Kiely B, Dinan TG, Cryan JF. (2014) Bifidobacteria exert strain-specific effects on stress-related behavior and physiology in BALB/c mice. Neurogastroenterol Motil. Nov;26(ll):1615-27. doi: 10.1111/nmo. 12427)。抑郁可由大脑中缺乏神经递质血清素引起。其他抑郁原因由大脑中缺乏多巴胺引起。然而，帕金森氏病涉及神经细胞或神经元削弱及/或死亡且TS涉及多巴胺功能障碍，诸如多巴胺过量或突触后多巴胺受体的过敏性。明显地，抑郁的原因及机制不同于TS及帕金森氏病的原因及机制，因此TS及帕金森氏病的治疗、预防及/或抑制不可能自抑郁的治疗、预防及/或抑制获得。

如上所示，不同双叉杆菌属菌株展现治疗或预防疾病或病症的各种功能及有益作用，因此需要探究双叉杆菌属菌株的新功能。

发明内容

本发明鉴别植物乳酸杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)PS128 (下文中有时称作PS128)展示治疗或预防运动障碍的作用。因此，本发明提供一种治疗或预防个体的运动障碍的方法，其包含向个体施用有效量的以DSMZ寄存编号DSM 28632寄存的植物乳酸杆菌植物亚种PS128的细胞。本发明亦提供一种以DSMZ 寄存编号DSM 28632寄存的植物乳酸杆菌植物亚种PS128的用途，其用于制造供治疗或预防个体的运动障碍用的制剂。在一些实施例中，制剂为药物、保健食品或食品。

在一个实施例中，PS128具有如SEQ ID NO: 3中所阐述的16S rDNA序列。在一个实施例中，PS128可呈可为活或死的全细菌形式使用。在一个实施例中，PS128制备成组合物或混合物。

在一些实施例中，运动障碍包括(但不限于)基底神经节病症、特发性震颤、路易体疾病(Lewy body disease)、运动功能减退疾病、各种类型的外周神经病、肌张力障碍、运动功能减退(包括运动不能)、运动困难及抽动性病症。

附图说明

图1展示电泳照片，其展示植物乳酸杆菌菌株的ERIC-PCR图谱，其中M表示DNA梯度；ATCC 14917^T表示植物乳酸杆菌植物亚种，且BCRC 17638^T表示植物乳酸杆菌亚种阿根托维达斯。

图2A-C展示MPTP腹膜内注射后(A：爬杆测试，B：狭窄光束测试，及C：旋杆测试)的结果。(n≧6，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

图3A-B展示黑质区域中TH阳性细胞的免疫萤光染色图(图3A)及定量(图3B)。

图4展示在第二处理后立即计数的BMC的数目，历时35分钟时间段。

图5A-D展示大鼠前额皮质中总DA (A)、DOPAC (B)及HVA (C)含量及神经递质转换率(DOPAC+HVA/DA (D))。

图6A-C展示大鼠的纹状体DAT表达量(A)、DARPP磷酸化程度(B)及ERK磷酸化程度(C)。

图7A-C展示大鼠的前额皮质DAT表达量(A)、DARPP磷酸化程度(B)及ERK磷酸化程度(C)。

具体实施方式

本发明意外地发现植物乳酸杆菌植物亚种PS128提供治疗或预防运动障碍、特别抽动性病症及基底神经节病症的有利作用。

在本文中未特定地定义的术语应根据将由熟习此项技术者鉴于本发明及上下文给出的涵义来理解。然而，如本说明书中所使用，除非相反说明，否则以下术语具有根据以下惯例指示的含义。

除非另外明确说明，否则与连接词“及”关联的一组项目不应理解为需要那些项目中的每一个均存在于群组中，而应理解为“及/或”。类似地，除非另外明确说明，否则与连接词“或”关联的一组项目不应理解为在彼群组中需要相互排他性，而应理解为“及/或”。此外，除非明确陈述限于单数，否则虽然本发明的项目、要素或组分可用单数描述或主张，但其范畴内亦涵盖多数。

如本文所用，除非另外明确陈述，否则术语“一个(a)”、“一种(an)”及“所述(the)”应理解为意谓单数与多数两者。因此，“一个”、“一种”及“所述”(及适当时其语法变化)是指一或多个。

