CN116836889B - 一种缓解高尿酸的鼠李糖乳杆菌jl-1及其后生元和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种缓解高尿酸的鼠李糖乳杆菌JL‑1及其后生元和应用,属于微生物技术领域。本发明提供的鼠李糖乳杆菌JL‑1于2022年10月9日在广东省微生物菌种保藏中心保藏,微生物保藏编号为GDMCC NO:62852;保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼;微生物分类命名为鼠李糖乳杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus。本发明提供了一种安全有效的含有鼠李糖乳杆菌JL‑1的后生元组合物在缓解高尿酸方面的应用,可降低高嘌呤饮食诱导的高尿酸小鼠的血清尿酸、尿素氮以及肌酐含量,降低肝脏组织中黄嘌呤氧化酶含量,缓解肾脏损伤。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种缓解高尿酸的鼠李糖乳杆菌JL-1及其后生元和应用。
背景技术
随着人们生活方式与饮食结构的改变,高嘌呤饮食逐渐成为一种常见的饮食类型。长时间摄入高嘌呤食物会导致尿酸不能及时代谢排出,在血液中不断积累而形成尿酸盐晶体等,进而会阻塞血管、损伤脏器等,同时在关节处聚积的尿酸晶体还会引发痛风性关节炎等疾病,并可能会诱发高血压、高血脂、心脑血管及肾脏疾病等疾病。
人体内产生的尿酸主要由肾和肠道排出。作为人肠道中的重要组成部分,乳酸菌被一些研究证实可以分解食物中的核苷,降低核苷的含量,进而降低尿酸水平,对降低尿酸具有一定的缓解作用。已有研究表明干酪乳杆菌、加氏乳杆菌、短乳杆菌以及罗伊氏乳杆菌可以有效降低血清中的尿酸等指标含量起到缓解或治疗高尿酸血症的作用,但利用益生菌的相关研究仍然有待增加。后生元作为一个新兴领域,利用益生菌制备的后生元对人体的益生功能方面的相关研究目前还比较少,具有较大的研究前景。
现有技术中,专利文献CN114717147A提供了一种鼠李糖乳杆菌制备的缓解脂肪肝与肥胖的后生元,但是将鼠李糖乳杆菌制备成后生元用于制备高尿酸症仍待研究。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供一种缓解高尿酸的鼠李糖乳杆菌JL-1及其后生元和应用,可降低高嘌呤饮食诱导的高尿酸小鼠的血清尿酸、尿素氮以及肌酐含量,降低肝脏组织中黄嘌呤氧化酶含量,缓解肾脏损伤。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
第一方面,本发明提供一种鼠李糖乳杆菌,命名为JL-1,于2022年10月9日在广东省微生物菌种保藏中心保藏,微生物保藏编号为GDMCC NO:62852;保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼;微生物分类命名为鼠李糖乳杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus。
形态学特征:扫描电子显微镜结果显示所述鼠李糖乳杆菌均为杆状或短杆状、单个排列。在MRS培养基平板上的单菌落呈乳白色、圆形、边缘整齐、表面湿润、有皱褶、中间有突起,革兰氏染色阳性。
所述鼠李糖乳杆菌GDMCC NO:62852分离自健康婴幼儿粪便。
第二方面,本发明提供一种后生元,所述后生元由所述鼠李糖乳杆菌制备得到。
作为本发明优选的技术方案,所述后生元的制备包括如下步骤:取活化后的鼠李糖乳杆菌JL-1菌株以5 %的接种量接种于脱脂乳粉培养基,37 ℃扩大培养14 h后,以5 %的接种量进行4 L高密度发酵,得发酵液;随后采用旋蒸加热的方法使菌株灭活,得后生元发酵液;最后,经离心处理,收集下层菌泥,即得所述后生元。
作为本发明更优选的技术方案,发酵时间为10~14h。
作为本发明更优选的技术方案,离心处理转速为5000 r/min,时间为30min。
第三方面,本发明还提供一种组合物,所述组合物由权利要求上述任一项所述后生元和壳寡糖组成。
作为本发明优选的技术方案,所述后生元和壳寡糖的质量比为1:1,壳寡糖分子量≤3000 Da。
第四方面,本发明还提供一种上述鼠李糖乳杆菌或上述后生元或上述组合物在制备治疗高嘌呤饮食诱导的小鼠高尿酸症状药物中的应用。
第五方面,本发明还提供一种上述鼠李糖乳杆菌或上述后生元或上述组合物在制备缓解高尿酸药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供了一种安全有效的含有鼠李糖乳杆菌JL-1的后生元组合物在缓解高尿酸方面的应用,可降低高嘌呤饮食诱导的高尿酸小鼠的血清尿酸、尿素氮以及肌酐含量,降低肝脏组织中黄嘌呤氧化酶含量,缓解肾脏损伤。
附图说明
图1为鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对血清尿酸的影响。
