CN115300532B - 具改善阿尔兹海默病认知能力的益生菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具改善阿尔兹海默病认知能力的益生菌剂及其制备方法，该益生菌剂由发酵乳杆菌ZLT 11冻干菌粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干菌粉、聚葡萄糖和菊粉按照质量比1：1：1：1：50：50组成。本发明提供的益生菌剂可以通过抑制大脑中Aβ蛋白沉积和tau蛋白磷酸化，减缓大脑炎症反应、氧化应激水平，调节肠道菌群结构来对APP/PS1小鼠的症状起到改善作用。

Description

具改善阿尔兹海默病认知能力的益生菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体地，本发明涉及人源益生菌及其协同菊粉和聚葡萄糖在预防和/或辅助治疗阿尔兹海默病中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是痴呆症最常见的原因，有研究表明AD的约占痴呆病例60-80％。其中大约10％的年龄大于65岁的人被认为患有AD；在年龄大于85岁的人中，这一数字上升到32％。据估计，目前有620万65岁及以上的美国人患有阿尔茨海默氏痴呆症，到2060年这一数字可能增长到1380万。官方死亡证明在2019年记录了121,499例死于AD，使AD成为美国第六大死因，也是65岁及以上美国人的第五大死因。在2000年至2019年期间，中风、心脏病和艾滋病毒的死亡人数减少，而报告的AD死亡人数增加了145％以上。2020年，无偿痴呆症护理的价值为2567亿美元。2021年，为65岁及以上痴呆症患者提供的医疗保健、长期护理和临终关怀服务的总支付额估计为3550亿美元，花费逐年上涨。随着人口老龄化的加剧，寻找预防、减缓或治疗AD的有效方法是十分必要的。
AD患者表现为记忆和认知功能的逐渐丧失，涉及语言、视觉空间和执行领域。AD的病理标志是大脑中β-淀粉样蛋白沉积形成的老年斑，以及tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结，导致突触功能障碍和丧失，最终导致神经元死亡。IL-6是AD脑早期淀粉样斑块形成的组成部分，且可以通过增加细胞周期依赖性激酶5的神经内浓度，诱导tau蛋白的过度磷酸化。有大量证据表明，AD患者的脑组织在疾病过程中暴露于氧化应激。丙二醛(MDA)是由不饱和脂肪酸的脂质过氧化形成的，是细胞膜氧化降解的标志。抗氧化防御系统的一个重要因素是还原型谷胱甘肽(GSH)，它负责细胞内的内源性氧化还原电位。
目前还没有能够有效延缓和阻止AD发生发展的药物，因此，寻找一种能够缓解阿尔茨海默病症状、延缓阿尔茨海默病发病进程且安全有效的治疗药物成为亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种具改善阿尔兹海默病认知能力的益生菌剂，该益生菌剂用于预防和/或辅助治疗阿尔兹海默病，为预防和/或辅助治疗阿尔兹海默病提供一种新方法和新手段。
本发明的另一目的在于提供上述益生菌剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种具改善阿尔兹海默病认知能力的益生菌剂，由发酵乳杆菌ZLT 11冻干菌粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干菌粉、聚葡萄糖和菊粉按照质量比1：1：1：1：50：50组成。
其中，发酵乳杆菌ZLT 11的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ZLT 11；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18206；保藏日期为：2019年7月11日；
发酵乳杆菌ZLT 305的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ZLT305；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18207；保藏日期为：2019年7月11日；
植物乳杆菌ZLT 22的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT22；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18208；保藏日期为：2019年7月11日；
植物乳杆菌ZLT 25的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT25；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18209；保藏日期为：2019年7月11日。
本发明还提供一种具改善阿尔兹海默病认知能力的益生菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)挑取保存于斜面上的发酵乳杆菌ZLT 11，发酵乳杆菌ZLT 305、植物乳杆菌ZLT22、植物乳杆菌ZLT 25菌株，分别在MRS固体培养基上划线分离后于37℃培养48-72h得到活化好的发酵乳杆菌ZLT 11单菌落，发酵乳杆菌ZLT305单菌落、植物乳杆菌ZLT 22单菌落、植物乳杆菌ZLT 25单菌落；
2)将活化好的发酵乳杆菌ZLT 11单菌落，发酵乳杆菌ZLT 305单菌落、植物乳杆菌ZLT 22单菌落、植物乳杆菌ZLT 25单菌落分别接种于50mL MRS肉汤培养基中，于37℃静置培养培养20h，得到发酵乳杆菌ZLT 11种子液，发酵乳杆菌ZLT 305种子液、植物乳杆菌ZLT22种子液、植物乳杆菌ZLT 25种子液；
3)将发酵乳杆菌ZLT 11种子液，发酵乳杆菌ZLT 305种子液、植物乳杆菌ZLT 22种子液、植物乳杆菌ZLT 25种子液分别按照10％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养培养18h，分别得到发酵乳杆菌ZLT 11菌液，发酵乳杆菌ZLT 305菌液、植物乳杆菌ZLT22菌液、植物乳杆菌ZLT 25菌液；
