CN114703102B - 一种缓解便秘的两歧双歧杆菌及其应用 - Google Patents

一种缓解便秘的两歧双歧杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种缓解便秘的两歧双歧杆菌及其应用。所述缓解便秘的两歧双歧杆菌命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)BBi32菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16923，保藏日期为2018年12月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明提供的两歧双歧杆菌BBi32能进一步提高短链脂肪酸总体含量，从而降低肠道环境的pH值，具有明显的的修复结肠黏膜损伤的特性，达到缓解便秘的目的。

Description

一种缓解便秘的两歧双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种缓解便秘的两歧双歧杆菌及其应用。
背景技术
便秘是消化系统疾病的临床表现，是一组以排便次数、排便困难或排便不尽感、粪便干结、坚硬为主诉的症候群，便秘的患病率在25～30％之间，尤其是在儿童和老年人群中常见。便秘发生后大便保留在大肠中的时间会延长，粪便中的水分随后会被吸收，导致粪便干燥，从而抑制肠蠕动并引起肠道失衡和肠痛。习惯性便秘因用力增加腹压，屏气使劲排便，是诱发中老年男性高血脂、心脑血管疾病、动脉硬化、肿瘤等疾病及其并发症的罪魁祸首，从而导致老人心脑血管病变死亡率急剧增加，出现痔疮、肛裂等问题，令人痛苦不堪。便秘还会使小孩胃肠道菌群失衡，导致精力不集中、思维迟钝、营养不良、心情急躁、消瘦、免疫力下降、易感冒、生长迟缓，如不及时调理，可能造成不可逆的病变。因便秘发病率高、病因复杂，患者常有许多苦恼，长期便秘严重影响患者健康和生活质量。
目前，便秘的常用临床治疗方法是服泻药和促动力药，但是，长期服用抗便秘药物副作用大，可能会导致药物依赖性，停药后加重便秘。
膳食纤维是指能抗人体小肠消化吸收，而在人体结直肠能部分或全部发酵的可食用的植物性成分、碳水化合物及类似物质的总和，主要由纤维素、果胶类物质、半纤维素和木质素组成。包括不溶性膳食纤维和可溶性膳食纤维。膳食纤维进入人体后一般不被消化和吸收，能通过吸收水分，增加粪便含水量，保持肠道润滑，并可刺激肠壁、增加肠蠕动，还能通过发酵产生短链脂肪酸，改变肠道pH，改善有益菌群的繁殖环境，从而加快肠道蠕动，使粪便顺利排出。
而大量从饮食中补充膳食纤维需进食相当多的含膳食纤维的食物，可能增加患者的胃肠道负担，造成胃排空延迟，导致腹胀、上腹不适、嗳气、食欲降低、消化不良等症状；并且包括了大量的不溶性膳食纤维，而不溶性膳食纤维可增加大便容积，从而加重肠道负担，而且过量的不溶性膳食纤维会影响微量元素吸收。
越来越多的研究表明，两歧双歧杆菌通过增加肠蠕动以及软化粪便的稠度而缩短整常运输时间并增加排便频率，改善肠粘膜。大多数乳酸菌对外界环境耐受能力差，作为有效的益生菌菌株必须能够通过低pH值的胃液、且具有一定的胆盐的耐受性。而两歧双歧杆菌能在肠道定植后，代谢产生有机酸，能够降低肠腔内pH值，通过影响肠道菌群，调节肠道通透性和免疫学参数以及产生调节性或生物活性代谢产物，直接或间接作用于大肠和其他器官。
因此需要提供一种缓解便秘的两歧双歧杆菌及其应用具有很大的现实意义，微生态疗法恰是以一个崭新的手段解决了传统疗法存在的多种问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种缓解便秘的两歧双歧杆菌及其应用。本发明提供的两歧双歧杆菌BBi32能进一步提高短链脂肪酸总体含量，从而降低肠道环境的pH值，具有明显的的修复结肠黏膜损伤的特性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供缓解便秘的两歧双歧杆菌，所述缓解便秘的两歧双歧杆菌命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)BBi32菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16923，保藏日期为2018年12月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本发明中，所述两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum BBi32分离和以该菌株为发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用，能够加快小肠蠕动并具有部分通便效果，对洛哌丁胺诱导的便秘小鼠在摄入两歧双歧杆菌BBi32后，粪便指标具有显著的缓解作用，乙酸、丙酸、正丁酸和总短链脂肪酸水平均有明显提高，短链脂肪酸总体含量增加能够降低肠道环境的pH值，结肠组织染色切片结果显示两歧双歧杆菌BBi32具有修复结肠黏膜损伤的特性。
在本发明中，所述两歧双歧杆菌BBi32来源于酸萝卜样本(四川省成都金堂县石庙村2组村民家)，该菌株经测序分析。
在本发明中，所述两歧双歧杆菌BBi32的原始菌种在温度-80℃下以20％(重量)甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用。
第二方面，本发明提供一种工作发酵剂，所述工作发酵剂由第一方面所述的缓解便秘的两歧双歧杆菌的菌种培养得到。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述工作发酵剂的制备方法，所述工作发酵剂的制备方法包括如下步骤：
(a)将两歧双歧杆菌BBi32的菌种接种于原料乳中，灭菌后，培养至凝乳，再连续培养活化两代，得到母发酵剂；
(b)将步骤(a)得到的母发酵剂接种于灭菌原料乳中，培养至凝乳，得到所述工作发酵剂。
优选地，步骤(a)中，所述两歧双歧杆菌BBi32的菌种的接种量为5-15wt％，例如可以是5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％等。
优选地，步骤(a)中，所述灭菌的温度为100-120℃，例如可以是100℃、102℃、105℃、108℃、110℃、112℃、115℃、120℃等，时间为5-15min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，步骤(a)中，所述培养至凝乳的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，时间为14-16h，例如可以是14h、14.5h、15h、15.5h、16h等。
优选地，步骤(b)中，所述母发酵剂的接种量为1-3vol％，例如可以是1vol％、1.2vol％、1.4vol％、1.6vol％、1.8vol％、2vol％、2.2vol％、2.4vol％、2.6vol％、2.8vol％、3vol％等。
优选地，步骤(b)中，所述培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，时间为14-16h，例如可以是14h、14.5h、15h、15.5h、16h等。
优选地，步骤(b)中，所述凝乳中的活菌数为108～1010cfu/mL，例如可以是1×108cfu/mL、2×108cfu/mL、4×108cfu/mL、6×108cfu/mL、8×108cfu/mL、1×109cfu/mL、2×109cfu/mL、4×109cfu/mL、6×109cfu/mL、8×109cfu/mL、9×109cfu/mL、1×1010cfu/mL等。
