KR101087972B1 - 치매, 치매관련 질환의 예방/치료 및 인지기능장애 개선에 효과가 있는 유산균 발효 산물, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치매, 치매관련 질환의 예방/치료 및 인지기능장애 개선에 효과가 있는 유산균 발효 산물, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것으로 보다 상세하게는 밀크 포함 배지에 유산균을 배양, 발효하여 얻은 유산균 발효물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 치매 또는 인지기능 장애 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 밀크 포함 배지에서 유산균을 배양, 발효시켜 얻은 유산균 발효물, 이의 제조방법 및 용도를 제공한다. 상기 발효물은 Aβ의 생성을 유도하는 아밀로이드 생성과정의 β-세크리타제 활성을 억제함으로써 APPβ의 생성을 선택적으로 저해하는 활성성분이 포함되어 있어 치매, 치매관련 질환 예방 및 치료 또는 인지기능 개선이나 인지기능 장애의 예방 및 치료의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
치매, 알츠하이머병, β-세크리타제, 유산균, 인지기능

Description

치매, 치매관련 질환의 예방/치료 및 인지기능장애 개선에 효과가 있는 유산균 발효 산물, 이의 제조방법 및 용도{Product fermented by lactic acid bacteria effective to prevention and treatment of dementia, dementia-related disease and improvement of cognition impairment and preparation method and use thereof}
본 발명은 치매, 치매관련 질환의 예방/치료 및 인지기능장애 개선에 효과가 있는 유산균 발효 산물, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것으로 보다 상세하게는 밀크 포함 배지에 유산균을 배양, 발효하여 얻은 유산균 발효물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 치매 또는 인지기능 장애 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
치매 (dementia)는 여러 원인 질환들에 의해 사람의 지적능력과 사회적 활동을 할 수 있는 능력이 소실되어 일상생활의 장애를 가져오는 일종의 증후군이다. 즉, 치매는 신경세포의 손상 및 손실에 의해 나타나는 뇌 질환으로서 기억, 집중, 언어 및 인지 등에 심한 장애가 오랜 시간 동안 점진적으로 진행되어 궁극적으로는 사망에 이르게 하는 질환이다.
원인 질환들로는 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 혈관성 치매 (Vascular dementia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease), 루이체 치매(Lewy body dementia), 무도병 (Huntington's disease), 크루츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jacob disease), 픽스씨 병 (Pick's disease) 등이 알려져 있다.
이들 원인 질환들 중 가장 높은 발병 비율을 차지하는 것은 알츠하이머병으로 전체 치매 환자의 50~70%를 차지한다. 알츠하이머병은 원인에 따라 산발성 (sporadic type)과 가족성 (familial type)으로 구별되어 지며 80% 이상이 산발성으로 발병 원인이 알려져 있지 않으며 대부분 65세 이후에 발병하는 것으로 알려져 있다 (Physiol Rev 2001, 81:741-66). 가족성은 전체의 20% 미만을 차지하며 아밀로이드 전구 단백질 (amyloid precursor protein 이하 APP), presenilin 1 (PS1) 및 presenilin 2 (PS2)등의 유전자들의 변이가 주원인으로 100% 발병되며 발병 시기도 빨라 65세 이하에서 일어난다. 알츠하이머병은 노인반 (senile plaque) 및 신경원 섬유 농축체 (neurofibrillary tangle)가 각각 신경세포 외부 및 내부에 축적되는 병리학적인 특징을 보인다. 노인반은 대체적으로 구형으로 변연계 (limbic system)나 신피질 (neocortex)에서 주로 발견되며 베타 아밀로이드 (β-amyloid, 이하 Aβ)라는 펩티드가 서로 결합 및 침착하여 핵을 형성하고 주위에는 퇴화된 신 경섬유 축색돌기 (axon), 수지상 결정 (dendrites), 활성화된 아교세포 (microglia)와 성상세포 (astrocyte)들이 모여 있는 형태이다. 신경원 섬유 농축체는 타우 (tau)라는 단백질이 비정상적으로 많이 인산화된 후 서로 결합하여 형성된 신경세포 내의 물질로 알츠하이머병 치매 환자의 여러 뇌조직에서 관찰된다.
알츠하이머병을 포함한 치매 환자 수는 인구의 고령화로 인해 지속적인 증가세를 보이고 있다. 한국보건사회연구원 조사 자료에 의하면 2005년 현재 65세 이상 노인 인구의 약 8.3%인 35만 여명이 치매환자이고 향후에도 노인 인구의 증가에 따라 꾸준히 증가하여 2015년에는 약 53만 명이 될 것으로 예측하고 있다. 비록 치매 환자 수가 전체 인구에서 차지하는 비율은 적지만, 중증 치매환자 1인의 1년 치료 및 간병 비용이 최소 1억 원 이상 소요되는 등 사회경제적으로 막대한 부담이 따르기 때문에 치매 치료를 위한 많은 연구가 수행되고 있으며 국내에서도 최근 치매 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재까지 연구 결과들에 의하면 알츠하이머병의 주요 원인 물질은 노인반을 구성하는 Aβ로 이들이 신경세포의 손상을 일으켜 알츠하이머병을 일으키는 것으로 알려져 있다. Aβ는 가족성 알츠하이머병의 주요 발병 유전자들 중 하나인 APP가 β-세크리타제(β-secretase) 및 γ-세크리타제(γ-secretase)에 의해 분해되어 형성된 펩티드로 40~42개의 아미노산으로 구성되어 있다(Nature, 1999, 402:533-7). 이러한 작용기전에 기초하여 Aβ의 생성을 억제하는 β- 및 γ-세크리타제의 저해 제, α-세크리타제 활성 촉진제 등의 개발 연구가 진행되고 있고 이외에도 Aβ의 축적을 억제하거나 축적된 Aβ분해를 촉진하는 약물들도 개발 중에 있다 (Nat Rev Neurosci, 2004, 5:677-85). 최근에는 Aβ를 백신으로 개발하려는 노력 또한 다국적 제약사에 의해 시도되고 있다. 그러나 작용기전에 기초한 치매 치료제는 상품화되기에는 많은 시간이 필요한 단계이고 현재 시판 중인 것들은 기억 개선과 단기적인 완화효과를 보이는 아세틸콜린 에스터라아제 저해제인 코그넥스 (Tacrine), 아리셉트 (Donepezyl), 엑셀론 (Rivastigmin), 레미닐 (Galantamine)과 NMDA 수용체 길항체인 메만틴 (Ebixa) 등이 있다. 여기에 니세로골린, 엘카르니틴, 은행잎 추출물 등의 혈액 순환 개선제도 간접적으로 혈관성 치매에 효과가 있다고 확인되어 사용되고 있다.