4)将发酵乳杆菌ZLT 11菌液，发酵乳杆菌ZLT 305菌液、植物乳杆菌ZLT22菌液、植物乳杆菌ZLT 25菌液分别离心分离收集湿菌体，再分别洗涤后放入冷冻干燥器内冻干收集，得到发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉；
5)将发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干粉、菊粉和聚葡萄糖按比例混合即可。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种具改善阿尔兹海默病认知能力的益生菌剂及其制备方法，该益生菌剂可以通过抑制大脑中Aβ蛋白沉积和tau蛋白磷酸化，减缓大脑炎症反应、氧化应激水平，调节肠道菌群结构来对APP/PS1小鼠的症状起到改善作用，可以用于预防和/或辅助治疗阿尔兹海默病。
附图说明
图1为各组小鼠在水迷宫实验中的行为轨迹图。
图2为各组小鼠大脑海马组织的切片图。
图3为各组小鼠大脑海马组织的免疫组化切片图。
图4为采用不同组小鼠的肠道菌群在门水平上的分布图，其中，NC：对照组；MC：APP/PS1模型组；L：乳酸杆菌组；LI：乳酸杆菌+菊粉组；LP：乳酸杆菌+聚葡萄糖组；LIP：乳酸菌+菊粉和聚葡萄糖组。横坐标为组别，纵坐标relative abundance为相对丰度。
图5为采用不同组小鼠的肠道菌群在属水平上的分布图，其中，NC：对照组；MC：APP/PS1模型组；L：乳酸杆菌组；LI：乳酸菌+菊粉组；LP：乳酸菌+聚葡萄糖组；LIP：乳酸菌+菊粉和聚葡萄糖组。横坐标为组别，纵坐标relative abundance为相对丰度。
具体实施方式
下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
由于肠道微生物与肠道和大脑(微生物群-肠-脑轴)相互作用。肠道微生物会产生氨基酸(即-氨基丁酸(GABA)和色氨酸)和单胺(即血清素、组胺和多巴胺)，它们作为神经递质或神经递质前体在大脑中发挥重要作用，这些神经活性产物可以通过血流靶向中枢神经系统，也可以影响中枢神经系统中的神经元。
益生菌已被证明可以恢复肠道微生物群的内环境稳定，延缓AD的进展，从而改善认知能力下降。最常用的益生菌有乳酸杆菌和双歧杆菌，由于它们不含脂多糖，因此摄入后不会引起任何形式的炎症。越来越多的动物研究支持这种观点，即某些益生菌可以对抗肠道失衡，并可能对AD的发病机制产生积极影响。
菊粉与低聚果糖结构相似，菊粉水解后能够产生低聚果糖。聚葡萄糖是一种由90％不可消化和不可吸收的可溶性纤维构成的多糖，具有与膳食纤维一致的若干生理作用，包括肠道微生物菌群的增殖。已有文献表明菊粉和聚葡萄糖可以有效地恢复系统代谢，增强肠道微生物平衡，减少神经炎症。
益生菌、菊粉和聚葡萄糖均可以用作食品，没有副作用。本发明提供一种人源乳酸杆菌菌剂，该菌剂包括人源乳酸杆菌、聚葡萄糖和菊粉，并将该菌剂用于预防和/或辅助治疗阿尔兹海默病，为预防和/或辅助治疗阿尔兹海默病提供一种新方法和新手段。
材料：
1.MRS肉汤培养基(液体)和MRS琼脂培养基(固体)购买自北京陆桥技术股份有限公司。
使用前MRS肉汤培养基按照说明书配制成液体培养基并进行灭菌备用。
使用前MRS琼脂培养基按照说明书制备成MRS固体平板并进行灭菌备用。
2.无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇购买自国药集团化学试剂有限公司。
3.二甲苯购买自上海凌峰化学试剂有限公司。
4.柠檬酸(pH6.0)抗原修复液购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G1201-1L。
5.柠檬酸(PH6.0)抗原修复液购买自BioWhittaker
6. 4％多聚甲醛购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G1101-500ML。
7.EDTA脱钙液购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G1105-500ML。
8.RNA提取液购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G3013-100ML。
9. 2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G3322-15。
10.HyPure TMMolecular Biology Grade Water购买自HyClone。
11.SweScript RT I First Strand cDNA Synthesis Kit购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G3330-100。
12.引物委托武汉赛维尔生物科技有限公司合成。
13.P-tau抗体购买自江苏亲科生物研究中心有限公司，产品编号：AF3141。
14.Aβ抗体购买自武汉塞维尔生物科技有限公司，产品编号：GB111197。
15.磷酸化蛋白酶抑制剂购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G2007-1ML。
16.BCA蛋白定量检测试剂盒购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G2026-1000T。
17.SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G2003-50T。
18.蛋白Marker购买自美国赛默飞世尔科技公司，产品编号：26617。
19.PVDF膜(0.45um)和PVDF膜(0.22um)均购自millipore。
20.脱脂奶粉购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：GC310001-100g。