如本文所用，术语“病症”可与“疾病”或“病状”互换使用。

术语“治疗”理解为意谓减轻或减弱特定疾病或病状的至少一种征象、症状、适应症或作用。如本文所用，“预防”理解为限制、降低发作速率或程度、或抑制疾病或病状的至少一种征象或症状的发展。

在本领域中，术语“益生菌”被认为是一种当足量施用时可赋予宿主保健效益的微生物。益生菌微生物必须满足与没有毒性、活力、黏附性及有益效用相关的若干需求。这些益生菌特征视菌株而定，甚至视相同物种的细菌之间而定。

如本文所用，术语“医药学上可接受”是指在合理医学判断范畴内，适合与个体(人类或非人类动物)组织接触使用，无过度毒性、刺激、过敏性反应或其它问题或并发症，符合合理益处/风险比的化合物、物质、组合物及/或剂型。各载剂、赋形剂等必须在与调配物的其他成分相容的意义上亦为“可接受”。适合的载剂、赋形剂等可见于标准医药学教科书中。

术语“可食载剂”是指适合与个体组织接触的化合物、物质、组合物及/或剂型。各载剂必须在与调配物的其他成分相容的意义上亦为“可接受”。

如本文所用，术语“有效量”为在合理医学判断范畴内，组合物中各菌株的菌落形成单位(cfu)高至足以依积极方式显著改变待治疗的病状，但低至足以避免严重副作用(合理益处/风险比)的量。

在一方面，本发明提供一种治疗或预防个体的运动障碍的方法，其包含向个体施用有效量的以DSMZ寄存编号DSM 28632寄存的植物乳酸杆菌植物亚种PS128的细胞。本发明亦提供一种以DSMZ寄存编号DSM 28632寄存的植物乳酸杆菌植物亚种PS128的用途，其用于制造供治疗或预防个体的运动障碍用的制剂。本发明亦提供一种以DSMZ寄存编号DSM28632寄存的植物乳酸杆菌植物亚种PS128，其用于治疗或预防个体的运动障碍。在一些实施例中，制剂为药物、保健食品或食品。

在一个实施例中，植物乳酸杆菌植物亚种PS128具有如SEQ ID NO: 3中所阐述的16S rDNA序列。

在一个实施例中，PS128可呈可为活或死的全细菌形式使用。细菌细胞优选呈活细胞形式存在。在一个实施例中，PS128可为细菌的部分细胞，或活细胞与死的部分或全细胞的细胞混合物。

在一个实施例中，PS128制备成组合物或混合物。

运动障碍包括(但不限于)基底神经节病症、特发性震颤、路易体疾病、运动功能减退疾病、各种类型的外周神经病、肌张力障碍、运动功能减退(包括运动不能)、运动困难及抽动性病症。

在一个实施例中，基底神经节病症是指当大脑中称为基底神经节的一组核无法适当地遏制不必要的动作，或无法适当地引发上部运动神经元回路以起始运动功能时发生的一组身体功能障碍。增加的基底神经节输出抑制丘脑皮质投影神经元。这些神经元的适当活化或失活为适当运动的整体组分。若某事引起过多基底神经节输出，则丘脑皮质投影神经元变得过度抑制且一个人无法起始自发运动。这些病症称为运动功能减退病症（hypokinetic disorder）。然而，引起基底神经节异常低的输出的病症引起丘脑皮质投影神经元抑制的相对缺乏。此情况导致无法遏制不必要的动作。这些病症称为过动性病症。在一些实施例中，基底神经节病症包括(但不限于)单侧抽搐(由丘脑下核损伤所引起的身体一侧不可控运动)、肌张力障碍(由代谢、血管及结构异常引起的非自主性运动及意向运动减缓)、精神兴奋剂成瘾及亨廷顿氏病(主要为纹状体损伤)、帕金森氏病(黑质致密部中产生多巴胺的细胞的退化)；妥瑞症候群(Tourette syndrome)(由非运动回路的功能障碍引起的抽动性病症)及强迫症(OCD，不能控制思想或动作)。