상기와 같이 살펴본 바와 같이 현재 치매 치료제는 주로 초기 치매 증상을 완화하는 역할을 하지만 치료 효과가 미약하고 작용기전에 기초한 신약은 아직 개발 및 출시에 많은 시간이 요구되며 후보 약물들이 부작용 및 기대만큼 치료 효능이 나타나지 않아 임상에서 실패를 하고 있다 (J Alz Dis. 2008, 15;327-338). 이러한 이유 및 예방 차원의 목적으로 장기 복용 시 무해하며 알츠하이머병의 예방 및 개선효과를 보이는 새로운 물질이 요구되어 왔다.
유산균은 오랜 기간 동안 사용되어왔으며 유산균 발효식품을 상시 복용하는 불가리아 사람이 건강한 상태로 장수 하는 비율이 높다고 인정되고 있다. 또한 메 치니코프의 연구에 의하면 장내 유해 세균에 의해 생성되는 유해 물질이 혈액 속으로 유입되어 건강을 위협하는 것으로 보고 된 이후 장내 균총을 유익한 유산균으로 대체하는 시도로부터 유산균의 기능에 대한 많은 연구가 이루어져 정장 작용, 항암 효과, 면역 증강 효과 및 노화 억제 효과 등 많은 유익한 기능들이 보고 되었고 (Trends Biotechnol, 1997, 15;270-274) 현재 유산균 및 발효물들이 의약품 또는 건강식품으로 널리 사용되고 있다.
이에 본 발명자들은 치매, 치매관련 질환 및 인지기능 장애와 관련된 새로운 소재를 탐색하기 위하여 연구한 결과, 우유(milk) 성분이 함유된 배지를 유산균으로 배양, 발효시키는 경우 β-세크리타제 작용을 억제하여 치매의 예방 및 치료에 효과를 보이는 발효산물이 생성되고, 동물실험을 통해 상기 발효산물이 치매 예방/치료 및 인지기능 향상에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 치매, 치매관련 질환 및 인지기능 장애 개선, 예방 및 치료에 효과를 보이는 새로운 발효산물, 이의 제조방법 및 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀크 포함 배지에 유산균을 배양, 발효하여 얻은 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 치매 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 밀크 포함 배지에 유산균을 접종, 배양하여 발효시키는 단계; (b) 상기 발효물에서 유산균을 제거하는 단계; 및 (c) 유산균이 제거된 발효물을 아세톤, 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매로 활성성분을 분리하는 단계를 포함하는 유산균 발효물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀크 포함 배지에 유산균을 배양, 발효하여 얻은 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 인지기능 장애 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀크 포함 배지에 유산균을 배양, 발효하여 얻은 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 인지기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 유산균 발효물은 밀크 포함 배지에 유산균을 배양, 발효시켜 얻는 것을 특징으로 하며, 치매 예방 및 개선, 치료의 목적, 또는 인지기능의 향상이나, 인지기능 장애의 개선, 예방 및 치료의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 유산균은 당업계에 공지된 것을 단독 또는 조합하여 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비셀라(Weissella) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속의 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유산균을 의미하며, 상기 유산균은 바람직하게는 1010∼1011CFU/㎖로 농축하여 사용될 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스 속 유산균, 엔테로코커스 속 유산균 또는 비피도박테리움 속 유산균일 수 있으며, 더 바람직하게는 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이 (L. casei), 락토바실러스 람노서스 (L. rhamnosus), 락토바실러스 가세리 (L. gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스 (L. helveticus), 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum), 락토바실러스 파라카세이 (L. paracasei), 락토바실러스 플랜타럼 (L. plantarum), 락토바실러스 루테리 (L. reuteri), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 락티스 (B. lactis), 엔테로코커스 패컬리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움 (E. faecium), 락토바실러스 브레비 (L. breve), 비피도박테리움 롱검 (B. longum), 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum), 락토바실러스 살리바리우스 (L. salivarius), 락토바실러스 불가 리쿠스 (L. bulgaricus) 단독 또는 이들의 혼합 균주일 수 있고, 가장 바람직하게는 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) ATCC 4356, 락토바실러스 카세이 (L. casei) ATCC 393, 락토바실러스 람노서스 (L. rhamnosus) ATCC 7469, 락토바실러스 가세리 (L. gasseri) ATCC 33323, 락토바실러스 헬베티쿠스 (L. helveticus) ATCC 15009, 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum) ATCC 14931, 락토바실러스 파라카세이 (L. paracasei) ATCC 25302, 락토바실러스 플랜타럼 (L. plantarum) ATCC 14917, 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) ATCC 23272, 비피도박테리움 애니말리스 (Bifidobacterium animalis) ATCC 25527, 비피도박테리움 락티스 (B. lactis) DSM 10140, 엔테로코커스 패컬리스 (Enterococcus faecalis) ATCC19433, 엔테로코커스 패시움 (E. faecium) ATCC 19434, 락토바실러스 브레비 (L. breve) ATCC 15701, 비피도박테리움 롱검 (B. longum) ATCC 15707, 락비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATCC29521, 락토바실러스 살리바리우스 (L. salivarius) ATCC 11742, 락토바실러스 불가리쿠스 (L. bulgaricus) ATCC 11842 단독 또는 이들의 혼합 균주일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 유산균의 배양은 당업계에 공지된 유산균 배양방법에 의할 수 있다. 아울러, 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지 또는 유성분을 이용한 유청배지, 탈지유 배지 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 탄소원으로 이용 가능한 것은, 글루코스, 수크로스, 말토스, 프럭토스, 락토스, 자일로스, 갈락토스, 아라비노스 및 이들의 조 합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 수크로스, 프럭토스, 글루코스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직하게는 글루코스이다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 질소원으로 이용 가능한 것은, 효모 추출물, 소이톤(soytone), 펩톤, 비프 추출물(beef extract), 트립톤, 카시톤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 효모 추출물, 펩톤, 트립톤 및 소이톤으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직하게는 효모 추출물 또는 소이톤이다.