21.显影定影试剂盒购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G2019-250ML。
22.β-actin购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：GB12001。
23.TBS缓冲液购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G0001-2L。
24.APP/PS1雄性小鼠(B6C3来源双转基因小鼠)，12周龄，购买自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
25.B6C3雄性小鼠(野生型)，12周龄，购买自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
26.菊粉购买自柳州宏旭生物科技有限公司。
27.聚葡萄糖购买自人良生物科技(安徽)有限公司。
设备：
1.酶标检测仪(Rayto)购买自雷杜生命科学股份有限公司。
2.电子天平购买自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
3.冷冻离心机(heal force)购买自力康生物医疗科技控股有限公司。
4.电子天平购买自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
5.掌上离心机购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
6.涡旋混合器购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
7.磁力搅拌器购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
8.脱色摇床购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
9.电泳仪购买自北京六一仪器厂。
10.扫描仪(EPSON)购买自爱普生(中国)有限公司。
11.灰度分析软件购买自美国Alpha Innotech。
12.图像分析软件购买自Adobe。
13.台式高速冷冻型微量离心机购买自DragonLa。
14.匀浆仪购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
15.超微量分光光度计购买自美国赛默飞世尔科技公司。
16.脱水机购买自DIAPATH。
17.包埋机购买自武汉俊杰电子有限公司。
18.病理切片机购买自上海徕卡仪器有限公司。
实施例1益生菌剂的制备
本发明所使用乳酸杆菌为发酵乳杆菌ZLT 11冻干菌粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干菌粉，上述乳酸杆菌均由健康成人体内分离所得并进行保藏。
发酵乳杆菌ZLT 11的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ZLT11；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18206；保藏日期为：2019年7月11日。
发酵乳杆菌ZLT 305的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ZLT305；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18207；保藏日期为：2019年7月11日。
植物乳杆菌ZLT 22的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT22；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18208；保藏日期为：2019年7月11日。
植物乳杆菌ZLT 25的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT25；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18209；保藏日期为：2019年7月11日。
上述乳酸杆菌单一菌株的逐级培养方法为：
菌种活化：挑取保存于斜面上的发酵乳杆菌ZLT 11，发酵乳杆菌ZLT 305、植物乳杆菌ZLT 22、植物乳杆菌ZLT 25菌株，分别在MRS固体培养基上划线分离后于37℃培养48-72h得到活化好的发酵乳杆菌ZLT 11单菌落，发酵乳杆菌ZLT 305单菌落、植物乳杆菌ZLT22单菌落、植物乳杆菌ZLT 25单菌落。
种子液制备：将活化好的发酵乳杆菌ZLT 11单菌落，发酵乳杆菌ZLT 305单菌落、植物乳杆菌ZLT 22单菌落、植物乳杆菌ZLT 25单菌落分别接种于50mL MRS肉汤培养基中，于37℃静置培养培养20h，得到发酵乳杆菌ZLT 11种子液，发酵乳杆菌ZLT 305种子液、植物乳杆菌ZLT 22种子液、植物乳杆菌ZLT 25种子液。
发酵液制备：将发酵乳杆菌ZLT 11种子液，发酵乳杆菌ZLT 305种子液、植物乳杆菌ZLT 22种子液、植物乳杆菌ZLT 25种子液分别按照10％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养培养18h，分别得到发酵乳杆菌ZLT 11菌液，发酵乳杆菌ZLT 305菌液、植物乳杆菌ZLT 22菌液、植物乳杆菌ZLT 25菌液。
冻干粉制备：将发酵乳杆菌ZLT 11菌液，发酵乳杆菌ZLT 305菌液、植物乳杆菌ZLT22菌液、植物乳杆菌ZLT 25菌液分别离心分离收集湿菌体，再分别洗涤后放入冷冻干燥器中冻干收集，得到发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉。