在本发明中，所述工作发酵剂可以由以下制备方法制备得到：
(a)将5-15wt％的两歧双歧杆菌BBi32的菌种接种于原料乳中，100-120℃下灭菌5-15min后，再于35-40℃下培养14-16h至凝乳，再连续培养活化两代，得到母发酵剂；
(b)将1-3vol％的母发酵剂接种于灭菌原料乳中，再于35-40℃下培养14-16h至该凝乳中的活菌数为108～1010cfu/mL，得到所述工作发酵剂。
第四方面，本发明提供一种如第二方面所述工作发酵剂的制备方法，所述工作发酵剂的制备方法包括如下步骤：
(A)将两歧双歧杆菌BBi32的菌种接种于MRS液体培养基中，进行活化培养，连续活化两代，得到活化培养物；
(B)将步骤(A)得到的活化培养物接种于MRS液体培养基中，进行培养，离心收集，得到细胞沉淀；
(C)将步骤(B)得到的细胞沉淀用无菌原料乳制成悬浮液，得到所述工作发酵剂。
优选地，步骤(A)中，所述两歧双歧杆菌BBi32的菌种的接种量为1-10wt％，例如可以是1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％等。
优选地，步骤(A)中，所述活化培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，时间为12-16h，例如可以是12h、14h、14.5h、15h、15.5h、16h等。
优选地，步骤(B)中，所述活化培养物的接种量为2-4vol％，例如可以是2vol％、2.2vol％、2.4vol％、2.6vol％、2.8vol％、3vol％、3.2vol％、3.4vol％、3.6vol％、3.8vol％、4vol％等。
优选地，步骤(B)中，所述培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，时间为16-18h，例如可以是16h、16.5h、17h、17.5h、18h等。
优选地，步骤(B)中，所述离心收集的参数为：温度为3-5℃，例如可以是3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃等，转速为3000-5000r/min，例如可以是3000r/min、3500r/min、4000r/min、4500r/min、5000r/min等，时间为10-20min，例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min等。
优选地，步骤(C)中，所述细胞沉淀和无菌原料乳的质量比为1:(5-20)，例如可以是1:5、1:5、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20等。
优选地，步骤(C)中，所述工作发酵剂中的活菌数为108-1011cfu/mL，例如可以是108cfu/mL、109cfu/mL、1010cfu/mL、1011cfu/mL等。
在本发明中，所述工作发酵剂可以由以下制备方法制备得到：
(A)将1-10wt％的两歧双歧杆菌BBi32的菌种接种于MRS液体培养基中，35-40℃下活化培养12-16h，连续活化两代，得到活化培养物；
(B)将2-4vol％的活化培养物接种于MRS液体培养基中，35-40℃下培养16-18h，3-5℃、3000-5000r/min离心10-20min，去除上清液，收集，得到细胞沉淀；
(C)将步骤(B)得到的细胞沉淀用无菌原料乳制成悬浮液，所述细胞沉淀和无菌原料乳的质量比为1:(5-10)，得到所述工作发酵剂，所述工作发酵剂中的活菌数为108-1011cfu/mL。
第五方面，本发明提供一种复合工作发酵剂，所述复合工作发酵剂包括上述工作发酵剂(由两歧双歧杆菌BBi32培养得到的工作发酵剂)、嗜热链球菌ST36发酵剂和保加利亚乳杆菌LB42发酵剂。
在本发明中，将第五方面所述的复合工作发酵剂添加到食品中后，两歧双歧杆菌BBi32与可共生的嗜热链球菌ST36和保加利亚乳杆菌LB42协同发酵一起使用制备发酵乳，能够进一步提高食品(原料乳)的发酵速度，且两歧双歧杆菌BBi32、嗜热链球菌ST36和保加利亚乳杆菌LB42相互配合，具有协同增效的作用，能够进一步提高短链脂肪酸总体含量，从而更加有效地降低肠道环境的pH值，修复结肠黏膜损伤。
优选地，所述工作发酵剂、嗜热链球菌ST36发酵剂和保加利亚乳杆菌LB42发酵剂的质量比为(5-20):(1-10):(1-5)；
其中，“5-20”例如可以是5、6、8、10、12、14、16、18、20等；
其中，“1-10”例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等；
其中，“1-5”例如可以是1、2、3、4、5等。
第六方面，本发明提供一种第一方面所述的缓解便秘的两歧双歧杆菌、第二方面所述工作发酵剂或第五方面所述工作发酵剂在制备用于降低肠道环境的pH值的产品中的应用。
第七方面，本发明提供一种第一方面所述的缓解便秘的两歧双歧杆菌、第二方面所述工作发酵剂或第五方面所述工作发酵剂在制备缓解便秘的产品中的应用。
第八方面，本发明提供一种食品，所述食品的制备原料包括原料乳和发酵剂；其中，所述发酵剂为第二方面所述工作发酵剂和/或第五方面所述复合工作发酵剂。
优选地，所述食品包括乳酸菌奶饮料、乳粉、胶囊制品或发酵乳中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述原料乳包括脱脂奶、鲜奶或复原奶的原料乳中的任意一种或至少两种的组合。
以下示例性地提高四种食品的制备方法：
(I)乳酸菌奶饮料
将原料乳进行高温杀菌后冷却至低温，再与上述复合工作发酵剂混合，冷藏保存，得到所述乳酸菌奶饮料。
优选地，所述高温杀菌为在90-100℃(例如可以是90℃、92℃、94℃、96℃、98℃、100℃等)下加热杀菌10-20min(例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min等)，或在135-145℃(例如可以是135℃、136℃、138℃、140℃、142℃、145℃等)下高温杀菌1-3s(例如可以是1s、1.5s、2s、2.5s、3s等)。
优选地，所述冷却至低温0-10℃，例如可以是0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃等。
优选地，所述复合工作发酵剂的总活菌数为106cfu/mL以上，例如可以是1×106cfu/mL、2×106cfu/mL、4×106cfu/mL、6×106cfu/mL、8×106cfu/mL、1×107cfu/mL、1×108cfu/mL等。
优选地，所述冷藏保存的温度为0-10℃，例如可以是0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃等。
(II)乳粉
将原料乳进行高温杀菌后冷却，再接种上述复合工作发酵剂后，进行发酵，得到复合发酵乳；将复合发酵乳与灭菌后的原料乳混合，进行均质；最后真空浓缩、喷雾干燥，得到所述乳粉。
优选地，所述高温杀菌为在90-100℃(例如可以是90℃、92℃、94℃、96℃、98℃、100℃等)下加热杀菌10-20min(例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min等)，或在135-145℃(例如可以是135℃、136℃、138℃、140℃、142℃、145℃等)下高温杀菌1-3s(例如可以是1s、1.5s、2s、2.5s、3s等)。