图2为鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对血清尿酸的变化影响。
图3为鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对尿液尿酸的影响。
图4为鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对尿液尿酸的变化影响。
图5为鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对血清尿素氮的影响。
图6为鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对血清肌酐的影响。
图7为鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对肝脏组织中黄嘌呤氧化酶的影响。
图8为鼠李糖乳杆菌JL-1后生元对肾脏组织损伤的影响,其中,A是正常组肾脏组织HE染色结果,B是模型组肾脏组织HE染色结果,C是壳寡糖组肾脏组织HE染色结果,D是低剂量灭活菌泥组肾脏组织HE染色结果,E是中剂量灭活菌泥组肾脏组织HE染色结果,F是高剂量灭活菌泥组肾脏组织HE染色结果,G是复合组肾脏组织HE染色结果,H是芹菜籽提取物组肾脏组织HE染色结果。
图9为鼠李糖乳杆菌JL-1的扫描电镜图;其中,(a):5000倍MRS培养基;(b):15000倍MRS培养基。
图10为鼠李糖乳杆菌JL-1的形态学观察图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚,以下结合实施例,对本发明作进一步的详细说明。当然,此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明,并不用于限定本发明。
特别需要强调的是,如无特殊说明外,本发明中的化学物质均通过市场途径购买。其中,壳寡糖分子量≤3000 Da。
实施例1
一种后生元的制备方法,包括如下步骤:
取活化后的鼠李糖乳杆菌JL-1菌株以5 %的接种量接种于脱脂乳粉培养基,37 ℃扩大培养14 h后,以5 %的接种量进行4 L高密度发酵(5L的发酵容器中使用4L的发酵体积进行发酵,下同),分别发酵10 h得到含有107CFU/ml活菌数的发酵液;随后采用旋蒸加热(即采用旋转蒸发仪进行处理,仪器型号上海亚荣RE-52A,下同)的方法使菌株灭活,得后生元发酵液;最后,在5000 r/min的转速下离心30 min,收集下层菌泥,即得所述后生元。
实施例2
一种后生元的制备方法,包括如下步骤:
取活化后的鼠李糖乳杆菌JL-1菌株以5 %的接种量接种于脱脂乳粉培养基,37 ℃扩大培养14 h后,以5 %的接种量进行4 L高密度发酵,分别发酵12 h得到含有108CFU/ml活菌数的发酵液;随后采用旋蒸加热的方法使菌株灭活,得后生元发酵液;最后,在5000 r/min的转速下离心30 min,收集下层菌泥,即得所述后生元。
实施例3
一种后生元的制备方法,包括如下步骤:
取活化后的鼠李糖乳杆菌JL-1菌株以5 %的接种量接种于脱脂乳粉培养基,37 ℃扩大培养14 h后,以5 %的接种量进行4 L高密度发酵,分别发酵14 h得到含有109CFU/ml活菌数的发酵液;随后采用旋蒸加热的方法使菌株灭活,得后生元发酵液;最后,在5000 r/min的转速下离心30 min,收集下层菌泥,即得所述后生元。
实施例4
一种组合物,将实施例1制备得到的后生元与壳寡糖按照质量1:1的质量混合,即得。
应用例
利用以下实验验证本发明的实验效果:
一、材料与方法
1、实验材料
选用40只雄性 C57BL/6小鼠,鼠龄为7-8周,体重为25-30g,并以23±3℃和60±5%的相对湿度饲养,保持12小时光照/黑暗循环。试验期间,每周更换两次垫料,每天更换饲料以免脂肪氧化产生气味影响小鼠进食,所有小鼠每日定时灌胃,每天一次。
2、动物分组
将40只雄性C57BL/6小鼠随机分成8组(n=5只/组):正常组、模型组、壳寡糖组、低剂量灭活菌粉组、中剂量灭活菌粉组、高剂量灭活菌粉组、复合组、芹菜籽提取物组。小鼠购买后,采用基础饲料饲养适应环境一周,自由饮水。第二周时,正常组采用正常鼠粮喂养,其余组按照酵母10 g/kg·d,腺嘌呤100mg/kg·d剂量灌胃。从第三周开始,正常组外的小鼠随机分为7组(n=5只/组),分别按照200 mg/kg·d无菌PBS、200 mg/kg·d的壳寡糖、200mg/kg·d的107CFU/mL 活菌数的鼠李糖乳杆菌JL-1灭活菌泥(即后生元,下同)、200 mg/kg·d的108CFU/mL 活菌数的鼠李糖乳杆菌JL-1灭活菌泥、200 mg/kg·d的109CFU/mL 活菌数的鼠李糖乳杆菌JL-1灭活菌泥、100 mg/kg·d的壳寡糖与100 mg/kg·d 的107CFU/mL活菌数的JL-1菌泥制备的复合物(即由实施例1制备得到后生元与壳寡糖混合得到的组合物)、75 mg/kg·d芹菜籽提取物灌胃两周。每周检测小鼠的血清尿酸、尿素氮、肌酐与尿液中尿酸的含量。