在一个实施例中，运动症状为帕金森氏病、MPTP诱发的运动不足、运动缓慢及困难或慢性运动病症。

在一个实施例中，抽动性病症为妥瑞症候群、DOI诱发的抽动相关病症、慢性运动病症或发声型抽动病症。

在一个实施例中，PS128展示保护宿主CNS中多巴胺能系统。在另一个实施例中，PS128拯救MPTP诱发的多巴胺能细胞退化且增加酪氨酸羟化酶(TH)表达量。

在一个实施例中，PS128展示调节基底神经节中多巴胺神经传递。在另一个实施例中，DOI诱发前额皮质多巴胺增加，而施用PS128调节此倾向且显著增加前额皮质中多巴胺代谢物总含量及多巴胺转换率。优选地，神经递质选自由以下各者组成的群：多巴胺(DA)、二羟基苯乙酸(DC)及高香草酸(HVA)。

在另一其他实施例中，PS128增加前额皮质及纹状体中多巴胺转运体表达量。此外，施用PS128后，多巴胺下游信号传导(细胞外信号调节的激酶ERK；多巴胺及cAMP调节的磷蛋白DARPP)活化在大鼠纹状体及前额皮质中增加，而多巴胺下游信号传导在DOI治疗期间显著减弱。

在另一其他实施例中，PS128展示作为可改善运动病症且展示宿主CNS的神经保护作用的多巴胺信号传导稳定剂(DSS)的能力。PS128可调节DA传送且调节过度活动及活动不足功能，视普遍的多巴胺能紧张度而定。

P128的细胞可制备成组合物或混合物，呈适合于给药、尤其口服给药的任何形式。此包括例如固体、半固体、液体及粉末。

PS128细胞的给药量为每天至少10⁶菌落形成单位(cfu)的如上文所提及的PS128菌株：每天至少10⁷ cfu、每天10⁸ cfu或每天10⁹ cfu的如上文所提及的PS128菌株。

优选地，PS128细胞的给药量在每天10⁶至10¹⁴、10⁷至10¹⁴、10⁸至10¹⁴、10⁹至10¹⁴、10¹⁰至10¹⁴、10¹¹至10¹⁴、10¹²至10¹⁴、10¹²至10¹⁴、10¹³至10¹⁴、10⁶至10¹³、10⁶至10¹²、10⁶至10¹¹、10⁶至10¹⁰、10⁶至10⁹、10⁶至10⁸、10⁶至10⁷、10⁷至10¹³、10⁷至10¹²、10⁷至10¹¹、10⁷至10¹⁰、10⁷至10¹²、10⁷至10¹¹、10⁷至10¹⁰、10⁷至10⁹、10⁷至10⁸、10⁸至10¹³、10⁸至10¹²、10⁸至10¹¹、10⁸至10¹⁰、10⁸至10⁹、10⁹至10¹³、10⁹至10¹²、10⁹至10¹¹或10⁹至10¹⁰cfu范围内。

PS128组合物或混合物的实例包括营养组合物或混合物，包括食品产品及尤其乳制品。

组合物或混合物可为例如胶囊、锭剂、饮品、散剂或乳制品。视情况，可存在其它LAB菌株。优选地，本发明的营养组合物或混合物为婴儿食品、婴儿奶粉配方或婴儿后续配方。优选地，本发明的组合物或混合物为营养食品或医药产品、食品产品、保健食品、营养补充剂或医疗食品。

本发明的营养组合物或混合物亦包括食物补充剂及功能性食品。“食品补充剂”表示由通常用于食物中的化合物制成，但呈锭剂、散剂、胶囊、饮剂的形式或通常不与食物相关且对健康具有有益作用的任何其他形式产品。“功能性食品”为一种亦对个人健康具有有益作用的食物。特定而言，食品补充剂及功能性食品可对疾病，例如对慢性疾病具有生理作用-保护性或治愈性。

若根据本发明的组合物或混合物为膳食补充剂，则其可原样施用，可与诸如水、酸乳、牛奶或果汁的适合可饮用液体混合，或可与固体或液体食品混合。在此背景下，膳食补充剂可呈锭剂、丸剂、胶囊、口含锭、颗粒、散剂、悬浮液、药囊、片剂、糖剂、条剂、糖浆的形式及对应给药形式，通常呈单位剂量形式。优选地，包含本发明的组合物或混合物的膳食补充剂是呈在制备膳食补充剂的公知制程中制造的锭剂、口含锭、胶囊或散剂形式给药。

本发明通过以下置于图式简单说明之前的实例更详细地描述。然而，不言而喻，这些实例以例示本发明主题的方式给出，且不以限制其的任何方式构成。除非另有说明，否则百分比以重量计。