优选地，所述冷却至灭菌后的原料乳的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
优选地，所述复合工作发酵剂的接种量为1-6vol％，例如可以是1vol％、1.2vol％、1.4vol％、1.6vol％、1.8vol％、2vol％、2.2vol％、2.4vol％、2.6vol％、2.8vol％、3vol％％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％等。
优选地，所述发酵的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，时间为14-18h，例如可以是14h、15h、16h、17h、18h等。
优选地，所述复合发酵乳与灭菌后的原料乳的体积比为1:(2-4)，例如可以是1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4等。
优选地，所述均质的转速为4500-6500r/min，例如可以是4500r/min、5000r/min、5500r/min、6000r/min、6500r/min等，时间为5-15min，例如可以是5min、6min、8min、10min、12min、15min等。
优选地，所述真空浓缩的压力为5-20MPa，例如可以是5MPa、6MPa、8MPa、10MPa、12MPa、14MPa、16MPa、18MPa、20MPa等，温度为-45～25℃，例如可以是-45℃、-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃等。
优选地，所述喷雾干燥的压力为0-0.3MPa，例如可以是0MPa、0.1MPa、0.2MPa、0.3MPa等，进口温度为40-220℃，例如可以是40℃、60℃、80℃、100℃、120℃、140℃、180℃、200℃、220℃等，出口温度为0-60℃，例如可以是0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃等。
(III)胶囊制品
将原料乳进行高温杀菌后冷却，再接种上述复合工作发酵剂后，进行发酵，得到复合发酵乳；将复合发酵乳与灭菌后的原料乳混合，进行均质；最后真空浓缩、喷雾干燥处理后得到乳粉，使用全自动胶囊机得到所述胶囊制品。
优选地，所述高温杀菌为在135-145℃(例如可以是135℃、136℃、138℃、140℃、142℃、145℃等)下高温杀菌1-3s(例如可以是1s、1.5s、2s、2.5s、3s等)。
优选地，所述冷却至灭菌后的原料乳的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
优选地，所述复合工作发酵剂的接种量为1-6vol％，例如可以是1vol％、1.2vol％、1.4vol％、1.6vol％、1.8vol％、2vol％、2.2vol％、2.4vol％、2.6vol％、2.8vol％、3vol％％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％等。
优选地，所述发酵的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，时间为14-18h，例如可以是14h、15h、16h、17h、18h等。
优选地，所述复合发酵乳与灭菌后的原料乳的体积比为1:(2-4)，例如可以是1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4等。
优选地，所述均质的转速为4500-6500r/min，例如可以是4500r/min、5000r/min、5500r/min、6000r/min、6500r/min等，时间为5-15min，例如可以是5min、6min、8min、10min、12min、15min等。
优选地，所述真空浓缩的压力为5-20MPa，例如可以是5MPa、6MPa、8MPa、10MPa、12MPa、14MPa、16MPa、18MPa、20MPa等，温度为-45～25℃，例如可以是-45℃、-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃等。
优选地，所述喷雾干燥的压力为0-0.3MPa，例如可以是0MPa、0.1MPa、0.2MPa、0.3MPa等，进口温度为40-220℃，例如可以是40℃、60℃、80℃、100℃、120℃、140℃、180℃、200℃、220℃等，出口温度为0-60℃，例如可以是0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃等。
优选地，所述全自动胶囊机为瑞安市富锐思进出口有限公司的NJP-800全自动硬胶囊填充机。
(IV)发酵乳
将原料乳进行高温杀菌后冷却，再与上述复合工作发酵剂混合后，进行发酵，冷却至低温，得到所述发酵乳。
优选地，所述高温杀菌为在90-100℃(例如可以是90℃、92℃、94℃、96℃、98℃、100℃等)下加热杀菌10-20min(例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min等)，或在135-145℃(例如可以是135℃、136℃、138℃、140℃、142℃、145℃等)下高温杀菌1-3s(例如可以是1s、1.5s、2s、2.5s、3s等)。
优选地，所述复合工作发酵剂的添加量为1-6vol％，例如可以是1vol％、1.2vol％、1.4vol％、1.6vol％、1.8vol％、2vol％、2.2vol％、2.4vol％、2.6vol％、2.8vol％、3vol％％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％等。
优选地，所述发酵的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
优选地，所述发酵的终点为：发酵液至滴定酸度为(以乳酸计)0.4-0.6％，例如可以是0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％等。
优选地，所述冷却至低温0-10℃，例如可以是0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃等。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明为一种分离自四川省成都金堂县石庙村2组村民家酸萝卜中的两歧双歧杆菌BBi32和以该菌株为发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用，能够加快小肠蠕动并具有部分通便效果，对洛哌丁胺诱导的便秘小鼠在摄入两歧双歧杆菌BBi32后，粪便指标具有显著的缓解作用，乙酸、丙酸、正丁酸和总短链脂肪酸水平均有明显提高，短链脂肪酸总体含量增加能够降低肠道环境的pH值，结肠组织染色切片结果显示两歧双歧杆菌BBi32具有修复结肠黏膜损伤的特性；
(2)本发明所述两歧双歧杆菌BBi32的菌株耐酸性较强，在pH 3.0的人工胃液下3h后存活率达到了86.10±5.32％；在1.0％浓度胆盐下可以缓慢生长，生长效率达到无胆盐培养的19.23±0.62％；两歧双歧杆菌BBi32细胞的疏水性达到了72.43±0.58％。
附图说明
