TWI623319B - 利用乳酸菌預防或治療運動障礙之方法 - Google Patents

Abstract

本發明意外地發現植物乳酸桿菌植物亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)PS128提供一種治療或預防抽動性病症及基底神經節病症之有利效用。因此，本發明提供一種治療或預防個體之運動障礙的方法，其包含向個體投與有效量的以DSMZ寄存編號DSM 28632寄存之植物乳酸桿菌植物亞種PS128之細胞。

Description

利用乳酸菌預防或治療運動障礙之方法

本發明係關於一種預防或治療運動障礙之方法。詳言之，本發明提供一種藉由使用乳酸菌預防或治療抽動性病症及基底神經節病症之方法。

基底神經節包含多種皮質下核，包括紋狀體、蒼白球、黑質及丘腦下核，該等核位於脊椎動物前腦基底處。基底神經節核與包括皮質、丘腦及腦幹之若干其他腦部區域強有力地互連。許多研究已表明其參與各種大腦功能，諸如控制自主運動性動作、過程學習、常規行為、眼睛運動、認知及情緒。多個及不同的神經病狀與基底神經節功能障礙行為控制相關，包括過動性病症，諸如單側抽搐(由丘腦下核損傷引起的身體一側不可控運動)、肌張力障礙(由代謝、血管及結構異常引起之非自主性運動及意向運動減緩)、精神興奮劑成癮及亨廷頓氏病(Huntington's disease)(主要為紋狀體損傷)；過動性病症，諸如帕金森氏病(Parkinson's disease)(黑質緻密部中產生多巴胺之細胞的退化)；以及非運動性病症，諸如妥瑞症候群(Tourette syndrome)(由非運動迴路之功能障礙引起之抽動性病症)、強迫症(OCD，不能控制思想或動作)(Maya Bronfeld, Neuroscience and Biobehavioral Reviews 37 (2013) 1101-1119；Sean C. Godar, Journal of Neuroscience Methods 238 (2014) 54-69；J. F. Cheer, Neuropharmacology 38 (1999) 533-541；A. M. Ouagazzal, Neuropsychopharmacology (2001) 第25卷, 第4期, 565-575；Toshihide Kuroki, Brain Research 972 (2003) 216-221；及Junji Ichikawa, Brain Research 698 (1995) 204-208)。

紋狀體負責選擇使用哪條路徑。其接收來自皮質的輸入，該輸入指示所要求之運動且將此轉化成觸發需要激發的運動皮質區的直接路徑和需要抑制之區域的間接路徑的信號。研究已確定基底神經節之主要作用為平衡激發和抑制。運動皮質中活性量使用兩個不同路徑調整：直接路徑和間接路徑。兩個路徑自皮質延伸，穿過基底神經節，接著經由丘腦回至運動皮質，不過其作用相反。直接路徑引起丘腦將興奮信號傳送回至運動皮質，且因此增加活性。受接收來自直接路徑之信號之運動皮質部分控制的肌肉變得更有活性，引起肌肉收縮，從而增強所需運動。間接路徑引起丘腦將抑制信號傳送至運動皮質，且因此抑制活性。受接收抑制信號之運動皮質區控制的肌肉鬆弛，阻止將干擾該運動之肌肉動作。

吉氏妥瑞症候群(GTS)亦稱為妥瑞症候群(TS)或妥瑞氏病症，為一種在兒童中發作之遺傳性神經病症，其常常與OCD及ADHD共存或併發。TS患者之特徵在於存在多種運動性抽動和至少一種聲音性抽動。抽動為涉及離散肌群之突然、重複、非節律性運動動作(運動性抽動)或發聲(聲音性抽動)。雖然TS之確切原因未知，但許多研究表明抽動由大腦之丘腦、基底神經節和額皮質中涉及大腦化學物質或神經傳遞素(如多巴胺)之異常活性的功能障礙引起。

當控制運動之大腦區域中之神經細胞或神經元變弱及/或死亡時，發生帕金森氏病(Parkinson's disease)。通常，此等神經元產生重要的大腦化學物質，稱為多巴胺，但當神經元死亡或變弱時，其產生較少多巴胺。多巴胺之此不足引起帕金森患者的運動問題。