使用时将发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT22冻干粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干粉、菊粉和聚葡萄糖按比例混合即可。
实施例2：益生菌剂对AD模型小鼠体重和进食量的影响
为了检测的菌粉与菊粉、聚葡萄糖的菌剂效果，配置菌粉与菊粉、聚葡萄糖的不同组方如下：
菌剂①中发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉的质量比为1：1：1：1，每株菌活菌数为1.0-2.0×1011CFU/g。
菌剂中②发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT22冻干粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干粉、菊粉的质量比为1：1：1：1：50；每株菌活菌数为1.0-4.0×109CFU/g。
菌剂③中发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT22冻干粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干粉、聚葡萄糖的质量比为1：1：1：1：50；每株菌活菌数为1.0-4.0×109CFU/g。
菌剂④中发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT22冻干粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干粉、菊粉和聚葡萄糖的质量比为1：1：1：1：50：50，菌剂中每株菌活菌数为1.0-2.0×109CFU/g。
1.动物分组及干预
所有小鼠适应性饲养一周后，12只野生型B6C3小鼠作为空白对照组(NC)，72只APP/PS1小鼠分为模型组(MC)、聚葡萄糖组(P)、乳酸杆菌组(L)、乳酸杆菌+菊粉组(LI)，乳酸杆菌+聚葡萄糖组(LP)，乳酸杆菌+菊粉和聚葡萄糖组(LIP)，每组12只。实验进行12周。
7组分组所喂饲料详情如下：
空白对照组(NC)：普通小鼠维持饲料；
模型组(MC)：普通小鼠维持饲料；
聚葡萄糖组(P)：每克饲料中添加50mg聚葡萄糖；
乳酸杆菌组(L)：每克饲料中添加4mg菌剂①；
乳酸杆菌+菊粉组(LI)：每克饲料中添加54mg菌剂②；
乳酸杆菌+聚葡萄糖组(LP)：每克饲料中添加54mg菌剂③；
乳酸杆菌+菊粉和聚葡萄糖组(LIP)：每克饲料中添加104mg菌剂④。
2.小鼠体重变化
每周记录一次小鼠体重，结果如表1所示。
表1各组小鼠体重变化
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表1可以看出，NC组小鼠体重与MC组小鼠体重没有显著差异。在实验开始前各组APP/PS1小鼠体重无显著性差异，从第五周开始P组小鼠体重极显著高于MC组小鼠体重，L、LI、LP和LIP组小鼠体重与MC组小鼠体重没有显著差异。这表明各菌剂添加的L、LI、LP和LIP组对小鼠体重没有影响，各组小鼠正常生长。
3.小鼠进食量变化
每周第一天称量给小鼠添加的饲料重量并记录，最后一天称量剩余饲料并记录，计算一周的进食量。如表2所示为各组小鼠进食量情况。实验过程中各组小鼠进食量没有显著差异。
表2各组小鼠进食量变化
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表2可以看出，各组进食量没有显著差异。这表明各菌剂添加的组对小鼠食欲没有影响。
实施例3：益生菌剂对AD模型小鼠认知和记忆能力的作用
1.新物体识别
在实验前30min被带进试验室，让它们熟悉环境。第1d让小鼠在没有物体的情况下自由探索盒子5min。第2d，小鼠进行训练实验。期间，两个相同的物体被放置在箱子内两个相对的位置，距离最近的角落相同。这些老鼠被允许在相同的物体上探索5min，然后返回它们的笼子。第3d进行测试，小鼠被放到箱子里。此时两个熟悉的物体中的一个被换成一个新的，开始5min的测试阶段。在测试阶段中使用的两个物体在形状和颜色上都不同，但大小相同。它们被固定在箱子的地板上，以避免移动。为了排除嗅觉线索的存在，每次试验后，整个箱子和物体都用水彻底清洗。物体探测时间被定义为动物用鼻子在2cm范围内对物体进行探测，或用鼻子或爪子对物体进行探测的时间长度。在训练阶段，使用以下公式计算训练阶段的位置偏好和测试阶段的识别指数(recognition index,RI)。
RI＝TB÷(TB+TA)
式中：
TB：小鼠探测新物体的时间(S)
TA：小鼠探测熟悉物体的时间(S)
各组小鼠在新物体识别实验中的新物体识别指数见表3。
表3各组小鼠新物体识别指数
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表3可以看出，MC组与NC组相比，新物体识别指数极显著降低。P、L、LI、LP和LIP组分别与MC组相比新物体识别指数均极显著上升，LIP组与P组相比新物体识别指数显著上升，与L组相比有所改善，但并不显著。可见，4种菌剂均可以有效改善小鼠的新物体识别记忆能力，其中菌剂④作用效果优于其他3种菌剂。
2.水迷宫实验
水迷宫由一个直径为2m的水箱组成，水箱分为四个象限，水温保持在22±2℃。实验分为定位航行实验阶段和空间探索实验阶段。
定位航行实验进行5d，平台被放置在水面下1cm处，并在水池四周画上不同标记，便于小鼠找到平台。期间，平台被放置在相同位置，老鼠从对角线的另一侧被释放到池中，它们的头部朝向池的一侧。小鼠试验最长持续时间为1min，若超过1min小鼠仍没有找到平台，则引导其找到平台位置，并在平台上放置15s。然后用纸巾擦干，然后返回它们的笼子。
在第6d移除平台，将小鼠从平台位置对角线对面的一侧放入水箱中，并允许小鼠自由游泳1min。使用ethvision XT v.4软件确定逃逸潜伏期，记录小鼠运动轨迹，结果如表4所示。其中，逃逸潜伏期的长短代表小鼠空间记忆能力的好坏，潜伏期短，预示着动物的学习记忆能力好。在空间探索实验阶段撤去平台后，在实验时间内，小鼠穿越原平台位置的次数越多，说明小鼠的空间记忆能力越好。运动轨迹中小鼠在中间区域即靠近平台的区域活动的时间比在边缘区域活动的时间长的话，表示其空间记忆功能好。