图1为两歧双歧杆菌BBi32菌落形态图；该两歧双歧杆菌BBi32命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)BBi32菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16923，保藏日期为2018年12月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
图2为两歧双歧杆菌BBi32连续活化2代后进行涂片革兰氏染色镜检图。
图3为实验期内各小组小鼠体重变化图。
图4为实验期内各小组小鼠初次排出黑便变化图。
图5A为正常组的小鼠结肠组织切片的观察图。
图5B为便秘对照组的小鼠结肠组织切片的观察图。
图5C为两歧双歧杆菌BBi32低剂量组的小鼠结肠组织切片的观察图。
图5D为两歧双歧杆菌BBi32高剂量组的小鼠结肠组织切片的观察图。
图6为实验期内各小组小鼠肠道环境的pH值对比图。
图7为大便性状Bristol标准图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中各组分来源如下所示：
Figure GDA0004084554960000071
Figure GDA0004084554960000081
实施例1
两歧双歧杆菌BBi32(Bifidobacterium bifidum BBi32)的分离、纯化及初步鉴定
(1)两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum BBi32的分离、纯化
以无菌操作吸取样品1000μL加入至9mL灭菌生理盐水混合作成1:10的均匀稀释液，并继续作一定比例的稀释。选择合适梯度的稀释液，用无菌枪头各吸取100μL分别涂布到MRS固体平板培养基中，30℃培养48h，观察记录菌落形态，如图1所示；
用接种环(灭菌牙签)从平板表面及内部挑取不同菌落接种于MRS液体培养基中，置30℃培养24h；重复以上步骤连续活化2代后进行涂片革兰氏染色镜检，如图2所示，确定为G+菌的继续活化，直至得到纯菌落(镜检无杂菌)，并进行过氧化氢酶实验。将G+和过氧化氢酶阴性的无芽孢杆菌、球菌及链球菌均暂定为乳酸菌，并保存，具体操作参照《微生物学实验技术》。
实验结果显示，从金堂县的十个样品中共分离出乳酸菌56株，乳酸菌活菌数平均在108cfu/mL数量级。
(2)Bifidobacterium bifidum BBi32的初步鉴定
革兰氏染色：取典型菌落涂片，进行革兰氏染色，在微生物显微镜油镜下观察菌体形态及其排列方式。挑取视野清晰、形态典型的菌株，进行拍照。过氧化氢酶实验：挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3％过氧化氢溶液2mL，观察结果(于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性)。
结果表明，从样品中分离纯化出的菌株均能在含5‰CaCO3的MRS平板培养基上生长，并在菌落周围形成溶钙圈，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阴性。
综上所述，本发明所述两歧双歧杆菌BBi32的形态学特征具体为：
菌体特征：呈革兰氏染色阳性，细胞杆状，一端有时呈分叉状，菌体约宽0.5-1.0μm，长1.5-4.0μm，有短的、规则的、瘦长的，不产芽孢；
菌落特征：在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.5-2.0mm之间，有凹凸且完整的边缘，颜色为乳白色到白色，表面湿润光滑。
(3)16S rRNA基因序列和pheS基因序列的鉴定：
将两歧双歧杆菌BBi32进行16S rRNA基因序列和pheS基因序列的鉴定，经过与模式菌株进行对比，鉴定结果显示，两歧双歧杆菌BBi32属于两歧双歧杆菌。
该菌株经测序分析，16S rRNA基因序列为：
TAGGCCACCGGCTTCGGGTGCTGCCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGGAGCCGGGTTGCAGGCTCCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGGGATCCGCTCCATGTCGCCATGTCGCATCCCGCTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAACCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCACCATAACGTGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCCGCCCCGAAGGGAAACGCCATCTCTGGCGTCGTCGGGAACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGACGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACACGTGGAACGTGCCCCACATCCAGCGTCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAGCCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTATTCGAAAGGTACACTCACCCGAAGGCTTGCTCCCAAACAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGAAGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCACGCCGATAGAATCTTTCCCACAATCACATGCGATCATGTGGAACATCCGGCATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGAGCATGGGGCAGGTCGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCACCAAGCAAGCTTGATGGATCCCGTTCGACTGCATG。
该菌株经测序分析，pheS基因序列测定结果：
GTGGCGCTTCACGCACAGCGAAGGTCAGGCCCTCCTCCATAGCGATGGGCTGAATCAGCTCAACGGTGAAGGTCGCGTGGTCGCCAGGCTGAACCATCTCGACGCCTTCCGGCAGCTCGATGACGCCGGTGACGTCGGTGGTGCGGAAGTAGAACTGCGGACGGTAGTTGGAGAAGAAGGGCGAGTGACGGCCGCCTTCGTCCTTGGTCAGCACGTAGACTTCGCCCTCGAACTTGGTGTGCGGGGTGACGGAGCCCGGCTTGGCCACAACCTGGCCACGCTCGACGTCCGTACGGTTGATGCCGCGGAGCAGCAGACCGGTGTTGTCGCCAGCCTCGCAGGCGTCCATGGTCTTGTGGAACGTCTCGATGGAGGTAACGGTGGTGGTCTGGGTCGGGCGGATGCCGACGATCTCGACCGGGGTGTTGACGGCCAGCTGGCCACGCTCAACACGACCGGTGACGACGGTACCACGGCCGGAGATGGTGAAGACGTCCTCGATAGGCATCAGGAACGGCTTGTCCAGGTCGTGAACCGGGGTCGGGATGTACTCGTCGACGGCGTCCATCAGGTCCTTGACGGTCTGGACCCACTTGTCGTGGTCCGGAGCGTCATCGTGCAGAGCGCCGTAGGCGGAGGTACGGATGACCGGGCAGTCGCGGTCGAAGCCGTTCTCGTCGAGGAGGTCACGGACCTCTTCCTCAACGAGCTCGATGAGCTCCTCGTCCTCGACCATGTCGCACTTGTTCAGGGCGACGAGGATACGCGGGACACCCACCTGACGGGCGAGCAGAACGTGCTCGCGGGTCTGGGCCATCGGGCCGTCGGTGGCGGCCACAACGAGGATGGCGCCATCCATCTGGGCAGCACCGGTGATCATGTTCTTCACGAAGTCGGCGTGGCCCGGGCAGTCCACGTGAGCGTAGTGACGCT。