乳酸菌(LAB)為一組通常用於產生醱酵食品之革蘭氏陽性細菌。已經廣泛研究LAB在膳食及臨床應用中之益處。然而，LAB之效力隨菌株變化。許多研究已展示產生及製造方法且食品載劑可影響益生菌菌株之特性，且對臨床介入研究之結果有影響。近期研究已揭露腸微生物群經由不同路徑(神經、免疫及內分泌)與中樞神經系統(CNS)通信，且引入腦腸軸(GBA)之想法。某些LAB菌株，亦稱為「精神益生菌」，經由GBA影響大腦功能且改善行為改變。已展示瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)ROO52減少嚙齒動物中焦慮樣行為(Ohland CL, Kish L, Bell H, Thiesen A, Hotte N, Pankiv E, Madsen KL (2013) Effects of Lactobacillus helveticus on murine behavior are dependent on diet and genotype and correlate with alterations in the gut microbiome. Psychoneuroendocrinology 38：1738-1747)。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)JB-1可經由迷走神經減少小鼠中壓力誘發之皮質酮及焦慮及抑鬱相關之行為以及中樞GABA受體表現(Bravo JA, Forsythe P, Chew MV, Escaravage E, Savignac HM, Dinan TG, Bienenstock J, Cryan JF (2011) Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve. Proc Natl Acad Sci USA 108：16050-16055)。熱殺死短乳桿菌(Lactobacillus brevis)SBC8803增加大鼠中傳出胃迷走神經活性及傳入腸迷走神經活性。洛德乳桿菌(Lactobacillus reuteri)可經由靶向腸感覺神經中之離子通道影響疼痛感覺(Horii Y, Nakakita Y, Misonou Y, Nakamura T, Nagai K (2015) The serotonin receptor mediates changes in autonomic neurotransmission and gastrointestinal transit induced by heat-killed Lactobacillus brevis SBC8803. Benef Microbes. 6(6)：817-22)。

已展示嬰兒雙叉桿菌(Bifidobacterium infantis)35624減少大鼠模 型中血漿皮質酮濃度及內臟疼痛(McKernan DP, Fitzgerald P, Dinan TG, Cryan JF. (2010) The probiotic Bifidobacterium infantis 35624 displays visceral antinociceptive effects in the rat. Neurogastroenterol Motil. 22(9)：1029-35, e268)。龍根雙叉桿菌(Bifidobacterium longum)1714減少壓力、焦慮及抑鬱相關之行為，而短型雙叉桿菌(Bifidobacterium brave)1205減少泛焦慮行為且誘導重量減輕(Savignac HM, Kiely B, Dinan TG, Cryan JF. (2014) Bifidobacteria exert strain-speciffic effects on stress-related behavior and physiology in BALB/c mice. Neurogastroenterol Motil. Nov；26(ll)：1615-27. doi：10.1111/nmo. 12427)。抑鬱可由大腦中缺乏神經傳遞素血清素引起。其他抑鬱原因由大腦中缺乏多巴胺引起。然而，帕金森氏病涉及神經細胞或神經元削弱及/或死亡且TS涉及多巴胺功能障礙，諸如多巴胺過量或突觸後多巴胺受體之過敏性。明顯地，抑鬱之原因及機制不同於TS及帕金森氏病之原因及機制，因此TS及帕金森氏病之治療、預防及/或抑制不可能自抑鬱之治療、預防及/或抑制獲得。

如上所示，不同雙叉桿菌屬菌株展現治療或預防疾病或病症之各種功能及有益作用，因此需要探究雙叉桿菌屬菌株之新功能。

本發明鑑別植物乳酸桿菌植物亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)PS128(下文中有時稱作PS128)展示治療或預防運動障礙之作用。因此，本發明提供一種治療或預防個體之運動障礙的方法，其包含向個體投與有效量的以DSMZ寄存編號DSM 28632寄存之植物乳酸桿菌植物亞種PS128之細胞。本發明亦提供一種以DSMZ寄存編號DSM 28632寄存之植物乳酸桿菌植物亞種PS128之用途，其用於製造供治療或預防個體之運動障礙用的製劑。在一些實施例中，製劑為藥物、保健食品或食品。

在一個實施例中，PS128具有如SEQ ID NO：3中所闡述之16S rDNA序列。在一個實施例中，PS228可呈可為活或死的全細菌形式使用。在一個實施例中，PS 128製備成組合物或混合物。

在一些實施例中，運動障礙包括(但不限於)基底神經節病症、特發性震顫、路易體疾病(Lewy body disease)、運動功能減退疾病、各種類型之外周神經病、肌張力障礙、運動功能減退(包括運動不能)、運動困難及抽動性病症。

圖1展示電泳照片，其展示植物乳酸桿菌菌株之ERIC-PCR型態，其中M表示DNA梯度；ATCC 14917^T表示植物乳酸桿菌植物亞種，且BCRC 17638^T表示植物乳酸桿菌亞種阿根托維達斯。