表4各组小鼠定位航行实验期间逃避潜伏期
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
由表4可知，从定位航行实验的第4d开始，MC组的逃逸潜伏期与NC组相比明显增加。在定位航行实验的第5d，与MC组相比，P、L、LI、LP和LIP组的逃逸潜伏期均显著缩短，而LIP组的逃逸潜伏期极显著缩短。且LI、LIP组与P组或L组相比，逃避潜伏期有所缩短。可见，4种菌剂对小鼠的空间记忆功能均具有改善作用，其中菌剂④较其他3种菌剂效果更好。
为了测试空间记忆的巩固性，在移开平台后进行了试验。空间探索实验结果如表5和表6所示。
表5各组小鼠空间探索实验期间逃避潜伏期
表6各组小鼠空间探索实验期间穿越平台次数
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表5和表6可以看出，与NC组相比，MC组的逃逸潜伏期显著上升，穿越平台的频率显著下降。P、L、LI、LP和LIP组分别与MC组相比，逃逸潜伏期均明显缩短，穿越平台的频率均显著上升，而LIP组穿越平台的频率极显著上升。且LI、LP、LIP组与P组或L组相比逃避潜伏期和穿越平台的频率均有所改善。
各组小鼠空间探索实验期间小鼠运动轨迹如图1所示。P、L、LI、LP和LIP组小鼠均能找到目标所在位置(第二象限)，而MC组小鼠主要沿着外壁活动。综上可知，4种益生菌剂对小鼠的空间记忆功能均有一定的改善作用，其中菌剂④较其他3种菌剂效果更好。
实施例4：益生菌剂对AD模型小鼠大脑生化指标的作用
1.小鼠组织HE染色(苏木精—伊红染色法)(本节中出现的Ⅰ、Ⅱ、III等表示第一份试剂、第二份试剂和第三份试剂，每份试剂相同)
取小鼠组织用4％多聚甲醛进行固定24h备用。
将组织放入包埋盒中置于梯度酒精中进行脱水。75％酒精2h，85％酒精2h，90％酒精1.5h，95％酒精2h，无水乙醇I2 h，无水乙醇II 2h。
脱水后进行透明处理。二甲苯I 40min，二甲苯II 40min。
浸蜡：65℃浸入石蜡I中0.5h，65℃浸入石蜡II中1h，65℃浸入石蜡II I2h。
包埋：先将融化的蜡放入包埋框中，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出于-20℃冷却，蜡凝固后取出并修整蜡块。
切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚5μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片捞起，放入60℃烘箱内烤片。将水烤干后取出常温保存备用。
脱蜡染色：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。对切片进行苏木素染液染3-5min，水洗，分化液分化，水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，放入伊红染液中染色5min。切片依次放入无水乙醇I 5min无水乙醇II 5min，无水乙醇III5min，二甲Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min，中性树胶封片。
大脑海马HE染色结果如图2所示，NC组小鼠神经细胞形态完整，排列紧密，没有明显的病理损伤；MC组小鼠有神经元细胞形态固缩，染色加深；与MC组相比，P、L、LI、LP、LIP组神经元排列较为整齐，固缩深染细胞减少。
2.小鼠大脑中Aβ蛋白沉积
取出小鼠大脑组织，将其放在4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片。二甲苯、无水乙醇浸泡，之后PBS冲洗。对切片进行高压修复。将切片放入预热后的修复液中，加热煮沸2.5min。流水冷却。3％H2O2封闭15min，PBS冲洗3次，每次2min。在切片上滴加一抗，4℃过夜；滴加二抗，37℃20min。每次孵育结束后都要用PBS冲洗3次。滴加DA，显微镜下观察染色情况。PBS冲洗3次。苏木素复染2min，流水冲洗。之后用75％乙醇配置的0.1％盐酸溶液分化。蒸馏水放置2min反蓝。常规梯度酒精脱水、干燥。二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜观察形态变化。
各组小鼠大脑Aβ蛋白表达免疫组化结果如图3所示。NC组小鼠大脑皮层未见Aβ沉积，AD模型组小鼠大脑皮层Aβ沉积现象明显，P、L、LI、LP、LIP组小鼠大脑皮层Aβ斑块数量与模型组相比明显减少。
3.Western blot检测大脑中P-tau蛋白表达
细胞总蛋白提取：取肝脏组织用磷酸缓冲液(PBS)将血污冲洗后，剪成小块置于匀浆管中。加入1～2个2mm的匀浆珠，加入10倍组织体积裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)置于均质匀浆机中匀浆。完成匀浆后，将匀浆管置于冰上30min。为了确保组织完全的裂解，期间每隔5min震荡一次，然后12000r离心10min收集上清。
蛋白浓度测定：用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
蛋白变性：将蛋白溶液按照4:1的比例加入5x(表示浓度)蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，于-20℃冰箱保存备用。
SDS-PAGE电泳：清洗晾干玻璃板，安装后检查是否漏胶。配制10％分离胶和5％浓缩胶。
10％分离胶配制方法：H2O 4mL、30％丙烯酰胺(29：1)3.3mL、1.5M TRIS-HCl(TRIS：三羟甲基氨基甲烷，HCl：盐酸)(pH 8.8)2.5mL、10％SDS(十二烷基硫酸钠)0.1mL、AP(过硫酸铵)0.1mL和，TEMED(四甲基乙二胺)5uL总体积10mL。