특히, 본 발명에서 배양 배지는 밀크(milk) 포함 배지이며, 밀크는 자연상태의 포유류의 젖(우유, 양유, 산양유, 염소유, 낙타유 등)이나, 이를 가공한 것을 사용할 수 있다. 가공한 밀크의 예로는 분유를 들 수 있으며, 원래의 밀크 성분을 그대로 포함하고 있는 전지분유와 밀크에서 지방을 분리하고 남은 탈지유를 건조하여 만든 탈지분유, 모두를 포함한다. 본 발명의 배지는 바람직하게는 SG 배지 또는 우유를 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 유산균 발효물은
(a) 밀크 포함 배지에 유산균을 접종, 배양하여 발효시키는 단계;
(b) 상기 발효물에서 유산균을 제거하는 단계; 및
(c) 유산균이 제거된 발효물을 아세톤, 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어 진 군에서 선택된 용매로 활성성분을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다.
(a) 단계에서는 밀크 포함 배지에 유산균을 접종하고, 이를 배양하여 발효시킨다. 유산균의 접종은 배양 조건하에서 유산균이 충분히 증식할 수 있도록 전배양된 유산균을 적당한 양으로 배양배지에 첨가함으로써 수행된다. 접종하는 유산균의 양은 전배양된 유산균 배양액을 배양배지에 1 내지 5%(v/v)정도로 첨가할 수 있다. 유산균의 배양 및 발효는 당업계에 알려진 밀크 포함 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다.
또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 호기상태를 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수도 있다. 배양시의 온도는 보통 25 ℃ 내지 40 ℃, 바람직하게는 35 ℃ 내지 40 ℃이며, 7시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다.
(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 배양되어 발효된 발효물에서 유산균을 제 거한다. 발효물의 상태는 배양 조건 및 접종한 유산균 등에 따라서 상이할 수 있으나, 함유되어 있는 밀크 성분으로 인해서 커드(curd) 형성이 있었고 유청과 분리되는 현상이 나타난다. 배양 종료 후에 발효물(발효 산물, 배양물, 배양 산물)에서 유산균 균체를 분리, 제거하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 이 때, 균체의 제거는 통상적인 균체의 제거를 위한 방법을 통해 유산균 균체가 실질적으로 제거된 것을 나타낸다.
(c) 단계에서는 상기 (b) 단계를 통해 유산균이 제거된 발효물을 아세톤, 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매로 활성성분을 침전시킨다. 활성성분의 침전은 활성성분의 분리 및 농축을 위하여 수행되는 것으로 발효물에 아세톤이나 탄소수 1 내지 6의 알코올을 첨가하고, 침전물을 얻는 방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 침전은 에탄올을 이용하여 수행될수 있으며, 보다 바람직하게는 식용이 가능한 주정을 이용하여 수행될 수 있다. 보다 구체적으로 침전용매를 발효물 부피 대비 1배 내지 4배이하로 가하여 혼합하고, 원심분리하여 활성성분을 분리할 수 있다. 바람직하게는 침전용매를 발효물(또는 한외여과시킨 발효물) 부피 대비 1배로 가하여 혼합하고, 원심분리하여 침전물을 제거한 다음 다시 상등액에 침전용매를 상등액 부피 대비 1배로 가하여 혼합하고, 원심분리하여 활성성분이 침전된 침전물을 얻을 수 있다. 이 때, 활성성분을 침전시키기 위하여 상기 과정을 1회 더 반복할 수도 있다.
침전된 활성성분은 그 자체 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 유산균 발효물의 제조방법은 활성성분의 원활한 분리 및 농축을 위하여 분자량 5,000이하의 물질을 한외여과(ultrafiltration)하여 한외여과액을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이에 본 발명의 제조방법은
(a) 탈지분유 또는 우유 포함 배지에 유산균을 접종, 배양하여 발효시키는 단계;
(b) 상기 발효물에서 원심분리하여 유산균을 제거하는 단계;
(c) 유산균이 제거된 발효물에서 분자량 5,000이하의 물질을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 수득된 물질에 아세톤, 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매로 활성성분을 분리하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.
(a), (b) 및 (d) 단계는 상기에서 기재된 바에 따라 수행될 수 있다.
상기에서 (c) 단계에서는 (b) 단계를 통해 유산균이 제거된 발효물에서 분자량 5,000이하의 물질을 수득한다. 이는 바람직하게는 분자량 5,000이하의 물질만을 통과(filter)시키는 필터를 이용하여 한외여과(ultrafiltration)하여 한외여과액을 수득하는 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
한편, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 유산균 발효물을 제공한다. 본 발명의 유산균 발효물은 밀크 성분의 발효를 통해 생성된 활성성분이 포함되어 있으며, 이는 치매, 치매관련 질환의 개선, 예방 및 치료와 두뇌 또는 인지기능의 증진, 인지기능 장애의 개선, 예방 및 치료에 효과적이다.