实施例2
两歧双歧杆菌BBi32(Bifidobacterium bifidum BBi32)的体外筛选
(1)益生菌耐受pH 3.0人工胃液的筛选。
人工胃液的配制：0.2％NaCl、0.35％胃蛋白酶、用1mol/L的HCl调整pH值为3.0后，在无菌操作台中备用。
益生菌对人工胃液耐受性的测定：取5mL已经活化好的菌株培养液，在无菌操作台中倒入已灭菌的10mL离心管中，经3000r/min离心10min收集菌体，加入5mL灭菌生理盐水混匀制成菌悬液，取1mL菌悬液与9mL pH 3.0的人工胃液混合，摇匀，置于恒温振荡器中培养(37℃，150r/min)，并分别在0h和3h取样，用MRS琼脂培养基倾注37℃培养48h。用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)：存活率(％)＝3h的活菌数/0h的活菌数×100％。
(2)益生菌耐受不同浓度胆盐的测定。
选择在pH 3.0人工胃液中存活率在10％以上的菌种做不同胆盐浓度下的生长测试。将活化好的菌种5mL按2-5％的接种量(100μL)用移液枪分别接种于含0.0％牛胆盐(即空白)、0.3％牛胆盐、0.5％牛胆盐、1.0％牛胆盐(W/V)的MRS-THIO培养基(MRS培养基中加0.2％的巯基乙酸钠)。在恒温振荡器中37℃培养24h后，以空白培养基为对照(未接种的MRS-THIO培养基)，分别测定上述不同浓度培养基的OD值，计算菌株对胆盐的耐受力。胆盐耐受力＝含胆盐的培养基的OD值/空白培养基的OD值×100％。
(3)益生菌抑菌能力的测定。
选择在pH 3.0人工胃液中存活率在10％以上、耐胆盐较强的菌种做抑菌能力测试，将指示病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌甘油管接种于LB液体培养基(蛋白胨2％、酵母粉1％、NaCl 2％)中，37℃，150rpm培养14-16h。将活化好的菌种以2％(v/v)的接种量接种到灭菌冷却后的MRS液体培养基，37℃恒温培养36-40h。
利用牛津杯法进行抑菌圈的检测。取直径90mm的平板，距离中心点2cm处等距离放置4个牛津杯。取灭菌后的LB半固体培养基20-30mL，冷却致45-52℃，取大肠杆菌菌液50-80uL，加入培养基中，混匀后立即缓慢倒入放置牛津杯的平板上，均匀摊布。待培养基冷却凝固后，用无菌镊子将牛津杯取出，留下四个直径均等的孔洞。每个孔洞加入菌液200μL。另外金黄色葡萄球菌和沙门氏菌致病菌的抑菌圈实验同上，每种致病菌做3个平板的平行。结束后，轻取培养皿放入37℃培养箱，培养24h后检测抑菌圈直径。分别记录每种致病菌抑菌圈的平均直径。
(4)益生菌疏水性的测定。
选择在pH3.0人工胃液中存活率在10％以上、耐胆盐较强、抑菌能力较好的的菌种，经镜检观察菌体生长形态良好后进行试验，将活化好的细菌培养物5mL，在无菌操作台中倒入已灭菌10mL离心管中，以3000r/min离心10min收集菌体。以5mLPBS(50mM，pH 6.5)缓冲液洗涤菌体，3000r/min离心10min，重复洗涤两次。以PBS缓冲液为空白对照，用缓冲液调整受试菌株菌体浓度，使其在560nm波长下A0值约为1.00。
取4mL调整好浊度的菌液于已灭菌10mL离心管中，加入0.8mL二甲苯，对照组不加二甲苯，振荡30s，停顿10s，后再振荡30s，于试管架上静置5～10min分层，取下层水相，以PBS缓冲液为空白对照，在560nm下测量A值并进行记录。疏水率H％＝[(A0-A)/A0]×100其中A0和A分别是与二甲苯混匀前、后菌液在560m下测量得到的A值。
Bifidobacterium bifidum BBi32的筛选结果如下表1所示：
表1
Figure GDA0004084554960000111
筛选结果表明，Bifidobacterium bifidum BBi32菌株能耐受pH3.0的环境，且存活率在80％以上。
通过胃后存活的菌体将与小肠中的胆盐接触，本实验把乳酸菌对胆盐的抵抗能力用于作为潜在益生菌的一个选择标准。耐酸性较好的Bifidobacterium bifidum BBi32菌耐受不同浓度胆盐的的结果是对0.3％的胆盐有一定的耐受力，当胆盐浓度升高至0.5％及1.0％时，Bifidobacterium bifidum BBi32菌体现出了很好的胆盐耐受力。
两歧双歧杆菌发酵液对于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。作为常用的益生菌，一方面能够产生乳酸等物质降低肠道内的pH值，从而使适宜碱性环境生长的腐败菌无法增值。另一方面，乳酸菌在代谢过程中产生乳酸菌素等代谢产物，具有抑制和杀死多数革兰氏阳性致病菌和腐败菌的作用，实现保护肠粘膜、改善肠道微环境的功能。
除对小肠中胆盐有一定抵抗能力和抑菌能力的同时，乳酸菌还需在小肠粘膜上有很好的粘附性，因此将乳酸菌的疏水能力作为另一选择标准，从表1中可以看出，Bifidobacterium bifidum BBi32菌的疏水性达到了72.43±0.58％。
通过以上实验我们筛选出了Bifidobacterium bifidum BBi32菌。
基于实施例1和实施例2的鉴定和筛选结果，确认菌株属于两歧双歧杆菌，命名为两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum BBi32。将植物乳杆菌于2018年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC NO.16923。
实施例3
便秘模型小鼠实验
饲喂健康6周龄雌性昆明小鼠，体重26±2g，40只。喂食基础饲料，饲养在不锈钢笼中，室温保持24±2℃，相对湿度50±10％，12h明暗轮换(8:00～20:00照明)，适应5d后，将小鼠根据体重随机分成4组，分别为：正常组(Normal)、便秘对照组(Control)、两歧双歧杆菌BBi32低剂量组(1.0×107CFU/mL)、两歧双歧杆菌BBi32高剂量组(1.0×109CFU/mL)，每组10只。除正常组外，其余组给予洛哌丁胺10mg/kg灌胃，每天2次，连续7天，建立小鼠便秘模型，正常组给予等体积生理盐水，连续灌胃7天。
造模成功后，开始实验，在整个实验周期，正常组和便秘对照组均喂食基础饲料，益生菌组小鼠分别每天按10mL/kg灌胃益生菌，正常组和便秘对照组灌胃同剂量的生理盐水，连续灌胃15天，实验过程中，称量体重，并测定采食量、饮水量。第10天开始每天早上9:00给除正常组外其他5组小鼠灌胃浓度为10％的2℃活性炭冰水，0.2mL/只，每天灌胃一次，连续灌胃5天。直至实验最后一天，所有小鼠禁食24h，然后再灌胃10％的活性炭冰水，0.2mL/只。每组中5只小鼠用于测定体重变化、摄食量、饮水量、首次排出黑便所需时间、排粪便数量和粪便水分含量。小鼠另外5只小鼠在灌胃活性炭30min后处死解剖。