5％浓缩胶配制方法：H2O 4mL、30％丙烯酰胺(29：1)1mL、1M TRIS-HCl(pH 6.8)1mL、10％SDS 80μL、AP 60μL和TEMED 8uL，总体积6mL
加入分离胶至适当高度，加纯水静置30min至分离胶凝固，倒掉上层水并吸干。将浓缩胶填满空余空间，拔掉梳子，静置30min。
将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。直至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。
转模：准备7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。小心剥下分离胶放在滤纸上，将PVDF膜盖于胶上，不要有气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，300mA恒流转膜半小时。转膜过程中将转膜的槽子放在冰水中降温。
免疫反应：转好膜后室温下用5％的脱脂牛奶在脱色摇床上封闭1h。稀释一抗(TBST溶解的5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5％BS)，4℃孵育过夜。用TBST(缓冲液：Tris-HCl缓冲盐溶液和TWEEN 20(吐温20)配制而成)在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
曝光、凝胶图像分析：在暗室中将ECL(显影液)和ECL(显影液)两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层手套或者其他透明薄膜，将PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1-2min后，去尽残液，盖上上面的一层薄膜开始曝光。曝光后的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。大脑中P-tau蛋白的表达量如表7所示。
表7各组小鼠海马中磷酸化tau蛋白水平
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表7可以看出，P、L、LP组与MC组相比P-tau表达量均显著下降，LI和LIP组有所下降，且LP组与P组或L组相比P-tau表达水平也显著降低。可见，4种菌剂对小鼠大脑tau蛋白磷酸化均具有一定的抑制作用，其中菌剂③较其他3种菌剂效果更好。
4.小鼠大脑中炎症因子IL-6mRNA表达水平
取匀浆管加入1mL RNA提取液冰上预冷后加入100mg组织，在匀浆机上研磨至无可见块状组织。离心(12000rpm，10min)取上清。
上清中加入250μL三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min，离心(12000rpm，10min，4℃)。
弃掉液体，对管底白色RNA沉淀用1.5mL75％乙醇进行洗涤，离心(12000rpm，5min，4℃)。
吸干液体，离心管置于超净台上吹3min后加入15μL无RNA酶的水溶解RN，55℃孵育5min。
检测RNA浓度及纯度，稀释浓度过高的RN，使其最终浓度为100-500ng/μL。
将含有2μg RNA的溶液加入PCR管中，加入0.5μL Oligo(dT)18Primer和0.5μLRandom Hexamer primer，去离子水补至15μL于PCR仪上65℃保温5min后迅速置于冰上冷却。
依次加入4μL 5×Reaction Buffer，1μLRT Enzyme Mix，混匀。于PCR仪上42℃保温60min，结束后70℃保温5min灭活反转录酶。
取0.2mL PCR管配置反应体系2×qPCR Mix 7.5μL，2.5μM基因引物1.5μL，反转录产物2.0μL，ddH2O 4.0μL。
PCR扩增条件为预变性(95℃，10min)，变性(95℃，15s)，退火/延伸(60℃，60s)，溶解曲线(60℃-95℃，每15s温度提升0.3℃)。
结果处理使用△△CT法(Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。)
表达倍数＝2-(A-B)
A＝CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)
B＝CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)
大脑中促炎因子IL-6mRNA表达量如表8所示。
表8各组小鼠大脑中炎症因子IL-6mRNA的表达水平
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表8可以看出，P、LI、LP和LIP组与MC组相比IL-6的mRNA相对表达水平均显著下降。与P组相比，LI、LP和LIP组IL-6的mRNA相对表达水平均显著下降。与L组相比LI、LP和LIP组IL-6的mRNA相对表达水平有所下降，而LIP组下降幅度更大些。可见，4种菌剂均可有效降低小鼠大脑的炎症水平，其中菌剂④较其他3种菌剂效果更好一些。
5.小鼠大脑中氧化因子的变化
准确称取小鼠大脑组织，按重量(mg)：体积(μL)＝1:9的比例加入9倍体积的0.9％的生理盐水，冰水浴条件下，机械匀浆，制备成10％的匀浆液。3000r/min，离心10min，取上清液分别按照MDA试剂盒和GSH-PX试剂盒进行测定。
MDA含量计算公式：
GSH-PX活力计算：
规定为每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。
结果如表9和表10所示。
表9各组小鼠大脑中MDA含量的变化
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
表10各组小鼠大脑中GSH-PX酶活力的变化
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01；与LI组相比，aP<0.05，aaP<0.01。