圖2A-2C展示MPTP腹膜內注射後(A：爬桿測試，B：狹窄光束測試，及C：旋桿測試)之結果。(n≧6，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

圖3A-3B展示黑質區域中TH陽性細胞之免疫螢光染色圖(圖3A)及定量(圖3B)。

圖4展示在第二處理後立即計數之BMC的數目，歷時35分鐘時間段。

圖5A-5D展示大鼠前額皮質中總DA(A)、DOPAC(B)及HVA(C)含量及神經傳遞素轉換率(DOPAC+HVA/DA(D))。

圖6A-6C展示大鼠之紋狀體DAT表現量(A)、DARPP磷酸化程度(B)及ERK磷酸化程度(C)。

圖7A-7C展示大鼠之前額皮質DAT表現量(A)、DARPP磷酸化程度(B)及ERK磷酸化程度(C)。

本發明意外地發現植物乳酸桿菌植物亞種PS128提供治療或預防 運動障礙、特別抽動性病症及基底神經節病症之有利作用。

在本文中未特定地定義之術語應根據將由熟習此項技術者鑒於本發明及上下文給出之涵義來理解。然而，如本說明書中所使用，除非相反說明，否則以下術語具有根據以下慣例指示之含義。

除非另外明確說明，否則與連接詞「及」關聯之一組項目不應理解為需要彼等項目中之每一者均存在於群組中，而應理解為「及/或」。類似地，除非另外明確說明，否則與連接詞「或」關聯之一組項目不應理解為在彼群組中需要相互排他性，而應理解為「及/或」。此外，除非明確陳述限於單數，否則雖然本發明的項目、要素或組分可用單數描述或主張，但其範疇內亦涵蓋複數。

如本文所用，除非另外明確陳述，否則術語「一個(a)」、「一種(an)」及「該(the)」應理解為意謂單數與複數兩者。因此，「一個」、「一種」及「該」(及適當時其語法變化)係指一或多個。

如本文所用，術語「病症」可與「疾病」或「病狀」互換使用。

術語「治療」理解為意謂減輕或減弱特定疾病或病狀之至少一種徵象、症狀、適應症或作用。如本文所用，「預防」理解為限制、降低發作速率或程度、或抑制疾病或病狀之至少一種徵象或症狀的發展。

在相關技藝中，咸了解術語「益生菌」為一種當足量投與時可賦予宿主保健效益之微生物。益生菌微生物必須滿足與沒有毒性、活力、黏附性及有益效用相關的若干需求。此等益生菌特徵視菌株而定，甚至視相同物種之細菌之間而定。

如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係指在合理醫學判斷範疇內，適合與個體(人類或非人類動物)組織接觸使用，無過度毒性、刺激、過敏性反應或其它問題或併發症，符合合理益處/風險比的化 合物、物質、組合物及/或劑型。各載劑、賦形劑等必須在與調配物之其他成分相容的意義上亦為「可接受」。適合之載劑、賦形劑等可見於標準醫藥學教科書中。

術語「可食載劑」係指適合與個體組織接觸之化合物、物質、組合物及/或劑型。各載劑必須在與調配物之其他成分相容的意義上亦為「可接受」。

如本文所用，術語「有效量」為在合理醫學判斷範疇內，組合物中各菌株之菌落形成單位(cfu)高至足以依積極方式顯著改變待治療之病狀，但低至足以避免嚴重副作用(合理益處/風險比)的量。

在一個態樣中，本發明提供一種治療或預防個體之運動障礙的方法，其包含向個體投與有效量的以DSMZ寄存編號DSM 28632寄存之植物乳酸桿菌植物亞種PS 128之細胞。本發明亦提供一種以DSMZ寄存編號DSM 28632寄存之植物乳酸桿菌植物亞種PS128之用途，其用於製造供治療或預防個體之運動障礙用的製劑。本發明亦提供一種以DSMZ寄存編號DSM 28632寄存之植物乳酸桿菌植物亞種PS128，其用於治療或預防個體之運動障礙。在一些實施例中，製劑為藥物、保健食品或食品。

在一個實施例中，植物乳酸桿菌植物亞種PS128具有如SEQ ID NO：3中所闡述之16S rDNA序列。

在一個實施例中，PS128可呈可為活或死的全細菌形式使用。細菌細胞較佳呈活細胞形式存在。在一個實施例中，PS128可為細菌之部分細胞，或活細胞與死的部分或全細胞之細胞混合物。