实例

实例1植物乳酸杆菌植物亚种PS128的分离及基因分型

植物乳酸杆菌植物亚种PS128 (下文中称为PS 128)自fu-tsai (台湾传统的发酵氮芥产物)分离且在特定人工培养基中培养。通过PCR扩增的16S rDNA的约1000个核苷酸的直接测序，分析来自PS128的16S rRNA基因(SEQ ID NO. 3)，其中使用由SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2表示的引物。基因组DNA提取、PCR介导的16S rDNA扩增、PCR产物纯化及纯化的PCR产物的测序在表1中指示的条件下进行。

所得序列输入由美国国家生物技术资讯中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)线上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的比对软体，人工比对且与属于厚壁菌门(Firmicutes)的生物体的代表性16S rDNA序列相比。为进行比较，亦自NCBI线上提供的资料库获得16S rDNA序列。作为此分析的结果，以下表2列出16S rDNA序列展示与植物乳酸杆菌植物亚种PS128的16S rDNA序列相比最高相似性值的那些生物体。

表1. PCR反应溶液的组成(每个PCR管25 μl)

PCR条件：98℃ 2.5分钟；15个循环(98℃ 15秒；50℃ 30秒；72℃ 20秒)；72℃ 5分钟；4℃，∞。

表2 16S rDNA序列间的比较

菌株(GenBank寄存编号)	与PS128的16S rRNA基因序列相似性(%)
		植物乳酸杆菌植物亚种ST-III (NC_014554.1)	99.8%
植物乳酸杆菌植物亚种P-8 (NC__021224.2)	99.7%
		植物乳酸杆菌16 (NC_021514.1)	99.7%
短乳杆菌ATCC 367 (NC_008497.1)	93.8%
		鼠李糖乳杆菌ATCC 8530 (NC_017491.1)	92.4%
洛德乳杆菌DSM 20016 (NC_009513.1)	90.5%
		加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)ATCC 33323 (NC008530.1)	90.0%

PS128的部分16S rDNA序列展示与植物乳酸杆菌植物亚种的最高相似性。因此，PS128表示植物乳酸杆菌植物亚种的一种菌株，且亦表示乳杆菌属内一种新物种。

植物乳酸杆菌植物亚种PS128根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2014年3月31日寄存于Leibniz研究所DSMZ-德国微生物与细胞培养基保藏(Inhoffenstr. 7 B, D-38124 Braunschweig, Germany)，且已由国际保存机构给予DSMZ寄存编号DSM 28632。此生物材料经受存活力测试且通过。

植物乳酸杆菌植物亚种PS128 16S rDNA序列(SEQ ID NO: 3)

实例2使用ERIC-PCR图谱鉴别植物乳酸杆菌植物亚种PS128的新颖菌株

进行ERIC-PCR以进一步区分具有高度序列相似性的细菌亚种。植物乳酸杆菌菌株的ERIC-PCR图谱在表3中指示的条件下进行。自PS128提取的DNA及两种植物乳酸杆菌菌株用作模板。如图1中所示，所得扩增产物进行电泳且比较图案，其中使用由SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5表示的引物。

ERIC1R:

ERIC2F:

表3. PCR反应溶液的组成(每个PCR管25 μl)

PCR条件：94℃，5分钟；35个循环(94℃，30秒；45℃，1分钟；65℃，6分钟)；65℃，6分钟；4℃，∞。

如图1中所示，泳道M表示DNA梯度(250-10000 bp)；ATCC 14917^T表示植物乳酸杆菌植物亚种；且BCRC 17638^T表示植物乳酸杆菌亚种阿根托维达斯。

如白色箭头所指示，在ATCC 14917^T或BCRC 17638^T的条带中，PS128的条带位置独特，且因此图1中的结果展示即使PS128及ATCC 14917^T均属于植物乳酸杆菌植物亚种，其仍为不同菌株。因此，PS128表示植物乳酸杆菌植物亚种的一种新菌株。

实例3分析型态指数(API)分型

使用API 50 CHL试剂盒(bioMerieux, France)研究本发明中使用的PS128的糖利用，且结果展示于表4中。发酵测试表明PS128具有类似于植物乳酸杆菌植物亚种的生物化学特性。