从表9和表10可知，与MC组相比，L、LI、LP和LIP组MDA含量均显著下降，GSH-PX酶活力均显著上升；P组GSH-PX酶活力显著上升。与P组相比，LI、LP和LIP组MDA含量显著下降。与L组相比，LI、LP和LIP组MDA含量有所下降，而LIP组下降幅度最大。与LI组相比，LIP组GSH-PX酶活力显著上升。可见，4种菌剂均可有效降低小鼠大脑的氧化水平，其中菌剂④较其他3种菌剂效果更好。
实施例5：益生菌剂对AD模型小鼠肠道菌群结构的作用
无菌取小鼠宰杀前的粪便，将粪便样品送至上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina NovaSeq测序平台进行粪便微生物基因组DNA的提取和质量鉴定、16S rDNA测序及后续生物信息学分析，基本流程如下：
1)上机流程
从样本到数据获得的过程中，会经过DNA提取与检测、PCR扩增、PCR产物的纯化、文库制备及库检。
2)测序数据质量控制
对原始数据(Raw Data)进行拼接、过滤干扰数据(Dirty Data)，最终得到有效数据(Clean Data)。
3)OTU聚类和物种注释
为研究各样本的物种组成，对所有样本的Effective Tags，以97％的一致性(Identity)进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，之后进行物种注释。
如图4和表11所示为小鼠肠道菌群在门水平上的分布情况。
表11各组小鼠肠道微生物门水平的相对丰度
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从图4和表11可以看出，各组小鼠肠道中厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、脱硫菌门(Desulfobacterota)、髌骨菌门(Patescibacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)共占肠道菌群总量的97％以上。与MC组相比，P、LIP组Desulfobacterota显著降低；P、LI、LP、LIP组Patescibacteria的相对丰度显著降低。与P组相比，LP组Patescibacteria的相对丰度显著降低。与L组相比，LI、LP、LIP组Patescibacteria的相对丰度显著降低。
如图5和表12所示为小鼠肠道菌群在属水平上的分布情况。
表12各组小鼠肠道微生物属水平的相对丰度
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与P组相比，#P<0.05，##P<0.01；与L组相比，&P<0.05，&&P<0.01。与LI组相比，aP<0.05，aaP<0.01。与LP组相比，bP<0.05，bbP<0.01。
从图5和表12可以看出，与MC组相比，P、LI、LP、LIP组中Faecalibaculum、Alistipes、Blautia的相对丰度显著上升，Patescibacteria的相对丰度显著下降；P、LP、LIP组中Parabacteroides的相对丰度显著上升，Desulfovibrio的相对丰度显著下降；LI、LP、LIP组中Corynebacterium的相对丰度显著下降；L组Staphylococcus相对丰度显著上升。与P组相比，LP、LIP组中Blautia的相对丰度显著上升；LI组中Alistipes的相对丰度显著下降。与L组相比，LI、LP、LIP组中Faecalibaculum、Blautia的相对丰度均显著上升，Corynebacterium的相对丰度均显著下降；LIP组Desulfovibrio的相对丰度显著下降；LP组Parabacteroides的相对丰度显著上升。与LI组相比，LIP组Parabacteroides的相对丰度显著上升。与LP组相比，LIP组Staphylococcus的相对丰度显著上升。
Desulfobacterota衍生的脂多糖可产生炎症损伤，触发异常代谢平衡。三甲胺氮氧化物(TMAO)是一种代谢物，研究表明与神经变性和阿尔茨海默病呈正相关，而Patescibacteria与TMAO的水平相关。Faecalibaculum属于具有抗炎特性的丁酸盐生产细菌，且Faecalibaculum可以抑制Aβ斑块的发展。Alistipes、Blautia与大脑中的tau病理学呈负相关。Parabacteroides与AD中β-淀粉样蛋白的沉积呈负相关。Desulfovibrio可以降低肠道内皮的完整性，并通过降低短链脂肪酸(SCFAs)的水平来推动小胶质细胞的成熟，小胶质细胞是AD发展过程中的关键因素。Liu等研究表明5-十七烷基间苯二酚对Desulfovibrio的抑制作用将有利于治疗AD。Staphylococcus产生的芳香族氨基酸脱羧酶将L-3，4-二羟基苯丙氨酸转化为多巴胺，且多巴胺对于记忆力发挥着重要作用。Corynebacteriu可产生缬氨酸，有研究表明缬氨酸在粪便中的积累与认知能力下降有关。可见，乳酸杆菌以及乳酸杆菌联合聚葡萄糖和菊粉可以通过调节肠道菌群结构来改善AD症状，延缓AD的发展进程，抑制AD的进一步恶化。
从上述实验结果表明，与MC组相比，P、L、LI、LP和LIP组的摄食量均无明显变化，P组可显著提高小鼠体重；在行为学实验中，P、L、LI、LP、LIP组的新物体识别指数，逃避潜伏期和穿越平台次数都表现出了显著的改善效果，而LIP组的逃逸潜伏期极显著缩短，LIP组穿越平台的频率极显著上升。且LIP组的新物体识别指数显著高于P组。
HE染色结果显示，与MC组相比，P、L、LI、LP、LIP组大脑中神经细胞形态较为完整，固缩减少。免疫组化实验结果显示，与MC组相比，P、L、LI、LP、LIP组小鼠大脑中β-淀粉样蛋白沉积明显减少。
实时荧光定量PCR结果显示，与MC组相比，P、L、LI、LP、LIP组小鼠大脑中促炎因子IL-6的mRNA表达量均显著减少，且LI、LP、LIP组小鼠大脑中促炎因子IL-6的mRNA表达量与P组相比也均显著减少；与L组相比，LI、LP和LIP组IL-6的mRNA相对表达水平有所下降，且LIP组下降幅度更大些。