在一個實施例中，PS128製備成組合物或混合物。

運動障礙包括(但不限於)基底神經節病症、特發性震顫、路易體疾病、運動功能減退疾病、各種類型之外周神經病、肌張力障礙、運動功能減退(包括運動不能)、運動困難及抽動性病症。

在一個實施例中，基底神經節病症係指當大腦中稱為基底神經節之一組核無法適當地遏制不必要的動作，或無法適當地引發上部運動神經元迴路以起始運動功能時發生的一組身體功能障礙。增加之基底神經節輸出抑制丘腦皮質投影神經元。此等神經元之適當活化或失活為適當運動之整體組分。若某事引起過多基底神經節輸出，則丘腦皮質投影神經元變得過度抑制且一個人無法起始自發運動。此等病症稱為運動功能減退病症。然而，引起基底神經節異常低之輸出的病症引起丘腦皮質投影神經元抑制之相對缺乏。此情況導致無法遏制不必要的動作。此等病症稱為過動性病症。在一些實施例中，基底神經節病症包括(但不限於)單側抽搐(由丘腦下核損傷所引起的身體一側不可控運動)、肌張力障礙(由代謝、血管及結構異常引起之非自主性運動及意向運動減緩)、精神興奮劑成癮及亨廷頓氏病(主要為紋狀體損傷)、帕金森氏病(黑質緻密部中產生多巴胺之細胞的退化)；妥瑞症候群(Tourette syndrome)(由非運動迴路之功能障礙引起之抽動性病症)及強迫症(OCD，不能控制思想或動作)。

在一個實施例中，運動症狀為帕金森氏病、MPTP誘發之運動不足、運動緩慢及困難或慢性運動病症。

在一個實施例中，抽動性病症為妥瑞症候群、DOI誘發之抽動相關病症、慢性運動病症或發聲型抽動病症。

在一個實施例中，PS128展示保護宿主CNS中多巴胺激導性系統。在另一個實施例中，PS128拯救MPTP誘發之多巴胺激導性細胞退化且增加酪胺酸羥化酶(TH)表現量。

在一個實施例中，PS128展示調節基底神經節中多巴胺神經傳遞。在另一個實施例中，DOI誘發前額皮質多巴胺增加，而投與PS128調節此傾向且顯著增加前額皮質中多巴胺代謝物總含量及多巴胺轉換率。較佳地，神經傳遞素係選自由以下各者組成之群：多巴胺 (DA)、二羥基苯乙酸(DC)及高香草酸(HVA)。

在另一其他實施例中，PS128增加前額皮質及紋狀體中多巴胺轉運體表現量。此外，投與PS128後，多巴胺下游信號傳導(細胞外信號調節之激酶ERK；多巴胺及cAMP調節之磷蛋白DARPP)活化在大鼠紋狀體及前額皮質中增加，而多巴胺下游信號傳導在DOI治療期間顯著減弱。

在另一其他實施例中，PS128展示作為可改善運動病症且展示宿主CNS之神經保護作用的多巴胺信號傳導穩定劑(DSS)之能力。PS128可調節DA傳送且調節過度活動及活動不足功能，視普遍的多巴胺激導性緊張度而定。

P128之細胞可製備成組合物或混合物，呈適合於投與、尤其經口投與之任何形式。此包括例如固體、半固體、液體及粉末。

PS128細胞之投與量為每天至少10⁶菌落形成單位(cfu)的如上文所提及之PS128菌株：每天至少10⁷cfu、每天10⁸cfu或每天10⁹cfu的如上文所提及之PS128菌株。

較佳地，PS128細胞之投與量在每天10⁶至10¹⁴、10⁷至10¹⁴、10⁸至10¹⁴、10⁹至10¹⁴、10¹⁰至10¹⁴、10¹¹至10¹⁴、10¹²至10¹⁴、10¹²至10¹⁴、10¹³至10¹⁴、10⁶至10¹³、10⁶至10¹²、10⁶至10¹¹、10⁶至10¹⁰、10⁶至10⁹、10⁶至10⁸、10⁶至10⁷、10⁷至10¹³、10⁷至10¹²、10⁷至10¹¹、10⁷至10¹⁰、10⁷至10¹²、10⁷至10¹¹、10⁷至10¹⁰、10⁷至10⁹、10⁷至10⁸、10⁸至10¹³、10⁸至10¹²、10⁸至10¹¹、10⁸至10¹⁰、10⁸至10⁹、10⁹至10¹³、10⁹至10¹²、10⁹至10¹¹或10⁹至10¹⁰cfu範圍內PS128組合物或混合物之實例包括營養組合物或混合物，包括食品產品及尤其乳製品。