实验期内各小组小鼠体重变化、初次排出黑便所需时间参考如图3和图4所示。
正常组(Normal)小鼠体重随实验时间增加体重增加，便秘对照组(Control)在10天后由于灌胃活性炭出现便秘体重减轻，Bifidobacterium bifidum BBi32组也减缓了体重减轻，高浓度组体重减轻更少。
实验期内各小组小鼠饮食摄入量的变化如下表2：
表2
Figure GDA0004084554960000121
Figure GDA0004084554960000131
由表2测试结果可知，正常组小鼠体重随实验时间摄食量略微增加，便秘对照组在10天后由于灌胃活性炭出现便秘摄食量减少，Bifidobacterium bifidum BBi32组摄食量高于便秘对照组低于正常组，高浓度组摄食量减少得更少。
实验期内各小组小鼠饮水量的变化如下表3：
表3
Figure GDA0004084554960000132
由表3测试结果可知，正常组小鼠体重随实验时间饮水量略微增加，便秘对照组在10天后由于灌胃活性炭出现便秘饮水量减少，Bifidobacterium bifidum BBi32组饮水量高于对照组低于正常组，高浓度组饮水量减少得更少。
试验期内各小组小鼠的排便量、排便颗粒数和粪便水分含量的变化如下表4：
表4
Figure GDA0004084554960000133
Figure GDA0004084554960000141
由表4测试结果可知，前10天各组的排便量，排便颗粒数和粪便水分含量差别不大。10天后便秘诱导后，正常组片变量无明显变化，便秘对照组排便量、排便颗粒数和粪便水分含量较正常组明显下降，Bifidobacterium bifidum BBi32组的排便量、排便颗粒数和粪便水分高于对照组。
实施例4
小肠活性炭推进实验
将小鼠脱颈椎处死，剖开腹腔并分离小鼠的肠系膜，剪取上自幽门、下至回盲部的整根肠管，放于吸水纸上，将整条小肠拉成直线，测量肠管长度，即为“小肠总长度”，从幽门至活性炭汁前沿为“活性炭推进长度”。通过测量小肠中活性炭的推进长度，按下式计算推进率。推进率(％)＝(活性炭推进距离)/(小肠总长度)×100。另外，取0.5cm左右的结肠组织并置于10％福尔马林固定液中固定48h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行苏木素伊红(hematoxylinandeosin，H&E)染色进行病理学观察，实验结果见图5和图6所示。
试验期内各小组小鼠的小肠总长度、小肠推进率如下表5：
表5
Figure GDA0004084554960000142
表5：a-d表示各组之间存在显著差异(P＜0.05)
由表5测试结果可知，与正常组相比，便秘对照组小鼠小肠推进率有极显著差异，高、低灌胃剂量的Bifidobacterium bifidum BBi32组小鼠小肠推进率高于便秘对照组，低于正常组和便秘对照组，表现出一定的便秘预防效果。
此外，实验结果还显示便秘小鼠在摄入两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidumBBi32)后，乙酸、丙酸、正丁酸和总短链脂肪酸水平均有明显提高，短链脂肪酸总体含量增加能够降低肠道环境的pH值，a-d表示各组之间存在显著差异(P＜0.05)。且可知结肠组织染色切片结果还显示两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum BBi32)具有修复结肠粘膜损伤的特性。
实施例5
人群测试具体实例
1.受试者纳入标准：(1)年龄18～60岁者；(2)经便秘测评表格得分大于3的人群。便秘测评结果如下表6：
表6
分值 排便困难，过度用力排便 粪便性状* 排便时间min/次 频率d/次 腹胀
0 无 B：7-4 <10 1～2 无
1 偶尔 B：3 10～15 3 偶尔
2 时有 B：2 15～25 4～5 时有
3 经常 B：1 >25 >5 经常
粪便性状*：按照大便性状Bristol(表中以“B”表示)标准，如图7所示。
受试者排除标准：(1)体质虚弱无法进行试验者，孕期及哺乳期妇女；(2)90日内进行过外科手术；30日内发生过急性胃肠道疾病者。因严重器质病变引起的近期排便困难者(结肠癌、严重的肠炎、肠梗阻、炎症性肠病等)；(3)合并有心血管、肝、肾和造血系统等严重全身疾病患者，便秘困难并伴有疼痛者，或有其他伴随疾病正在治疗者。
2.测试实验设计
志愿者组成：男性31名，女性49名；年龄组成：20～29周岁占46.67％，30～45周岁占53.33％；
食用方法：每日下午2～3点之间食用两歧双歧杆菌BBi32，连续食用30日，每次食用10g益生菌。
3.指标观察
依据便秘测评表6每周记录1次相关指标。
每周记录早晨空腹情况下的体重变化。
4.结果判定标准
依据便秘测评表6，根据得分将便秘分为4个等级，得分0-3，Ⅰ级，排便良好；得分4-7，Ⅱ级，轻微便秘；得分8-12，Ⅲ级，一般便秘；得分13-15，Ⅳ级，严重便秘。
总有效率＝(A+B+C)/总例数×100％
A：通过便秘评分表测评，便秘评分上升3个等级(例如从Ⅳ→Ⅰ)，说明效果显著
B：通过便秘评分表测评，便秘评分上升2个等级(例如从Ⅲ→Ⅰ)，说明有效果
C：通过便秘评分表测评，便秘评分上升1个等级(从Ⅱ→Ⅰ)，说明有一定效果
试吃一个月后，体重较初始减轻5％(重量变化)以上，可认为对体重控制有帮助：体重控制有效率＝有效人数/总测评人数×100％；有效：体重较初始减轻5％以上。
5.测试结果
食用两歧双歧杆菌BBi32人群体感测试实验组统计表(80人：男31名，女49名)，如下表7：
表7
Figure GDA0004084554960000161
Figure GDA0004084554960000171
Figure GDA0004084554960000181
食用两歧双歧杆菌BBi32人群体感测试对照组统计表(80人：男25名，女55名)，如下表8：
表8
Figure GDA0004084554960000182
Figure GDA0004084554960000191
Figure GDA0004084554960000201
统计分析见下表9：
表9
Figure GDA0004084554960000211
从实验结果可以看出，实验组连续食用两歧双歧杆菌BBi32 1个月后，81％的测试者便秘得到改善，有49％的测试者便秘症状基本消失(便秘测评分数低于5)，并且有48％的测试者体重也得到减轻。对照组有65％的测试者便秘得到改善，35％的测试者便秘症状基本消失(便秘测评分数低于5)，31％的测试者体重也得到减轻。实验组的效果(改善便秘和减轻体重)优于对照组。
7.安全性评估
实验组有4例，对照组有8例，在开始服用后出现较严重的稀便，在减少食用量后，症状得到缓解；实验组有2例，对照组有3例，在服用1周后，偶尔出现腹胀腹疼，持续时间较短，饮用大量水后得到缓解。未发现其余不良反应、不适症及并发症。
8.实验总结
通过本实验测试可以得出，两歧双歧杆菌BBi32人群体感测试实验组：80％的志愿者食用两歧双歧杆菌BBi32后有强烈体感，能有效提高排泄频率，缓解便秘，尽管有20％的志愿者体感不明显，这是因为每个人体质不同，肠胃环境相差较大，很有可能食用量未达其体感阈值。相比对照组，实验室的体感效果更加明显。