氧化因子中，与MC组相比，P、L、LI、LP、LIP组小鼠大脑中MDA含量以及GSH-PX酶活力也均显著改善；LI、LP、LIP组小鼠大脑中MDA含量显著低于P组，且LIP组下降幅度最大。与LI组相比，LIP组小鼠大脑中GSH-PX酶活力显著改善。
Western blot结果显示，P、L、LP组与MC组相比P-tau表达量均显著下降，LI和LIP组有所下降，且LP组与P组或L组相比P-tau表达水平也显著降低。
高通量测序结果表明，与MC组相比，P、LIP组脱硫菌门(Desulfobacterota)显著降低；P、LI、LP、LIP组髌骨菌门(Patescibacteria)的相对丰度显著降低。与P组相比，LP组髌骨菌门(Patescibacteria)的相对丰度显著降低。与L组相比，LI、LP、LIP组髌骨菌门(Patescibacteria)的相对丰度显著降低。此外与MC组相比，Faecalibaculum、Alistipes、Blautia、Patescibacteria、Desulfovibrio分别在P、LI、LP、LIP中有所改善，Staphylococcus在L组中显著上升。与P组相比，LP、LIP组中Blautia的相对丰度显著上升；LI组中Alistipes的相对丰度显著下降。与L组相比，LI、LP、LIP组中Faecalibaculum、Blautia的相对丰度均显著上升，Corynebacterium的相对丰度均显著下降；LIP组Desulfovibrio的相对丰度显著下降；LP组Parabacteroides的相对丰度显著上升。与LI组相比，LIP组Parabacteroides的相对丰度显著上升。与LP组相比，LIP组Staphylococcus的相对丰度显著上升。
因此，本发明中人源植物乳杆菌和发酵乳杆菌菌剂添加聚葡萄糖和菊粉后可以通过抑制大脑中Aβ蛋白沉积和tau蛋白磷酸化，减缓大脑炎症反应、氧化应激水平，调节肠道菌群结构来对APP/PS1小鼠的症状起到改善作用，且分别与单独饲喂聚葡萄糖或单独饲喂植物乳杆菌和发酵乳杆菌菌剂相比，改善效果均有所增强，在4种菌剂中改善效果最好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种具改善阿尔兹海默病认知能力的益生菌剂，其特征在于，由发酵乳杆菌ZLT 11冻干菌粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干菌粉、聚葡萄糖和菊粉按照质量比1：1：1：1：50：50组成；
发酵乳杆菌ZLT 11的分类命名为：发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）ZLT 11；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No. 18206；保藏日期为：2019年7月11日；
发酵乳杆菌ZLT 305的分类命名为：发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）ZLT 305；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No. 18207；保藏日期为：2019年7月11日；
植物乳杆菌ZLT 22的分类命名为：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZLT 22；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No. 18208；保藏日期为：2019年7月11日；
植物乳杆菌ZLT 25的分类命名为：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZLT 25；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No. 18209；保藏日期为：2019年7月11日。
2.如权利要求1所述的具改善阿尔兹海默病认知能力的益生菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）挑取保存于斜面上的发酵乳杆菌ZLT 11，发酵乳杆菌ZLT 305、植物乳杆菌ZLT 22、植物乳杆菌ZLT 25菌株，分别在MRS固体培养基上划线分离后于37℃培养48-72 h得到活化好的发酵乳杆菌ZLT 11单菌落，发酵乳杆菌ZLT 305单菌落、植物乳杆菌ZLT 22单菌落、植物乳杆菌ZLT 25单菌落；
2）将活化好的发酵乳杆菌ZLT 11单菌落，发酵乳杆菌ZLT 305单菌落、植物乳杆菌ZLT22单菌落、植物乳杆菌ZLT 25单菌落分别接种于50 mL MRS肉汤培养基中，于37℃静置培养培养20 h，得到发酵乳杆菌ZLT 11种子液，发酵乳杆菌ZLT 305种子液、植物乳杆菌ZLT 22种子液、植物乳杆菌ZLT 25种子液；
3）将发酵乳杆菌ZLT 11种子液，发酵乳杆菌ZLT 305种子液、植物乳杆菌ZLT 22种子液、植物乳杆菌ZLT 25种子液分别按照10%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养培养18 h，分别得到发酵乳杆菌ZLT 11菌液，发酵乳杆菌ZLT 305菌液、植物乳杆菌ZLT22菌液、植物乳杆菌ZLT 25菌液；
4）将发酵乳杆菌ZLT 11菌液，发酵乳杆菌ZLT 305菌液、植物乳杆菌ZLT 22菌液、植物乳杆菌ZLT 25菌液分别离心分离收集湿菌体，再分别洗涤后放入冷冻干燥器中冻干收集，得到发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉；
5）将发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干粉、菊粉和聚葡萄糖按比例混合即可。
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