한편, 알츠하이머병의 원인 단백질인 Aβ의 생성은 전구 단백질인 APP가 아밀로이드 생성과정(amyloidogenic pathway)을 통해 형성된다 (Nature, 1999, 402:533-7). 이 과정에는 β- 및 γ-세크리타제라는 단백질 분해효소가 작용한다. 먼저 β-세크리타제는 APP 내에 존재하는 Aβ의 N 말단에 작용하여 APPβ와 Aβ를 포함하는 CTFβ를 생성한다. 신경세포는 Aβ를 생성하는 아밀로이드 생성과정과 함께 이의 생성을 억제하는 비-아밀로이드 생성과정(non-amyloidogenic pathway)이 함께 존재한다. 이 과정에는 α-세크리타제라는 단백질 분해효소가 APP 내의 Aβ의 16번째 아미노산에 작용하여 Aβ의 N 말단으로부터 16개의 아미노산이 추가된 APPα와 Aβ의 17번째 아미노산부터 포함하고 있는 CTFα를 형성한다. α-세크리타제의 작용은 Aβ의 생성을 억제할 뿐 아니라 형성된 APPα는 신경세포 보호작용이 있는 것으로 알려지고 있다. 신경세포에는 상기 두 가지 경로가 균형을 이루고 있어 Aβ의 과잉생산을 억제하고 있으나 외부 환경, 노화, 유전적 소인 등 다양한 요소들에 의해 아밀로이드 생성과정이 강화되어 알츠하이머병이 발병된다고 한다. 이러한 작용 기전에 기초한 알츠하이머병 치매 치료제 개발 및 연구를 위해 아밀로이드 생성과정이 강화된 세포주 및 동물 모델들이 제작되어 사용되고 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 제조방법에 따라서 유산균 균주를 밀크 포함 배지에서 배양하고, 유산균 균체를 제거한 다음, 활성성분을 침전시켜 유산균 발효물을 제조하고, APP 대사에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 엔테로코커스 패시움 ATCC 19434, 락토바실러스 브레비 ATCC 15701, 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707, 비피도박테리움 비피덤 ATCC29521 주정 침전물들은 APPβ의 생성을 저해하지 않거나 약한 저해 효과를 보였으나 이외의 14종의 유산균주 주정침전물에서는 최소 45.2% (엔테로코커스 패컬리스 ATCC19433)에서 최고 85.4% (비피도박테리움 락티스 DSM 10140)까지 APPβ의 생성을 저해하였고, 1:4 주정 침전물 처리 시에는 엔테로코커스 패시움 ATCC 19434와 락토바실러스 불가리쿠스 ATCC 11842의 주정 침전물이 비교적 약한 저해율을 보인 반면 나머지 16종의 균주 주정침전물은 우수한 억제효과를 보였으며, 1:4 주정 침전물 처리 시 가장 우수한 억제효과를 보인 것은 락토바실러스 애시도필러스 ATCC 4356 주정침전물로 93.3%의 억제율을 보였으며 대부분의 유산균주 주정 침전물에서 60% 이상의 억제율을 보임을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 발효산물이 치매나 이와 관련된 질환인 알츠하이머병에 효과적인지 확인하기 위하여 랫트에 각 주정 침전물을 경구 투여 후 Aβ40 변화를 측정하였다. 그 결과, 각 주정 침전물을 투여 시 Aβ40이 최소 11.7%에서 최고 45%억제 되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로 본 발 명의 유산균 발효물이 알츠하이머병 치매 동물모델의 치매 개선효과를 보임을 알 수 있었다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 인지기능 개선 정도를 확인하기 위해 9주령 우성 ICR 생쥐를 이용하여 수중 미로(water maze)시험을 실시하였다. 그 결과, 모든 유산균 균주 침전물에서 인지기능 개선 효과를 확인 할 수 있었으며 락토바실러스 애시도필러스 ATCC 4356 (38.0±10.1), 비피도박테리움 락티스 DSM 10140(36.1±10.9) 주정침전물의 개선효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 치매 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 인지기능 장애 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 두뇌 또는 인지기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
치매는 학습 및 인지 결함을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환으로, 통상적으로는 행동적 증상, 정신적 증상 및 운동성 증상을 수반한다. 치매는 치매관련 질환인 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 혈관성 치매 (Vascular dementia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease), 루이체 치매(Lewy body dementia), 무도병 (Huntington's disease), 크루츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jacob disease), 픽스씨 병 (Pick's disease)에 의하여 발생하거나, 상기 질환을 수반할 수 있다. 따라서 본 발명의 치매는 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)형 치매, 혈관성 치매 (Vascular dementia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease)형 치매, 루이체 치매(Lewy body dementia), 무도병 (Huntington's disease)형 치매, 크루츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jacob disease)형 치매, 픽스씨 병 (Pick's disease)형 치매일 수 있다.
치매의 예방 및 치료, 개선은 치매의 증상을 예방 및 치료, 개선하는 것으로 치매의 증상에는 다음과 같은 증상들이 포함된다:
a) 수면 장애, 섬망(동요 포함), 공격 및 진전과 같은 행동적 증상,
b) 환각, 망상, 불안 및 우울과 같은 심리적 증상,
c) 온전한 운동 기능에도 불구하고 운동 활동을 수행하는 손상된 능력을 의미하는 운동성 증상 및
d) 학습력 및 인지력 손상, 예를 들어, 새로운 정보를 학습하거나 이전에 학습된 정보를 상기하는 손상된 능력(예를 들어, 손상된 사회적 기억), 실어증, 실행증, 실인증, 실행성 기능에서의 장애 등.
인지적 결함 또는 인지기능장애에는 인지 기능 또는 인지적 영역, 예컨대 작업 기억, 주의력 및 경계(vigilance), 언어 학습 및 기억, 시각 학습 및 기억, 추론 (reasoning) 및 문제해결 예컨대 실행 기능, 처리속도 또는 사회 인지의 저하가 포함된다. 특히, 인지적 결함 또는 인지기능 장애는 주의력 결핍, 와해된 사고, 느린 사고, 이해 곤란, 집중력 불량, 문제해결 장애, 기억 불량, 생각을 표현함에 있어서의 곤란 및/또는 생각, 감정 및 행동을 통합함에 있어서의 곤란, 또는 무관한 생각들의 소멸의 곤란을 가리킬 수 있다. "인지적 결함" 및 "인지기능 장애"라는 용어들은 동일한 것을 가리키는 것으로 의도된 것으로서, 상호교환가능하게 사용된다.
인지기능 장애로 분류되는 질환은 이에 한정되지 아니하나 정신분열증과 연관된 인지 결함, 연령-유도성 기억 손상 또는 정신이상과 연관된 인지 결함, 당뇨병과 연관된 인지 결함, 후-졸중과 연관된 인지 결함, 저산소증과 연관된 기억 결함, 노인성 치매와 연관된 인지 및 주의 결함, 경증 인지 손상과 연관된 기억력 문제, 치매와 연관된 손상된 인지 기능, 알츠하이머병과 연관된 손상된 인지 기능, 파킨슨병과 연관된 손상된 인지 기능, 맥관 치매와 연관된 손상된 인지 기능, 뇌 종양과 연관된 인지 문제, 픽스씨 병(Pick's disease), 자폐증으로 인한 인지 결함, 전기경련 요법 후 인지 결함, 외상성 뇌 손상과 연관된 인지 결함, 기억상실 장애 및 정신착란일 수 있다.
본 발명의 유산균 발효물은 식품 조성물(또는 식품) 또는 약학적 조성물(또는 의약품)으로 제공될 수 있다.