3、样本制备
第四周结束后麻醉小鼠,取全血,断颈处死,固定小鼠四肢,对小鼠进行体表消毒后解剖小鼠。迅速取出肾脏并称重,称重后,放在一张白纸上,观察肾脏变化情况拍照记录,之后在液氮中迅速冷冻,转移到-80 ℃冰箱长期保存。
4、指标测定
按照尿酸、尿素氮与肌酐试剂盒要求,测定血清中尿酸、尿素氮、肌酐与尿液中尿酸的含量。
5、黄嘌呤氧化酶含量测定
按照小鼠黄嘌呤氧化酶试剂盒说明,测定肝脏组织中的黄嘌呤氧化酶含量。
6、HE染色
(1)取材:新鲜组织固定于4 %多聚甲醛24 h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整,将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
(2)脱水:将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75 %酒精4 h-85 %酒精2 h-90%酒精2 h-95%酒精1 h-无水乙醇I 30 min-无水乙醇II 30 min-苯甲醇5-10 min-二甲苯I 5-10 min-二甲苯II 5-10 min-蜡I 1 h-蜡II 1 h-蜡III 1 h。
(3)包埋:将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框,待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却,蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
(4)切片:将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片,片厚4 μm。 切片漂浮于摊片机40 ℃ 温水上将组织展平,用载玻片将组织捞起,并放进60 ℃ 烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
(5)石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-无水乙醇Ⅰ10 min-无水乙醇Ⅱ10 min-95 %酒精5 min-90 %酒精5 min-80 %酒精5 min-70 %酒精5 min-蒸馏水洗。
(6)苏木素染细胞核:切片入Harris苏木素染3-8 min,自来水洗,1 %的盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗,0.6 %氨水返蓝,流水冲洗。
(7)伊红染细胞质:切片入伊红染液中染色1-3 min。
(8)脱水封片:将切片依次放入95 %酒精I 5 min -95 %酒精II 5 min-无水乙醇Ⅰ5 min -无水乙醇Ⅱ5 min -二甲苯Ⅰ5 min -二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。
(9)显微镜镜检,图像采集分析。
7、数据处理及统计学分析
使用 GraphPad Prism 8.02 进行绘图分析。试验结果以平均值±标准差(Mean± SD)表示,P<0.05 代表差异显著。
二、实验结果
1、鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对血清尿酸的影响
结果如图1所示,可以看出,鼠李糖乳杆菌JL-1各组均可显著降低尿酸值(P<0.05),其中复合组的降低效果最好,且与壳寡糖组和菌泥组具有显著性差异(P<0.05),可以使尿酸值恢复至正常水平。
2、鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对血清尿酸变化的影响
图2中可以看出,在饲养过程中,鼠李糖乳杆菌JL-1各组尿酸值变化趋势较为相似。在14、21、28 d模型组小鼠的尿酸值分别300.11 μmol/L、378.48 μmol/L、336.30 μmol/L,14-28 d内多组的尿酸值均低于模型组,甚至均低于正常组,在第28 d时复合组尿酸值(240.43 μmol/L)最接近于正常组(226.20 μmol/L)和芹菜籽提取物组(228.15 μmol/L),说明其可以有效地降低尿酸含量。
3、鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对尿液尿酸的影响
鼠李糖乳杆菌JL-1对尿液尿酸的结果如图3所示,可以看出,各组均可降低小鼠尿液中的尿酸值,且降低效果较为明显。
4、鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对尿液尿酸变化的影响