本次受试人群年龄分布范围广，背景差异大，便秘病程历时也各异，便秘的发病因素也各不相同，在指标统计上仅测试体感效果和体重变化，下一阶段的测试会进一步细化人群指标，扩大受试人群数量，将可更多生物学指标(菌群分布、短链脂肪酸含量)纳入观察范围。
应用例1
本应用例提供一种复合工作发酵剂，所述复合工作发酵剂由以下制备方法制备得到：
(a)将10wt％的两歧双歧杆菌BBi32的菌种接种于脱脂乳中，110℃下灭菌10min后，再于37℃下培养15h至凝乳，再连续培养活化两代，得到母发酵剂；
(b)将2vol％的母发酵剂接种于灭菌原料乳中，再于37℃下培养15h至该凝乳中的活菌数为109cfu/mL，得到所述工作发酵剂；
(c)按质量比20:5:1的质量比将得到的工作发酵剂两歧双歧杆菌BBi32、嗜热链球菌ST36和保加利亚乳杆菌LB42混合，得到复合工作发酵剂。
应用例2
本应用例提供一种复合工作发酵剂，所述复合工作发酵剂由以下制备方法制备得到：
(a)将10wt％的两歧双歧杆菌BBi32的菌种接种于脱脂乳中，110℃下灭菌10min后，再于37℃下培养15h至凝乳，再连续培养活化两代，得到母发酵剂；
(b)将2vol％的母发酵剂接种于灭菌原料乳中，再于37℃下培养15h至该凝乳中的活菌数为109cfu/mL，得到所述工作发酵剂；
(c)按质量比5:10:5的质量比将得到的工作发酵剂两歧双歧杆菌BBi32、嗜热链球菌ST36和保加利亚乳杆菌LB42混合，得到复合工作发酵剂。
应用例3
本应用例提供一种复合工作发酵剂，所述复合工作发酵剂由以下制备方法制备得到：
(A)分别将10wt％的两歧双歧杆菌BBi32的菌种、5wt％的嗜热链球菌ST36的菌种、1wt％的保加利亚乳杆菌LB42的菌种接种于MRS液体培养基中，37℃下活化培养14h，连续活化两代，得到两歧双歧杆菌BBi32的活化培养物、嗜热链球菌ST36的活化培养物、保加利亚乳杆菌LB42的活化培养物；
(B)分别将3vol％的两歧双歧杆菌BBi32的活化培养物、1vol％的嗜热链球菌ST36的活化培养物、1vol％的保加利亚乳杆菌LB42的活化培养物接种于MRS液体培养基中，均在30℃下培养17h后，分别于4℃、4000r/min离心15min，去除上清液，收集，得到两歧双歧杆菌BBi32的细胞沉淀、嗜热链球菌ST36的活化培养物的细胞沉淀、保加利亚乳杆菌LB42的细胞沉淀；
(C)将步骤(B)得到的两歧双歧杆菌BBi32的细胞沉淀、嗜热链球菌ST36的活化培养物的细胞沉淀、保加利亚乳杆菌LB42的细胞沉淀混合后，用无菌脱脂奶制成悬浮液，所述细胞沉淀和无菌原料乳的质量比为1:10，得到所述工作发酵剂，所述工作发酵剂中的活菌数为109cfu/mL。
应用例4
本应用例提供一种复合工作发酵剂，所述复合工作发酵剂由以下制备方法制备得到：
(A)分别将5wt％的两歧双歧杆菌BBi32的菌种、10wt％的嗜热链球菌ST36的菌种、5wt％的保加利亚乳杆菌LB42的菌种接种于MRS液体培养基中，37℃下活化培养14h，连续活化两代，得到两歧双歧杆菌BBi32的活化培养物、嗜热链球菌ST36的活化培养物、保加利亚乳杆菌LB42的活化培养物；
(B)分别将1vol％的两歧双歧杆菌BBi32的活化培养物、1vol％的嗜热链球菌ST36的活化培养物、1vol％的保加利亚乳杆菌LB42的活化培养物接种于MRS液体培养基中，均在30℃下培养17h后，分别于4℃、4000r/min离心15min，去除上清液，收集，得到两歧双歧杆菌BBi32的细胞沉淀、嗜热链球菌ST36的活化培养物的细胞沉淀、保加利亚乳杆菌LB42的细胞沉淀；
(C)将步骤(B)得到的两歧双歧杆菌BBi32的细胞沉淀、嗜热链球菌ST36的活化培养物的细胞沉淀、保加利亚乳杆菌LB42的细胞沉淀混合后，用无菌脱脂奶制成悬浮液，所述细胞沉淀和无菌原料乳的质量比为1:15，得到所述工作发酵剂，所述工作发酵剂中的活菌数为1010cfu/mL。
对比应用例1
本对比应用例提供一种复合工作发酵剂，与应用例1的区别仅在于，不添加嗜热链球菌ST36，缺失部分以保加利亚乳杆菌LB42补至与应用例1的复合工作发酵剂总质量相等。
对比应用例2
本对比应用例提供一种复合工作发酵剂，与应用例2的区别仅在于，不添加保加利亚乳杆菌LB42，缺失部分以保嗜热链球菌ST36补至与应用例1的复合工作发酵剂总质量相等。
对比应用例3
本对比应用例提供一种复合工作发酵剂，与应用例3的区别仅在于，将嗜热链球菌ST36替换为等质量的嗜热链球菌ST30。
对比应用例4
本对比应用例提供一种复合工作发酵剂，与应用例4的区别仅在于，将保加利亚乳杆菌LB42替换为等质量的保加利亚乳杆菌LB40。
试验例1
本试验例提供四种由上述发酵剂制备得到的产品和相关测试及结果
(I)乳酸菌的奶饮料的制备方法：取脱脂乳在95℃下加热杀菌15min，冷却到4℃后，分成等质量8组；在8组平行中分别加入对应的发酵剂进行混合，至总活菌数为106cfu/mL，冷藏保存，4℃得到含乳酸菌的奶饮料。
(II)乳粉的制备方法：取脱脂乳在95℃下加热杀菌15min，冷却到37℃后，分成等质量8组；在8组平行中分别接种3vol％的对应的发酵剂进行混合，于37℃下发酵；将复合发酵乳与灭菌后的原料乳以体积比为1:1的比例混合，进行均质；最后真空浓缩、喷雾干燥，得到所述乳粉。
(III)胶囊制品的制备方法：取脱脂乳在140℃下加热杀菌2s，冷却到37℃后，分成等质量8组；在8组3个平行中分别接种3vol％的对应的发酵剂进行混合，于37℃下发酵；将复合发酵乳与灭菌后的原料乳以体积比为1:1的比例混合，进行均质；最后真空浓缩、喷雾干燥处理后得到乳粉，得到所述胶囊制品。
(IV)发酵乳的制备方法：取脱脂乳在140℃下加热杀菌2s，冷却到37℃后，分成等质量8组；在8组3个平行中分别接种3vol％的对应的发酵剂进行混合后，于37℃下发酵，发酵液至滴定酸度为(以乳酸计)0.5％，冷却至4℃低温，得到所述发酵乳。
测试方法：小鼠肠道pH值参照实施例4的方法，缓解便秘有效率、体重减轻有效率参照实施例5的方法。
测试结果如下表10：
表10
Figure GDA0004084554960000231
Figure GDA0004084554960000241
由表10的测试结果可知，在本发明中，将所述的作复合工作发酵剂添加到食品中后，两歧双歧杆菌BBi32与可共生的嗜热链球菌ST36和保加利亚乳杆菌LB42协同发酵一起使用制备发酵乳，能够进一步提高食品(原料乳)的发酵速度，且两歧双歧杆菌BBi32、嗜热链球菌ST36和保加利亚乳杆菌LB42相互配合，具有协同增效的作用，能够进一步提高短链脂肪酸总体含量，从而更加有效地降低肠道环境的pH值，修复结肠黏膜损伤。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的缓解便秘的两歧双歧杆菌及其应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 微康益生菌（苏州）股份有限公司
<120> 一种缓解便秘的两歧双歧杆菌及其应用
<130> 2022
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1375
<212> DNA
<213> 两歧双歧杆菌BBi32
<400> 1
taggccaccg gcttcgggtg ctgcccactt tcatgacttg acgggcggtg tgtacaaggc 60
ccgggaacgc attcaccgcg gcgttgctga tccgcgatta ctagcgactc cgccttcacg 120