상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 유산균 발효물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균 발효물을 기타의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 유산균 발효물을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 유산균 발효물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 유산균 발효물의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대해 약 0.01 내지 10중량%를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 유산균 발효물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유산균 발효물 0.001 내지 99.999 중량% 및 담체 99.999 내지 0.001 중량%의 조성을 가질 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 치매, 치매관련 질환, 인지기능 장애를 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 유산균 발효물의 약학적으로 유효한 양으로는 0.01 내지 100 mg/day/kg 체중이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함 하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5%
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 유산균 발효물을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 유산균 발효물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 유산균 발효물의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대해 약 0.01 내지 10중량%를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 유산균 발효물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유산균 발효물 0.001 내지 99.999 중량% 및 담체 99.999 내지 0.001 중량%의 조성을 가질 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 치매, 치매관련 질환, 인지기능 장애를 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 유산균 발효물의 약학적으로 유효한 양으로는 0.01 내지 100 mg/day/kg 체중이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
한편, 본 발명에서 사용된 실험은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌 등에 기재되어 있다: Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001.
따라서, 본 발명은 밀크 포함 배지에서 유산균을 배양, 발효시켜 얻은 유산균 발효물, 이의 제조방법 및 용도를 제공한다. 상기 발효물은 Aβ40의 생성을 유도하는 아밀로이드 생성과정의 β-세크리타제 활성을 억제함으로써 APPβ의 생성을 선택적으로 저해하는 활성성분이 포함되어 있어 치매, 치매관련 질환 예방 및 치료 또는 인지기능 개선이나 인지기능 장애의 예방 및 치료의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
유산균 발효물 제조 및 β-세크리타제(β-Secretase) 활성억제 유산균주 선별
<1-1> 유산균 발효물의 제조
실험에 사용된 18종의 인체 유래 유산균주는 한국미생물보존센터 등의 기탁 기관으로부터 분양받았고, 이들 균주로 배양한 발효 산물을 APPβ억제 활성이 있는지 조사하였다. 사용한 유산균주는 다음과 같다: 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) ATCC 4356, 락토바실러스 카세이 (L. casei) ATCC 393, 락토바실러스 람노서스 (L. rhamnosus) ATCC 7469, 락토바실러스 가세리 (L. gasseri) ATCC 33323, 락토바실러스 헬베티쿠스 (L. helveticus) ATCC 15009, 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum) ATCC 14931, 락토바실러스 파라카세이 (L. paracasei) ATCC 25302, 락토바실러스 플랜타럼 (L. plantarum) ATCC 14917, 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) ATCC 23272, 비피도박테리움 애니말리스 (Bifidobacterium animalis) ATCC 25527, 비피도박테리움 락티스 (B. lactis) DSM 10140, 엔테로코커스 패컬리스 (Enterococcus faecalis) ATCC19433, 엔테로코커스 패시움 (E. faecium) ATCC 19434, 락토바실러스 브레비 (L. breve) ATCC 15701, 비피도박테리움 롱검 (B. longum) ATCC 15707, 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) ATCC29521, 락토바실러스 살리바리우스 (L. salivarius) ATCC 11742, 락토바실러스 불가리쿠스 (L. bulgaricus) ATCC 11842.
유산균은 MRS 배지(de Man-Rogosa-Sharpe media)에 계대 배양 또는 전 배양한 것을 사용하였다. 본 발명의 유산균 발효물을 제조하기 위하여 각각의 유산균이 포함된 전배양액을 탈지분유를 주성분으로 하는 SG(10% 탈지분유, 0.5% glucose, pH 6.8) 배지 또는 우유에 3%(v/v)로 접종하여 37℃에서 24시간 정치 배양하는 방법으로 배양액을 얻었다. SG 배지나 우유에서 배양한 것 모두 유산균 발효유처럼 커드 형성이 있었고 유청과 분리되는 현상을 보였다. 대조군으로 MRS 배지에 3%(v/v)로 접종한 배지를 동일조건으로 배양한 것을 사용하였다.
각 배양액을 15,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하고 이를 먼저 0.22㎛ 주사기용 필터(syringe filter)로 여과하였다. 다음에 분자량 5,000이하를 여과시키는 필터 막(filter membrane)으로 한외여과 (ultrafiltration) 하였다. 이어서 주정을 한외여과액 부피 대비 먼저 1배를 가하여 섞어준 후 다시 15,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 침전물과 상등액을 분리하였다. 이러한 침전물을 1배 침전물이라고 하였으며, 남은 상층액에 다시 한외여과액의 1배 부피를 첨가하고, 동일한 방법으로 원심분리한 후 침전물과 상등액을 분리하였다. 이러한 침전물을 2배 침전물이라고 하였으며, 동일한 방법으로 4배 침전물도 확보하였다. 각 침전물을 회수 및 건조하여 중량 측정 후 0.5% TFA (trifluoroacetic acid)에 농도별로 현탁하여 시험에 사용하였다. 인지기능 개선 시험에서는 위의 방법처럼 주정 침전물을 각각 회수하지 않고 한외 여과액 부피 대비 4배의 주정을 바로 첨가하여 1:2 및 1:4 주정 침전물이 함께 함유하는 주정침전물을 확보하여 시험에 사용하였다.
<1-2> β-세크리타제 활성 억제 유산균 선별
실시예 <1-1>에서 수득한 각각의 유산균주 발효물의 주정 침전물을 이용하여 β-세크레타제 활성 억제 효능을 가지는 유산균주를 다음과 같이 선별하였다. 대조 군으로는 유산균을 접종하지 아니한 SG 배지 배양액만을 동일 방법으로 주정 침전한 침전물을 사용하였다.
본 발명의 각각의 유산균 발효 산물 시료가 아밀로이드 전구단백질(amyloid precursor protein; 이하 APP라 함)의 대사에 미치는 영향을 조사하기 위해 β-세크리타제와 야생형 APP695 유전자를 주입하여 이들이 과발현되는 HEK293 세포주(이하, BA-3; Yeon et al, Peptides, 2007, 28:838-844)를 사용하였다. BA-3는 β-세크리타제의 과발현으로 APPβ를 많이 생성하여 β-세크리타제 활성에 직간접적으로 영향을 미치는 유효성분의 탐색에 유용하다.
10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 BA-3를 80% 이상의 밀도(confluency)로 6-웰 플레이트(6-well plate)에 분주하여 1일 동안 배양하였다. 배지를 제거한 다음 37℃로 가온한 FBS가 없는 DMEM(free DMEM) 0.9ml을 넣은 후 0.1ml free DMEM에 현탁한 주정 침전물 시료를 100μg/ml 농도로 처리하여 24시간 배양하였다.
각 시료가 처리된 배지 0.2ml을 회수하여 8% SDS-PAGE에 전기영동한 후 APPβ의 항체인 Rb53(polyclonal, Cephalon, USA) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 배양액 내의 APPβ를 측정하였다.