结果如图4所示,在饲养过程中,各组均对降低尿酸值起到一定效果。在14-28 d内低剂量菌泥组、复合组与芹菜籽提取物组呈现出先下降后上升的趋势,在21d时明显高于正常组水平,28d时低剂量菌泥组(273.68 μmol/L)、复合组(257.89 μmol/L)与芹菜籽提取物组(273.68 μmol/L)下降至与正常水平(289.47 μmol/L)最为接近。
5、鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对血清尿素氮的影响
从图5中可以看出,JL-1各组均对尿素氮有一定的降低效果,其中复合组的降低效果呈现出极显著水平(P<0.01),且与其它各组的效果均具有显著性差异(P<0.05)。
6、鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对血清肌酐的影响
结果如图6所示,各组均可显著降低肌酐的含量(P<0.01),但三个菌泥组的降低程度较大,可能会造成肌肉无力等情况,相比之下壳寡糖组(38.45 μmol/L)与复合组(41.37 μmol/L)肌苷含量最接近正常组(41.75 μmol/L)水平,说明其效果可能最好。
7、鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对肝脏组织中黄嘌呤氧化酶的影响
影响结果如图7所示,JL-1各组的黄嘌呤氧化酶含量均有所降低,其中复合组的含量最接近正常组水平,说明其对黄嘌呤氧化酶的抑制效果最好。
8、鼠李糖乳杆菌JL-1后生元、组合物对肾脏组织损伤的影响
对肾脏组织的HE染色结果如图8所示,其中除模型组与低剂量菌泥组外的所有组肾组织结构均呈现正常形态,肾小球结构完整,肾小球囊腔未见扩张;肾小管上皮细胞排列规则;间质间隙未见扩张;组织内未见炎症、水肿、纤维化等病理改变,这可能说明鼠李糖乳杆菌JL-1后生元对高尿酸导致的肾脏组织损伤的保护效果较好。只有低剂量灭活菌泥组出现了异常损伤。相比于模型组,几乎各组均对肾脏组织损伤起到了一定的缓解,并可以有效阻止肾脏组织病变。
上述实验结果表明,壳寡糖与鼠李糖乳杆菌JL-1灭活菌泥制备的后生元及组合物可以通过降低血清中尿酸、尿素氮及肌酐的含量,抑制肝脏组织中黄嘌呤氧化酶的活性,并能有效阻止肾脏病变损伤,从而起到缓解高尿酸的作用。壳寡糖作为一种益生元,已被实验证实具有促进乳酸菌、双歧杆菌等有益菌增殖,降低胆固醇含量、降低血压、血糖及血脂水平、调节免疫,抑制癌细胞生长,促进肝脾抗体形成等功能,结合其它研究推测其可能还具有通过调节肠道微生态起到降低尿酸的功能,因此在与鼠李糖乳杆菌JL-1灭活菌泥制备的后生元复配时,可能会对尿酸代谢相关通路与肠道菌群等的组成产生更为广泛的影响,从而使复配组表现出比单一使用后生元组更好的降尿酸效果。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明精神和范围内,都可以做各种的改动与修饰,因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种鼠李糖乳杆菌,其特征在于,命名为JL-1,于2022年10月9日在广东省微生物菌种保藏中心保藏,微生物保藏编号为GDMCC NO:62852;保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼;微生物分类命名为鼠李糖乳杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus。
2.一种后生元,其特征在于,所述后生元由权利要求1所述鼠李糖乳杆菌制备得到。
3.根据权利要求2所述的一种后生元,其特征在于,所述后生元的制备包括如下步骤:取活化后的鼠李糖乳杆菌JL-1菌株以5 %的接种量接种于脱脂乳粉培养基,37 ℃扩大培养14 h后,以5 %的接种量进行4 L高密度发酵,得发酵液;随后采用旋蒸加热的方法使菌株灭活,得后生元发酵液;最后,经离心处理,收集下层菌泥,即得所述后生元。
4.根据权利要求3所述的一种后生元,其特征在于,发酵时间为10~14h。
5.根据权利要求3所述的一种后生元,其特征在于,离心处理转速为5000 r/min,时间为30min。
6.一种组合物,其特征在于,所述组合物由权利要求2~5任一项所述后生元和壳寡糖组成。
7.根据权利要求6所述的一种组合物,其特征在于,所述后生元和壳寡糖的质量比为1:1。
8.根据权利要求6所述的一种组合物,其特征在于,所述壳寡糖的分子量≤3000 Da。
9.一种权利要求1所述鼠李糖乳杆菌或权利要求5所述后生元或权利要求6~8任一项所述组合物在制备治疗高嘌呤饮食诱导的小鼠高尿酸症状药物中的应用。
10.一种权利要求1所述鼠李糖乳杆菌或权利要求5所述后生元或权利要求6~8任一项所述组合物在制备缓解高尿酸药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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