組合物或混合物可為例如膠囊、錠劑、飲品、散劑或乳製品。視情況，可存在其它LAB菌株。較佳地，本發明之營養組合物或混合 物為嬰兒食品、嬰兒奶粉配方或嬰兒後續配方。較佳地，本發明之組合物或混合物為營養食品或醫藥產品、食品產品、保健食品、營養補充劑或醫療食品。

本發明的營養組合物或混合物亦包括食物補充劑及功能性食品。「食品補充劑」表示由通常用於食物中之化合物製成，但呈錠劑、散劑、膠囊、飲劑之形式或通常不與食物相關且對健康具有有益作用的任何其他形式產品。「功能性食品」為一種亦對個人健康具有有益作用的食物。特定而言，食品補充劑及功能性食品可對疾病，例如對慢性疾病具有生理作用-保護性或治癒性。

若根據本發明之組合物或混合物為膳食補充劑，則其可原樣投與，可與諸如水、酸乳、牛奶或果汁之適合可飲用液體混合，或可與固體或液體食品混合。在此背景下，膳食補充劑可呈錠劑、丸劑、膠囊、口含錠、顆粒、散劑、懸浮液、藥囊、片劑、糖劑、條劑、糖漿之形式及對應投與形式，通常呈單位劑量形式。較佳地，包含本發明之組合物或混合物的膳食補充劑係呈在製備膳食補充劑之習知製程中製造的錠劑、口含錠、膠囊或散劑形式投與。

本發明藉由以下置於圖式簡單說明之前的實例更詳細地描述。然而，不言而喻，此等實例以例示本發明主題之方式給出，且不以限制其之任何方式構成。除非另有說明，否則百分比係以重量計。

實例 實例1 植物乳酸桿菌植物亞種PS128之分離及基因分型

植物乳酸桿菌植物亞種PS128(下文中稱為PS 128)自fu-tsai(臺灣傳統的醱酵氮芥產物)分離且在特定人工培養基中培養。藉由PCR擴增之16S rDNA之約1000個核苷酸之直接定序，分析來自PS128之16S rRNA基因(SEQ ID NO.3)，其中使用由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2表示之引子。基因組DNA提取、PCR介導之16S rDNA擴增、PCR產物 純化及純化之PCR產物之定序在表1中指示之條件下進行。

所得序列輸入由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)線上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供之比對軟體，人工比對且與屬於厚壁菌門(Firmicutes)之生物體之代表性16S rDNA序列相比。為進行比較，亦自NCBI線上提供之資料庫獲得16S rDNA序列。作為此分析之結果，以下表2列出16S rDNA序列展示與植物乳酸桿菌植物亞種PS128之16S rDNA序列相比最高相似性值的彼等生物體。

PCR條件：98℃ 2.5分鐘；15個循環(98℃ 15秒；50℃ 30秒；72℃ 20秒)；72℃ 5分鐘；4℃，∞。

PS128之部分16S rDNA序列展示與植物乳酸桿菌植物亞種之最高 相似性。因此，PS128表示植物乳酸桿菌植物亞種之一種菌株，且亦表示乳桿菌屬內一種新物種。

植物乳酸桿菌植物亞種PS128根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)於2014年3月31日寄存於Leibniz研究所DSMZ-德國微生物與細胞培養基保藏(Inhoffenstr.7 B,D-38124 Braunschweig,Germany)，且已由國際保存機構給予DSMZ寄存編號DSM 28632。此生物材料經受存活力測試且通過。

植物乳酸桿菌植物亞種PS12816S rDNA序列(SEQ ID NO：3)

實例2 使用ERIC-PCR型態鑑別植物乳酸桿菌植物亞種PS128之新穎菌株

進行ERIC-PCR以進一步區分具有高度序列相似性之細菌亞種。植物乳酸桿菌菌株之ERIC-PCR型態在表3中指示之條件下進行。自PS128提取之DNA及兩種植物乳酸桿菌菌株用作模板。如圖1中所示，所得擴增產物進行電泳且比較圖案，其中使用由SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5表示之引子。

ERIC1R：(5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’)(SEQ ID NO：4)

ERIC2F：(5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’)(SEQ ID NO：5)

PCR條件：94℃，5分鐘；35個循環(94℃，30秒；45℃，1分鐘；65℃，6分鐘)；65℃，6分鐘；4℃，∞。

如圖1中所示，泳道M表示DNA梯度(250-10000bp)；ATCC 14917^T表示植物乳酸桿菌植物亞種；且BCRC 17638^T表示植物乳酸桿菌亞種阿根托維達斯。