그 결과, 도 1 및 표 1에서 보듯이, 18종의 유산균 배양액 주정침전물 1:2를 BA-3 세포주에 처리 시 엔테로코커스 패시움 ATCC 19434, 락토바실러스 브레비 ATCC 15701, 비피도박테리움 롱검 ATCC 15707, 비피도박테리움 비피덤 ATCC29521 주정 침전물들은 APPβ의 생성을 저해하지 않거나 약한 저해 효과를 보였으나 이외의 14종의 유산균주 주정침전물에서는 최소 45.2% (엔테로코커스 패컬리스 ATCC19433)에서 최고 85.4% (비피도박테리움 락티스 DSM 10140)까지 APPβ의 생성을 저해하였다. 1:4 주정 침전물 처리 시에는 엔테로코커스 패시움 ATCC 19434와 락토바실러스 불가리쿠스 ATCC 11842의 주정 침전물이 비교적 약한 저해율을 보인 반면 나머지 16종의 균주 주정침전물은 우수한 억제효과를 보였다. 1:4 주정 침전물 처리 시 가장 우수한 억제효과를 보인 것은 락토바실러스 애시도필러스 ATCC 4356 주정침전물로 93.3%의 억제율을 보였으며 대부분의 유산균주 주정 침전물에서 60% 이상의 억제율을 보였다.
sAPPβ 억제효과가 밀크 배지에 각 유산균을 배양하여 수득한 주정 침전물에서 선택적으로 나타나는 것인지를 확인하기 위해 유산균 배양배지인 MRS 배지에 각 유산균을 배양하여 얻은 배양여액을 동일한 방법으로 한외여과 후 주정을 한외여과액 부피 대비 4배를 가하여 침전물을 얻어 BA-3 세포주에 100㎍/ml로 처리하였다. 18종 유산균의 MRS 배양액 주정침전물 모두 전혀 sAPPβ를 억제하지 않아 밀크 배지 주정침전물의 sAPPβ 억제는 선택적으로 나타나는 것을 확인 하였다.
이상의 결과들을 종합하면 시험한 18종의 주정침전물은 수득 방법 및 균주에 따라 차이는 있었지만 모두 APPβ의 생성을 강력히 억제하였으며 알츠하이머 치매의 원인 단백질인 베타아밀로이드 생성을 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
유산균 주정 침전물의 in vitro β-secretase 활성 저해 및 sAPPβ 억제 효과
균주 각 주정 침전물의 sAPPβ억제율 (%)
SG 배지 MRS 배지
1:2 1:4 1:4
L. acidophilus ATCC 4356 74.0 93.3 0.0
L. casei ATCC 393 72.4 87.6 0.0
L. rhamnosus ATCC 7469 83.1 73.0 0.0
L. gasseri ATCC 33323 74.1 86.3 0.0
L. helveticus ATCC 15009 73.6 64.0 0.0
L. fermentum ATCC 14931 39.9 42.4 0.0
L. paracasei ATCC 25302 72.1 83.0 0.0
L. plantarum ATCC 14917 45.6 63.3 0.0
L. reuteri ATCC 23272 68.3 60.2 0.0
B. animalis ATCC 25527 68.5 76.9 0.0
B. lactis DSM 10140 85.4 80.8 0.0
E. faecalis ATCC19433 45.2 67.6 0.0
E. faecium ATCC 19434 8.5 19.0 0.0
L. breve ATCC 15701 0.0 71.6 0.0
B. longum ATCC 15707 0.0 80.2 0.0
B. bifidum ATCC29521 0.0 32.8 0.0
L. salivarius ATCC 11742 72.7 65.4 0.0
L. bulgaricus ATCC 11842 61.7 14.5 0.0
<실시예 2>
본 발명의 발효산물의 In vivo 효과 확인
각 유산균 주정 침전물들이 치매의 원인 단백질인 Aβ의 생성을 억제하는지 확인하기 위해 200~250g의 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트에 1% 카르복시메틸셀룰로스(carboxymethylcellulose)에 현탁한 1:4 주정침전물들을 250mg/kg로 경구 투여 후 4시간 뒤 혈액을 채취하여 원심분리 후 혈장을 분리하여 혈장 내 Aβ40의 변화를 ELISA kit (the GENETICS Company, Switzerland)를 사용하여 정량 비교하였다.
이 방법은 Moudden 등 (Current Pharmaceutical Design, 2006, 12:671-676)과 Best 등 (JPET, 2005, 313:902-908)의 방법에 따라 수행하였다. 일반적으로 치매 치료제의 효능 평가는 치매 동물 모델 쥐를 사용하여 결과를 분석하는데 동물 모델이 고가이고 평가 기간도 매우 길며 또한 비 유전적인 치매에 대한 평가를 할 수 있는 지에 대한 문제점들로 이를 개선하여 짧은 시간 내 많은 약물들의 치매 개선 효과를 확인할 수 있는 동물 모델 시험의 필요성이 제기되었고 이러한 방법들 중 하나로 약물 투여 후 랫트 혈액 내에 Aβ의 감소를 확인하는 측정법이 개발되었다. 기존 치매 동물 모델 쥐에서 Aβ를 감소시키는 약물들이 이 방법에 의해서도 Aβ를 감소시켜 치매치료 약물의 탐색에 유용한 방법이다.
SG 배지 주정침전물 1:4를 경구 투여하고 4시간 뒤 혈장 내 Aβ40의 농도와 각 유산균 주정 침전물 1:4를 경구 투여 후 Aβ40의 농도를 측정하여 각 유산균 주정 침전물의 Aβ40 억제율을 구하였다. 시험한 18종의 유산균주 모두 Aβ40을 10% 이상 억제하였고 락토바실러스 애시도필러스 (L. acidophilus) ATCC 4356이 45.0±7.1%로 가장 높은 억제율을 보였으며 비피도박테리움 락티스 (B. lactis) DSM 10140가 38.3±6.9%로 뒤를 이었다.