gagccgggtt gcaggctccg atccgaactg agaccggttt tcagggatcc gctccatgtc 180
gccatgtcgc atcccgctgt accggccatt gtagcatgcg tgaagccctg gacgtaaggg 240
gcatgatgat ctgacgtcat ccccaccttc ctccgagtta accccggcgg tcccccgtga 300
gttcccacca taacgtgctg gcaacacggg gcgagggttg cgctcgttgc gggacttaac 360
ccaacatctc acgacacgag ctgacgacga ccatgcacca cctgtgaacc cgccccgaag 420
ggaaacgcca tctctggcgt cgtcgggaac atgtcaagcc caggtaaggt tcttcgcgtt 480
gcatcgaatt aatccgcatg ctccgccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt tctttgagtt 540
ttagccttgc ggccgtactc cccaggcggg acgcttaacg cgttagctcc gacacggaac 600
acgtggaacg tgccccacat ccagcgtcca ccgtttacgg cgtggactac cagggtatct 660
aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag tgacggccca gagacctgcc 720
ttcgccatcg gtgttcttcc cgatatctac acattccacc gttacaccgg gaattccagt 780
ctcccctacc gcactccagc ccgcccgtac ccggcgcaga tccaccgtta agcgatggac 840
tttcacaccg gacgcgacga gccgcctacg agccctttac gcccaataaa tccggataac 900
gcttgcgccc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccggcgc ttattcgaaa 960
ggtacactca cccgaaggct tgctcccaaa caaaagaggt ttacaacccg aaggcctcca 1020
tccctcacgc ggcgtcgctg catcaggctt gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg 1080
cctcccgtag gagtctgggc cgtatctcag tcccaatgtg gccggtcgcc ctctcaggcc 1140
ggctacccgt cgaagccttg gtgagccgtt acctcaccaa caagctgata ggacgcgacc 1200
ccatcccacg ccgatagaat ctttcccaca atcacatgcg atcatgtgga acatccggca 1260
ttaccacccg tttccaggag ctattccgga gcatggggca ggtcggtcac gcattactca 1320
cccgttcgcc actctcacca ccaagcaagc ttgatggatc ccgttcgact gcatg 1375
<210> 2
<211> 933
<212> DNA
<213> 两歧双歧杆菌BBi32
<400> 2
gtggcgcttc acgcacagcg aaggtcaggc cctcctccat agcgatgggc tgaatcagct 60
caacggtgaa ggtcgcgtgg tcgccaggct gaaccatctc gacgccttcc ggcagctcga 120
tgacgccggt gacgtcggtg gtgcggaagt agaactgcgg acggtagttg gagaagaagg 180
gcgagtgacg gccgccttcg tccttggtca gcacgtagac ttcgccctcg aacttggtgt 240
gcggggtgac ggagcccggc ttggccacaa cctggccacg ctcgacgtcc gtacggttga 300
tgccgcggag cagcagaccg gtgttgtcgc cagcctcgca ggcgtccatg gtcttgtgga 360
acgtctcgat ggaggtaacg gtggtggtct gggtcgggcg gatgccgacg atctcgaccg 420
gggtgttgac ggccagctgg ccacgctcaa cacgaccggt gacgacggta ccacggccgg 480
agatggtgaa gacgtcctcg ataggcatca ggaacggctt gtccaggtcg tgaaccgggg 540
tcgggatgta ctcgtcgacg gcgtccatca ggtccttgac ggtctggacc cacttgtcgt 600
ggtccggagc gtcatcgtgc agagcgccgt aggcggaggt acggatgacc gggcagtcgc 660
ggtcgaagcc gttctcgtcg aggaggtcac ggacctcttc ctcaacgagc tcgatgagct 720
cctcgtcctc gaccatgtcg cacttgttca gggcgacgag gatacgcggg acacccacct 780
gacgggcgag cagaacgtgc tcgcgggtct gggccatcgg gccgtcggtg gcggccacaa 840
cgaggatggc gccatccatc tgggcagcac cggtgatcat gttcttcacg aagtcggcgt 900
ggcccgggca gtccacgtga gcgtagtgac gct 933

Claims (6)

1.一种复合工作发酵剂，其特征在于，所述复合工作发酵剂包括由缓解便秘的两歧双歧杆菌培养得到的工作发酵剂、嗜热链球菌ST36发酵剂和保加利亚乳杆菌LB42发酵剂，所述缓解便秘的两歧双歧杆菌为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)BBi32菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16923，保藏日期为2018年12月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的复合工作发酵剂在制备用于降低肠道环境的pH值的产品中的应用。
3.根据权利要求1所述的复合工作发酵剂在制备缓解便秘的产品中的应用。
4.一种食品，其特征在于，所述食品的制备原料包括原料乳和发酵剂；其中，所述发酵剂为权利要求1所述的复合工作发酵剂。
5.根据权利要求4所述的食品，其特征在于，所述食品为乳酸菌奶饮料、乳粉或胶囊制品中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求4或5所述的食品，其特征在于，所述原料乳为脱脂奶、鲜奶或复原奶中的任意一种或至少两种的组合。
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