如白色箭頭所指示，在ATCC 14917^T或BCRC 17638^T之條帶中，PS128之條帶位置獨特，且因此圖1中之結果展示即使PS128及ATCC 14917^T均屬於植物乳酸桿菌植物亞種，其仍為不同菌株。因此，PS128表示植物乳酸桿菌植物亞種之一種新菌株。

實例3 分析型態指數(API)分型

使用API 50 CHL套組(bioMerieux,France)研究本發明中使用之PS 128的糖利用，且結果展示於表4中。醱酵測試表明PS128具有類似於植物乳酸桿菌植物亞種之生物化學特性。

實例4 製備PS128用於動物處理

PS128接種在培養基(10%脫脂牛奶、1%酵母粉末、0.1%tween 80及2%葡萄糖)中，在37℃下培養18小時，且藉由離心收穫。將PS128與保護劑(脫脂牛奶1%、糖2%、果寡糖2%、麥芽糊精3%及丙三醇2%)及容器一起包埋且凍乾至每公克粉末5×10⁹群落形成單位(CFU)之最終濃度。PS128粉末儲存在-20℃下且溶解於生理食鹽水溶液中達10¹⁰CFU/mL，接著進行動物處理。

實例5 植物乳酸桿菌植物亞種PS128改善MPTP誘發之運動缺乏及保護小鼠大腦中之多巴胺激導性系統 (1)動物及圈養

六至八週齡雄性C57BL/6J小鼠(20至22g)購自國家實驗動物中心 (臺灣臺北)。小鼠圈養在恆定溫度及濕度下，12小時光-暗週期，且自由取用食品及水。所有動物實驗程序由國立陽明大學(National Yang-Ming University)之動物管理委員會評述及批准。

(2)實驗程序

小鼠分別經口投與PS 128(每天10⁹CFU/mL)或生理食鹽水(每天0.2mL)28天。第24天至第28天，小鼠每天腹膜內注射MPTP(300mg/kg)。在第28天最後一個MPTP處理後展示爬桿測試、狹窄光束測試及旋桿測試。第24天至第28天，L-DOPA組每天經口投與100mg/kgL-DOPA+25mg/kg苄絲肼及腹膜內注射MPTP(300mg/kg)，且展示為陽性對照。為進一步分析，處死小鼠以在所有行為測試後取出大腦組織、盲腸組分及血液。

(3)爬桿測試

爬桿測試為一種可用於評估小鼠運動障礙之方法。參見圖2A，小鼠頭朝上置放在垂直粗糙表面桿(直徑1cm；高50cm)之頂部上，且記錄直至其下降至地板之時間，最大持續時間為120s。即使小鼠下降部分路徑且路徑其餘部分掉落，亦對行為評分直至其達到地板。當小鼠不能朝下轉向且實際上自桿落下時，運動活性時間(Tla)因為最大嚴重程度而視為120s(預設值)。

(4)狹窄光束測試

狹窄光束測試為一種可用於評估小鼠運動協調及平衡之方法。參見圖2B，光束設備由50cm光束組成，其中具有0.8cm寬度之平坦表面擱在兩個桿上桌子頂部上方50cm處。在光束末端時置放黑色盒作為結束點。來自家籠之飼料置於黑色盒中以吸引小鼠至結束點。在訓練日，小鼠置於黑色盒中5分鐘以熟悉環境。此後，各小鼠跨越5cm光束3次，接著為15cm、30cm及50cm光束訓練。在測試當日，各小鼠展示光束測試3次且記錄跨越時間。

(5)旋桿測試

旋桿測試廣泛用於評估嚙齒動物之運動協調。參見圖2C，使用具有鼓、自動計時器及落下感測器之旋桿機。在注射MPTP前，小鼠進行旋桿前訓練(30rpm旋轉速度180秒)3天。在測試當日，各小鼠連續(各測試之間1分鐘時間間隔)展示旋桿測試(30rpm旋轉速度180秒)3次，且記錄剩餘時間。

(6)藉由免疫組織化學定量酪胺酸羥化酶陽性之多巴胺激導性細胞

小鼠用戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，且經賁門灌注磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)，接著為含4%多聚甲醛之PBS。立即移除大腦，置放於相同固定劑中隔夜，且接著轉移至4℃下30%蔗糖溶液，接著在低溫恆溫器上以40μm切片。