유산균 주정 침전물의 in vivo Aβ40 억제 효과
균주 1:4 주정 침전물의 Aβ0 억제율 (%)
L. acidophilus ATCC 4356 45.0±7.1
L. casei ATCC 393 18.3±3.8
L. rhamnosus ATCC 7469 21.5±4.5
L. gasseri ATCC 33323 23.2±3.5
L. helveticus ATCC 15009 14.6±2.8
L. fermentum ATCC 14931 17.7±3.2
L. paracasei ATCC 25302 15.5±2.9
L. plantarum ATCC 14917 15.9±5.3
L. reuteri ATCC 23272 18.5±5.7
B. animalis ATCC 25527 14.1±3.9
B. lactis DSM 10140 38.3±6.9
E. faecalis ATCC19433 19.8±2.3
E. faecium ATCC 19434 16.0±4.9
L. breve ATCC 15701 21.8±2.7
B. longum ATCC 15707 17.0±3.2
B. bifidum ATCC29521 24.4±5.1
L. salivarius ATCC 11742 11.7±1.1
L. bulgaricus ATCC 11842 19.5±3.5
<실시예 3>
유산균 발효물의 인지 기능 개선 효능 시험
인지기능 개선 시험을 위해 9주령 우성 ICR 생쥐를 각 처리군당 5마리씩 사용하였다. 각 타입스트레인 유산균 발효물 주정 침전물은 1% 카르복시메틸셀룰로스에 현탁하여 투여 시료를 조제하여 사용하였다. 각 균주의 주정 침전물을 500mg/kg용량으로 주 7회 2주간 경구로 반복 투여하였고 시험 시작 60분전에 스코폴아민(scopolamine)을 1m/kg로 경구 투여하여 기억 손상을 유발 한 후 수중 미로(water maze)시험을 실시하였다. 비히클로는 약물 대신 생리식염수를 2주간 투여 후 스코폴아민을 처리한 군을 사용하였다.
수중미로시험 중 참조기억(reference memory) 시험은 시험 시작 하루 전에 플랫폼이 없는 수조에서 60초 동한 자유롭게 수영하게 하여 적응한 후 실시하였다. 시험은 5일 동안 매일 4~5회 물에 잠겨 있는 플랫폼을 찾아 올라갈 때까지의 시간 (escape latency, 단위: 초)을 측정하는 방법으로 수행하였고 최대 허용 시간은 60초로 제한하였다. 시험 2일 차 까지는 플랫폼의 위치를 찾지 못하면 제한 시간인 60초 이내에 플랫폼을 찾도록 인도하였으며 플랫폼에 올라가면 10초간 머무르게 하였다.
참조기억 시험이 종료되고 24시간 후 수조 내 플랫폼을 치우고 60초 동안 자유롭게 수영하게 하여 플랫폼이 있던 위치에 머무르는 시간을 측정하는 방법으로 탐침 검사(probe test)를 수행하였다.
각 유산균주 배양여액을 한외 여과 후 얻은 1:4 주정 침전물을 투여 후 5일 동안 참조기억 시험을 진행하고 5일차에서 스코폴아민 투여군의 플랫폼을 찾는 시간의 평균값과 각 유산균 침전물의 플랫폼을 찾는 시간과 비교하여 스코폴아민 투여군 대비 플랫폼을 찾는 시간을 개선율로 나타내었다.
참조기억 개선율 = (ts - t유산균)/ts× 100(%)
(ts:스코폴아민 투여군의 플랫폼을 찾는 평균시간; t유산균:유산균 주정침전물의 플랫폼을 찾는 평균시간)
분석 결과 모든 균주 침전물에서 인지기능 개선 효과를 확인 할 수 있었으며 락토바실러스 애시도필러스 ATCC 4356 (38.0±10.1), 비피도박테리움 락티스 DSM 10140(36.1±10.9) 주정침전물의 개선효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.
참조기억 시험 종료 후 실시한 탐침검사에서는 스코폴아민 투여군에서 플랫폼이 있던 자리에 머문 평균 시간을 각 유산균 주정침전물 투여군이 머문 평균 시간과 비교하여 개선율로 나타내었다.
탐침검사 개선율 = (t유산균 - ts)/ts× 100(%)
(ts:스코폴아민 투여군이 플랫폼이 있던 자리에 머문 평균시간; t유산균:유산균 주정침전물 투여군이 플랫폼이 있던 자리에 머문 평균시간)
탐침 검사에서도 락토바실러스 애시도필러스 ATCC 4356, 비피도박테리움 락티스 DSM 10140 주정침전물 투여군이 플랫폼이 있던 자리에 머문 시간이 가장 길었으며 개선율은 각각 138.3±9.9%, 85.2±11.1이었으며 이외에 락토바실러스 비피덤 ATCC29521(76.3±9.2), 락토바실러스 불가리쿠스 ATCC 11842(56.3±7.0), 락토바실러스 람노서스 ATCC 7469(53.1±3.0) 등도 우수한 개선율을 보였다.