表4：发酵测试的结果^a

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实例4制备PS128用于动物处理

PS128接种在培养基(10%脱脂牛奶、1%酵母粉末、0.1%tween 80及2%葡萄糖)中，在37℃下培养18小时，且通过离心收获。将PS128与保护剂(脱脂牛奶1%、糖2%、果寡糖2%、麦芽糊精3%及丙三醇2%)及容器一起包埋且冻干至每克粉末5×10⁹群落形成单位(CFU)的最终浓度。PS128粉末储存在-20℃下且溶解于生理食盐水溶液中达10¹⁰ CFU/mL，接着进行动物处理。

实例5植物乳酸杆菌植物亚种PS128改善MPTP诱发的运动缺乏及保护小鼠大脑中的多巴胺能系统

(1) 动物及圈养

六至八周龄雄性C57BL/6J小鼠(20至22 g)购自实验动物中心(台湾台北)。小鼠圈养在恒定温度及湿度下，12小时光-暗周期，且自由取用食品及水。所有动物实验程序由阳明大学(Yang-Ming University)的动物管理会议评述及批准。

(2) 实验程序

小鼠分别口服给药PS 128 (每天10⁹ CFU/mL)或生理食盐水(每天0.2 mL) 28天。第24天至第28天，小鼠每天腹膜内注射MPTP (300 mg/kg)。在第28天最后一个MPTP处理后展示爬杆测试、狭窄光束测试及旋杆测试。第24天至第28天，L-DOPA组每天口服给药100mg/kg L-DOPA + 25 mg/kg苄丝肼及腹膜内注射MPTP (300 mg/kg)，且展示为阳性对照。为进一步分析，处死小鼠以在所有行为测试后取出大脑组织、盲肠组分及血液。

(3) 爬杆测试

爬杆测试为一种可用于评估小鼠运动障碍的方法。参见图2A，小鼠头朝上置放在垂直粗糙表面杆(直径1 cm；高50 cm)的顶部上，且记录直至其下降至地板的时间，最大持续时间为120 s。即使小鼠下降部分路径且路径其余部分掉落，亦对行为评分直至其达到地板。当小鼠不能朝下转向且实际上自杆落下时，运动活性时间(Tla)因为最大严重程度而视为120 s (预设值)。

(4)狭窄光束测试

狭窄光束测试为一种可用于评估小鼠运动协调及平衡的方法。参见图2B，光束设备由50 cm光束组成，其中具有0.8 cm宽度的平坦表面搁在两个杆上桌子顶部上方50 cm处。在光束末端时置放黑色盒作为结束点。来自家笼的饲料置于黑色盒中以吸引小鼠至结束点。在训练日，小鼠置于黑色盒中5分钟以熟悉环境。此后，各小鼠跨越5 cm光束3次，接着为15 cm、30 cm及50 cm光束训练。在测试当日，各小鼠展示光束测试3次且记录跨越时间。

(5) 旋杆测试

旋杆测试广泛用于评估啮齿动物的运动协调。参见图2C，使用具有鼓、自动计时器及落下感测器的旋杆机。在注射MPTP前，小鼠进行旋杆前训练(30 rpm旋转速度180秒) 3天。在测试当日，各小鼠连续(各测试间1分钟时间间隔)展示旋杆测试(30 rpm旋转速度180秒) 3次，且记录剩余时间。

(6) 通过免疫组织化学定量酪氨酸羟化酶阳性的多巴胺能细胞

小鼠用戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，且经贲门灌注磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)，接着为含4%多聚甲醛的PBS。立即移除大脑，置放于相同固定剂中隔夜，且接着转移至4℃下30%蔗糖溶液，接着在低温恒温器上以40 μm切片。

切片通过洗涤缓冲液洗涤3次(含0.1%triton X100及0.01%叠氮化钠的PBS)且接着在阻断缓冲液中在震荡下在室温下培育1小时。封闭程序后，切片与初级抗体(抗酪氨酸羟化酶，1:300，Millipore)及Hoechst 33258 (1:2000，LIFE TECHNOLOGIES)一起在PBST(含0.3% triton X100、0.01% BSA、0.01%迭氮化钠及3%驴血清的PBS)中在4℃下孵育过夜。在洗涤缓冲液中在震荡下洗涤三次后，在震荡下在室温下切片与二级抗体(FITC结合的亲和纯化驴抗小鼠IgG(H+L)，1:300，Jackson ImmunoResearch)及Hoechst在PBST中一起孵育2小时。接着切片在洗涤缓冲液中洗涤三次且通过安装具有封固剂的盖玻片来密封。