切片藉由洗滌緩衝液洗滌3次(含0.1%triton X100及0.01%疊氮化鈉之PBS)且接著在阻斷緩衝液中在震盪下在室溫下培育1小時。阻斷程序後，切片與初級抗體(抗酪胺酸羥化酶，1：300，Millipore)及Hoechst 33258(1：2000，LIFE TECHNOLOGIES)一起在PBST(含0.3% triton X100、0.01% BSA、0.01%疊氮化鈉及3%驢血清之PBS)中在4℃下培育隔夜。在洗滌緩衝液中在震盪下洗滌三次後，在震盪下在室溫下切片與二級抗體(FITC結合之親和純化驢抗小鼠IgG(H+L)，1：300，Jackson ImmunoResearch)及Hoechst在PBST中一起培育2小時。接著切片在洗滌緩衝液中洗滌三次且藉由安裝具有封固劑之蓋玻片來密封。

藉由共聚焦顯微鏡leiss zsm700使免疫染色切片成像。使用多波長細胞評分應用程式，用MetaMorph軟體在來自Bregma之替代切片(-2.92至-3.8mm)上測定TH陽性細胞數目。參見圖3A-3B，以生理食鹽水對照組之百分比展示黑質區域中TH陽性細胞之免疫螢光染色圖(圖3A)及定量(圖3B)。

實例6 植物乳酸桿菌植物亞種PS128改善DOI誘發之背部肌肉收縮及 大鼠大腦中異常多巴胺信號傳導路徑 (1)動物及圈養

六至八週齡雄性威斯塔大鼠(220至330g)購自BioLASCO Taiwan Co.,Ltd(臺灣臺北)。大鼠圈養在恆定溫度及濕度下，12小時光-暗週期，且自由取用食品及水。所有動物實驗程序由國立陽明大學之動物管理委員會評述及批准。

(2)實驗程序及背部肌肉收縮(BMC)次數計數

大鼠分別經口投與PS128(每天10¹⁰CFU/mL)或生理食鹽水(每天1mL)15天。藉由兩劑5-HT2A/C-受體促效劑2,5-二甲氧基-4-碘安非他命(DOI)(其產生穩固頻率之背部肌肉收縮(BMC))建立抽動樣行為。在第14天大鼠靜脈內注射DOI(200μg/kg)作為初級處理，且在第15天腹膜內注射DOI(1mg/kg)作為次級處理。在第二處理後立即計數BMC數目，歷時35分鐘時間段。氟哌啶醇(Hal)組分別投與多巴胺拮抗劑氟哌啶醇(每天1mg/kg)15天且同樣顯示為陽性對照。參見圖4，僅在沿背部，自頸後至尾部掃描，存在清晰強力收縮時才計數BMC(Fone等人，1989)。為進一步分析，處死大鼠以在記錄BMC後取出大腦組織、盲腸組分及血液。

(3)藉由高效液相層析-電化學偵測(HPLC-ECD)定量單胺及其代謝物

HPLC-ECD系統包含微型泵(CMA-100,CMA,Stockholm,Sweden)、線上噴射器(CMA-160)、Microtech LC泵(Microtech Scientific,Sunnyvale,CA,USA)、BAS-4C電化學偵測器(Bioanalytical Systems,Inc.,West Lafeyette,IN,USA)及逆相管柱(Kinetex C18,2.6μm,100×2.1mm I.D.；Phenomenex,USA)。在室溫(25℃)下玻璃態碳工作電極之電位設定在相對於Ag/AgCl參考電極+650mV。含有0.1M NaH₂PO₄、8%甲醇、0.74mM 1-辛烷磺酸(鈉鹽)、0.03mM乙二胺四乙酸(EDTA)及2mM KCl之移動相用H₃PO₄調整至pH 3.74。前額皮質及 紋狀體藉由音波處理溶解且在12,000×g下離心10分鐘，且所得上清液經由0.22mm聚偏二氟乙烯膜(4mm針筒過濾器；Millex-GV,Millipore,USA)過濾，接著分析。將稀濾液(20μL)以0.2mL/min之流速噴射至層析系統中。樣品中多巴胺(DA)、二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、血清素(5-HT)及5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)使用在1至100ng/mL範圍內之標準品(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)內插。

參見圖5A-5D，大鼠前額皮質中總DA(圖5A)、DOPAC(圖5B)及HVA(圖5C)含量以每公克組織濕重之奈克數展示且神經傳遞素轉換率(DOPAC+HVA/DA，圖5D)以總前額皮質DA含量之百分比展示。圖5A中，第二PS128條係指僅僅投與PS128(僅僅細菌對照組)，其展示對DA總含量無顯著影響；第四條係指投與氟哌啶醇(Hal)；且最後一個PS128條係指投與PS128至接收DOI之小鼠。第三條及第五條展示DOI顯著增加前額皮質中DA量，而PS128投與調節此傾向。圖5B-5D展示在接收PS128之DOI誘發之小鼠中DA代謝速率增加，因此PS128能夠調節大腦中異常遞增之DA信號傳送。