유산균 주정 침전물의 인지기능 개선 효과
균주 참조기억 5일차 개선율(scopolamine 투여군 대비 개선율, %) 탐침 검사
(scopolamine 투여군 대비 개선율, %)
L. acidophilus ATCC 4356 38.0±10.1 138.3±9.9
L. casei ATCC 393 17.3±4.8 13.5±2.7
L. rhamnosus ATCC 7469 27.5±6.8 53.1±3.0
L. gasseri ATCC 33323 27.2±7.5 45.0±2.5
L. helveticus ATCC 15009 24.8±3.8 35.1±1.9
L. fermentum ATCC 14931 18.4±4.3 29.8±5.5
L. paracasei ATCC 25302 13.5±4.9 27.6±6.4
L. plantarum ATCC 14917 16.4±8.3 18.0±2.5
L. reuteri ATCC 23272 16.9±3.7 18.7±4.7
B. animalis ATCC 25527 15.4±3.4 16.6±4.1
B. lactis DSM 10140 36.1±10.9 85.2±11.1
E. faecalis ATCC19433 23.7±5.1 32.8±6.0
E. faecium ATCC 19434 13.5±5.3 12.0±5.3
L. breve ATCC 15701 13.9±8.8 17.4±6.9
B. longum ATCC 15707 17.8±5.1 39.0±1.3
B. bifidum ATCC29521 25.5±4.1 76.3±9.2
L. salivarius ATCC 11742 16.3±6.5 17.5±3.0
L. bulgaricus ATCC 11842 21.0±6.7 56.3±7.0
이하에서 본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
<제제예 1> 산제의 제조
본 발명의 유산균 발효물(분말화된 것) 20 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
<제제예 2> 정제의 제조
본 발명의 유산균 발효물(분말화된 것) 10 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
<제제예 3> 캅셀제의 제조
본 발명의 유산균 발효물(분말화된 것) 10 ㎎
결정성 셀룰로오스 3 ㎎
락토오스 14.8 ㎎
마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
<제제예 4> 주사제의 제조
본 발명의 유산균 발효물(분말화된 것) 1 ㎎
만니톨 180 ㎎
주사용 멸균 증류수 2793 ㎎
Na2HPO4·12H2O 26 ㎎
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
<제제예 5> 액제의 제조
본 발명의 유산균 발효물(분말화된 것) 2 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
<제제예 6> 건강 식품의 제조
본 발명의 유산균 발효물(분말화된 것) 500㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<제제예 7> 건강 음료의 제조
본 발명의 유산균 발효물(분말화된 것) 100㎎
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 밀크 포함 배지에서 유산균을 배양, 발효시켜 얻은 유산균 발효물, 이의 제조방법 및 용도를 제공한다. 상기 발효물은 Aβ40의 생성을 유도하는 아밀로이드 생성과정의 β-세크리타제 활성을 억제함으로써 APPβ의 생성을 선택적으로 저해하는 활성성분이 포함되어 있어 치매, 치매관련 질환 예방 및 치료 또는 인지기능 개선이나 인지기능 장애의 예방 및 치료의 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 웨스턴 블롯으로 각 타입스트레인 유산균주를 SG 배지에서 배양하여 얻은 배양여액을 한외 여과 후 얻은 주정 침전물의 β-세크레타제 억제효과를 확인한 결과이다(Media: 침전물 투여 없이 배양배지만을 사용하여 BA-3세포주를 배양한 발효물에서의 APPβ의 밴드; 각 균주 발효물: 배양배지에 각 타입스트레인 유산균 발효물의 주정 침전물을 100μg/ml 농도로 투여하여 BA-3세포주를 배양한 발효물에서의 APPβ의 밴드). 가는 1:2 주정침전물을 처리 시 결과이고 나는 1:4 주정 침전물을 처리 시 결과이다.
도 2는 웨스턴 블롯으로 각 타입스트레인 유산균주를 MRS 배지에서 배양하여 얻은 배양여액을 한외 여과 후 얻은 1:4 주정 침전물의 β-세크레타제 억제효과를 확인한 결과이다(Media: 침전물 투여 없이 배양배지만을 사용하여 BA-3세포주를 배양한 발효물에서의 APPβ의 밴드; 각 균주 발효물: 배양배지에 각 타입스트레인 유산균 발효물의 주정 침전물을 100μg/ml 농도로 투여하여 BA-3세포주를 배양한 발효물에서의 APPβ의 밴드).
도 3는 스코폴아민 유도 기억 손상 모델 생쥐의 수중 미로 시험에서 각 타입스트레인 유산균주 발효물의 기억개선 효과를 알아보기 위하여 플랫폼을 찾는 시간을 비교 측정한 결과 그래프이다(탈출시간(Escape latency time)(s): 플랫폼을 찾아가는데 걸린 시간(초); 스코폴아민: 약물 대신 생리 식염수 2주간 투여 후 스코폴아민 처리군; 스코폴아민 + L. breve ATCC10751: 락토바실러스 브레비 ATCC10751 배양액 주정침전물을 500mg/kg로 2주간 경구 투여 후 스코폴아민 처리군; 스코폴아 민 + B. lactis DSM10140: 비피도박테리움 락티스 DSM10140 배양액 주정침전물을 500mg/kg로 2주간 경구 투여 후 스코폴아민 처리군; 스코폴아민 + L. acidophillus ATCC4356: 락토바실러스 애시도필러스 ATCC4356 배양액 주정침전물을 500mg/kg로 2주간 경구 투여 후 스코폴아민 처리군; 스코폴아민 + L. plantarum ATCC14917: 락토바실러스 플랜타럼 ATCC14917 배양액 주정침전물을 500mg/kg로 2주간 경구 투여 후 스코폴아민 처리군).

Claims (8)

  1. (a) 밀크 포함 배지에 락토바실러스 속 유산균, 엔테로코커스 속 유산균 및 비피도박테리움 속 유산균으로 이루어진 군에서 선택된 유산균을 접종, 배양하여 발효시키는 단계;
    (b) 상기 발효물에서 유산균을 제거하는 단계; 및
    (c) 유산균이 제거된 발효물을 아세톤, 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 활성성분을 침전, 분리하는 단계를 포함하는 치매 예방 및 치료 효과를 가지는 유산균 발효물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제조 방법은
    (a) 밀크 포함 배지에 락토바실러스 속 유산균, 엔테로코커스 속 유산균 및 비피도박테리움 속 유산균으로 이루어진 군에서 선택된 유산균을 접종, 배양하여 발효시키는 단계;
    (b) 상기 발효물에서 원심분리하여 유산균을 제거하는 단계;
    (c) 유산균이 제거된 발효물에서 분자량 5,000이하의 물질을 수득하는 단계; 및
    (d) 상기 수득된 물질에 아세톤, 탄소수 1 내지 6의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 활성성분을 침전, 분리하는 단계를 포함하는 치매 예방 및 치료 효과를 가지는 유산균 발효물의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이 (L. casei), 락토바실러스 람노서스 (L. rhamnosus), 락토바실러스 가세리 (L. gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스 (L. helveticus), 락토바실러스 퍼멘텀 (L. fermentum), 락토바실러스 파라카세이 (L. paracasei), 락토바실러스 플랜타럼 (L. plantarum), 락토바실러스 루테리 (L. reuteri), 비피도박테리움 애니말리스 (Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 락티스 (B. lactis), 엔테로코커스 패컬리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움 (E. faecium), 락토바실러스 브레비 (L. breve), 비피도박테리움 롱검 (B. longum), 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum), 락토바실러스 살리바리우스 (L. salivarius) 및 락토바실러스 불가리쿠스 (L. bulgaricus)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 치매는 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)형 치매, 혈관성 치매 (Vascular dementia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease)형 치매, 루이체 치매(Lewy body dementia), 무도병 (Huntington's disease)형 치매, 크루츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jacob disease)형 치매 및 픽스씨 병 (Pick's disease)형 치매로 이루어진 군에서 선택된 치매인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항의 방법에 의해 제조된 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 및 치료용 조성물.
  8. 제1항의 방법에 의해 제조된 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 두뇌 또는 인지기능 증진용 식품 조성물.
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