通过共聚焦显微镜leiss zsm700使免疫染色切片成像。使用多波长细胞评分应用程式，用MetaMorph软体在来自Bregma的替代切片(-2.92至-3.8 mm)上测定TH阳性细胞数目。参见图3A-3B，以生理食盐水对照组的百分比展示黑质区域中TH阳性细胞的免疫萤光染色图(图3A)及定量(图3B)。

实例6植物乳酸杆菌植物亚种PS128改善DOI诱发的背部肌肉收缩及大鼠大脑中异常多巴胺信号传导通路

(1) 动物及圈养

六至八周龄雄性威斯塔大鼠(220至330 g)购自BioLASCO Taiwan Co.,Ltd (台湾台北)。大鼠圈养在恒定温度及湿度下，12小时光-暗周期，且自由取用食品及水。所有动物实验程序由阳明大学的动物管理会议评述及批准。

(2) 实验程序及背部肌肉收缩(BMC)次数计数

大鼠分别口服给药PS128 (每天10¹⁰ CFU/mL)或生理食盐水(每天1 mL) 15天。通过两剂5-HT2A/C-受体促效剂2,5-二甲氧基-4-碘安非他命(DOI)(其产生稳固频率的背部肌肉收缩(BMC))建立抽动样行为。在第14天大鼠静脉内注射DOI (200 μg/kg)作为初级处理，且在第15天腹膜内注射DOI (1 mg/kg)作为次级处理。在第二处理后立即计数BMC数目，历时35分钟时间段。氟哌啶醇(Hal)组分别给予多巴胺拮抗剂氟哌啶醇(每天1 mg/kg) 15天且同样显示为阳性对照。参见图4，仅在沿背部，自颈后至尾部扫描，存在清晰强力收缩时才计数BMC (Fone等人, 1989)。为进一步分析，处死大鼠以在记录BMC后取出大脑组织、盲肠组分及血液。

(3) 通过高效液相色谱-电化学检测(HPLC-ECD)定量单胺及其代谢物

HPLC-ECD系统包含微型泵(CMA-100, CMA, Stockholm, Sweden)、线上喷射器(CMA-160)、Microtech LC泵(Microtech Scientific, Sunnyvale, CA, USA)、BAS-4C电化学检测器(Bioanalytical Systems, Inc., West Lafeyette, IN, USA)及逆相管柱(Kinetex C18, 2.6 μm, 100×2.1 mm I.D.；Phenomenex, USA)。在室温(25℃)下玻璃态碳工作电极的电位设定在相对于Ag/AgCl参考电极+650 mV。含有0.1 M NaH₂PO₄、8%甲醇、0.74 mM l-辛烷磺酸(钠盐)、0.03 mM乙二胺四乙酸(EDTA)及2 mM KC1的移动相用H₃PO₄调整至pH 3.74。前额皮质及纹状体通过音波处理溶解且在12,000×g下离心10分钟，且所得上清液经由0.22 mm聚偏二氟乙烯膜(4 mm针筒过滤器；Millex-GV, Millipore, USA)过滤，接着分析。将稀滤液(20 μL)以0.2 mL/min的流速喷射至色谱系统中。样品中多巴胺(DA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、血清素(5-HT)及5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)使用在1至100 ng/mL范围内的标准品(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)内插。

参见图5A-5D，大鼠前额皮质中总DA (图5A)、DOPAC (图5B)及HVA (图5C)含量以每克组织湿重的纳克数展示且神经递质转换率(DOPAC+HVA/DA，图5D)以总前额皮质DA含量的百分比展示。图5A中，第二PS128条是指仅仅给予PS128 (仅仅细菌对照组)，其展示对DA总含量无显著影响；第四条是指给予氟哌啶醇(Hal)；且最后一个PS128条是指施用PS128至接收DOI的小鼠。第三条及第五条展示DOI显著增加前额皮质中DA量，而PS128给药调节此倾向。图5B-5D展示在接收PS128的DOI诱发的小鼠中DA代谢速率增加，因此PS128能够调节大脑中异常递增的DA信号传送。