(4)西方墨點法

為證實PS128對DOI誘發之異常多巴胺信號傳導路徑的作用，藉由西方墨點法，測定大鼠前額皮質及紋狀體中之總蛋白質。提取物在10%聚丙烯醯胺凝膠上分級分離且接著電泳轉移至聚偏二氟乙烯膜(Roche Ltd.)，接著用阻斷緩衝液含有5%脫脂牛奶之TBST阻斷1小時，且與初級抗體(抗DAT 1：500；抗pDARPP32 1：500；抗pERK 1：1000；DARPP32 1：1000；ERK 1：1000；Santa Cruz Biotechnology,inc.)一起在阻斷緩衝液中在4℃下培育隔夜。用TBST洗滌兩次後，膜與用辣根過氧化酶構築之二級抗體一起在阻斷緩衝液中培育。抗體-蛋白質複合物藉由Immobilon^TM西方化學發光HRP受質(Millipore inc.)目測。且藉由發光成像分析器(FUJIFILM Holdings Corporation)偵 測。參見圖6A-6C，大鼠紋狀體DAT表現量(圖6A)、DARPP磷酸化程度(圖6B)及ERK磷酸化程度(圖6C)展示以相對於對照組之改變倍數。參見圖7A-7C，大鼠前額皮質DAT表現量(圖7A)、DARPP磷酸化程度(圖7B)及ERK磷酸化程度(圖7C)以相對於對照組之改變倍數展示。

【生物材料寄存】

寄存機構：財團法人食品工業發展研究所

寄存日期：民國103年4月17日

寄存編號：BCRC 910622

<110> 益福生醫股份有限公司 上海聯亞益生生物科技有限公司

<120> 利用乳酸菌預防或治療運動障礙之方法

<130> B90531/CN24769

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S rDNA之PCR擴增之引子

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S rDNA之PCR擴增之引子

<400> 2

<210> 3

<211> 1476

<212> DNA

<213> 植物乳酸桿菌植物亞種PS128

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ERIC-PCR之引子

<400> 4

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ERIC-PCR之引子

<400> 5

Claims (15)

1. 一種以DSMZ寄存編號DSM 28632(食品工業發展研究所寄存編號：BCRC 910622)寄存之植物乳酸桿菌植物亞種(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)PS128的用途，其用於製造供治療或預防個體之基底神經節病症或抽動性病症之藥物。
2. 如請求項1之用途，其中植物乳酸桿菌植物亞種PS128具有如SEQ ID NO：3中所闡述之16S rDNA序列。
3. 如請求項1之用途，其中PS128細胞之投與量為每天至少10⁶cfu。
4. 如請求項1之用途，其中PS128可呈全細菌形式使用。
5. 如請求項1之用途，其中PS 128製備成組合物或混合物。
6. 如請求項5之用途，其中PS128細胞之投與量為每天10⁶至10¹⁴cfu。
7. 如請求項5之用途，其中該組合物或混合物為營養或醫藥組合物或混合物。
8. 如請求項5之用途，其中該組合物或混合物為醫藥產品、食品產品、保健食品產品、營養補充劑或醫療食品。
9. 如請求項5之用途，其中該組合物或混合物製備成膠囊、錠劑、飲品、散劑或乳製品。
10. 如請求項1之用途，其中PS128用於經口投與。
11. 如請求項1之用途，其中該基底神經節病症為單側抽搐、肌張力障礙、精神興奮劑成癮及亨廷頓氏病(Huntington's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、妥瑞症候群(Tourette syndrome)或強迫症。
12. 如請求項1之用途，其中該抽動性病症為妥瑞症候群、2,5-二甲 氧基-4-碘安非他命(DOI)誘發之抽動相關病症、慢性運動病症或發聲型抽動病症。
13. 如請求項1之用途，其中PS128展示調節基底神經節中多巴胺神經傳遞。
14. 如請求項1之用途，其中PS128展示調節前額皮質中神經傳導素之含量，其中該神經傳遞素係選自由以下各者組成之群：多巴胺(DA)、二羥基苯乙酸(DC)及高香草酸(HVA)。
15. 如請求項1之用途，其中PS128增加前額皮質中多巴胺轉換率。