(4) 蛋白免疫印迹

为证实PS128对DOI诱发的异常多巴胺信号传导通路的作用，通过蛋白免疫印迹法,测定大鼠前额皮质及纹状体中的总蛋白质。提取物在10%聚丙烯酰胺凝胶上分级分离且接着电泳转移至聚偏二氟乙烯膜(Roche Ltd.)，接着用封闭缓冲液含有5%脱脂牛奶的TBST封闭1小时，且与初级抗体(抗DAT 1:500；抗pDARPP32 1:500；抗pERK 1:1000；DARPP32 1:1000；ERK 1:1000；Santa Cruz Biotechnology, inc.)一起在封闭缓冲液中在4℃下孵育过夜。用TBST洗涤两次后，膜与用辣根过氧化酶构筑的二级抗体一起在封闭缓冲液中孵育。抗体-蛋白质复合物通过Immobilon™ Western化学发光HRP底物(Millipore inc.)可视化。且通过发光成像分析器(FUJIFILM Holdings Corporation)检测。参见图6A-6C，大鼠纹状体DAT表达量(图6A)、DARPP磷酸化程度(图6B)及ERK磷酸化程度(图6C)展示以相对于对照组的改变倍数。参见图7A-7C，大鼠前额皮质DAT表达量(图7A)、DARPP磷酸化程度(图7B)及ERK磷表达酸化程度(图7C)以相对于对照组的改变倍数展示。

序列表

<110> 益福生医股份有限公司

中国益福生医股份有限公司

<120> 利用乳酸菌预防或治疗运动障碍的方法

<130> B90531/CN24769

<160> 5

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于16S rDNA的PCR扩增的引物

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于16S rDNA的PCR扩增的引物

<400> 2

aaggaggtga tccaaccgca 20

<210> 3

<211> 1476

<212> DNA

<213> 植物乳酸杆菌植物亚种 PS128

<400> 3

ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgaacgaact ctggtattga 60

ttggtgcttg catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg 120

aaacctgccc agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact 180

tggaccgcat ggtccgagyt tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg 240

gcgtattagc tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga 300

gagggtaatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt 360

agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg 420

tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta 480

ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540

aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt 600

ctgatgtgaa agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg 660

cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca 720

ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag 780

caaacaggat tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag 840

ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc 900

gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960

aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat 1020

tagacgttcc cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080

tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa 1140

gttgggcact ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200

tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg 1260

cgaactcgcg agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca 1320

actcgcctac atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg 1440

gtggggtaac cttttaggaa ccagccgcct aaggtg 1476

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于ERIC-PCR的引物

<400> 4

atgtaagctc ctggggattc ac 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于ERIC-PCR的引物

<400> 5

aagtaagtga ctggggtgag cg 22

Claims

1.一种以DSMZ寄存编号DSM 28632寄存的植物乳酸杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)PS128的用途，其用于制备治疗或预防个体的帕金森氏病或异常递增的多巴胺信号传送所诱发的抽动相关病症的药剂。

2.如权利要求1所述的用途，其中植物乳酸杆菌植物亚种PS128具有如SEQ ID NO:3中所阐述的16S rDNA序列。

3.如权利要求1所述的用途，其中PS128细胞以每天至少10⁶cfu的量给药。

4.如权利要求1所述的用途，其中PS128能够呈全细菌形式使用。

5.如权利要求1所述的用途，其中PS128全细菌为活的。

6.如权利要求1所述的用途，其中PS128能够呈细菌的部分细胞的形式使用。

7.如权利要求1所述的用途，其中PS128制备成组合物或混合物。

8.如权利要求7所述的用途，其中PS128细胞以每天10⁶至10¹⁴cfu的量给药。

9.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物或混合物为医药组合物或混合物。

10.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物或混合物为医药产品。

11.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物或混合物制备成胶囊、锭剂或散剂。

12.如权利要求1所述的用途，其中PS128用于口服给药。

13.如权利要求1所述的用途，其中所述抽动相关病症为DOI诱发的抽动相关病症。

14.如权利要求1所述的用途，其中PS128展示调节基底神经节中多巴胺神经传递。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述多巴胺神经传递涉及的神经递质选自由以下各者组成的群：多巴胺、二羟基苯乙酸及高香草酸。

16.如权利要求1所述的用途，其中PS128增加前额皮质中多巴胺转换率。