CN117887646B

CN117887646B - 一种抗焦虑和抑郁的复合益生菌及其应用

Info

Publication number: CN117887646B
Application number: CN202410303118.5A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 董瑶; 司文瑾; 齐永梅
Original assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2024-03-18
Filing date: 2024-03-18
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2044-03-18
Also published as: CN117887646A

Abstract

本发明涉及一种抗焦虑和抑郁的复合益生菌及其应用，所述抗焦虑和抑郁的复合益生菌由凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC99菌株和两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum BBi32菌株组成。两种菌株能够相互配合、相互促进、在抗焦虑和抑郁方面的效果上协同增效，在使用菌量一致的情况下，与单一的BC99菌株或单一的BBi32菌株干预方式相比，两种菌的复配在抗焦虑和抑郁方面的效果上显著提高。因此，将该复合益生菌用于制备预防、缓解或治疗焦虑症和/或抑郁症的产品中具有很好的前景。同时，两种菌均为益生菌，产品的安全性高，且不易产生抗性。

Description

一种抗焦虑和抑郁的复合益生菌及其应用

技术领域

本发明属于益生菌技术领域，涉及一种抗焦虑和抑郁的复合益生菌及其应用。

背景技术

益生菌作为一类有益的微生物，因其在人体肠道中维持生态平衡的作用而受到关注。更深入的研究揭示了肠道与大脑之间存在着紧密的联系，即所谓的“肠脑轴”，这一发现为益生菌通过调整肠道微生物群落来积极干预抑郁和焦虑提供了理论基础。

益生菌的摄入不仅有助于维护肠道菌群的平衡，减少有害菌的生长，而且能够促进有益菌的繁殖。这些益生菌能够在肠道内产生对大脑有益的代谢产物，如短链脂肪酸和神经传递物质，通过肠脑轴影响情绪和心理状态。此外，益生菌还能够减轻身体的慢性炎症反应，这一点对于抑郁和焦虑的治疗尤为重要，因为慢性炎症被认为与这些心理健康问题紧密相关。值得注意的是，益生菌对心理健康的积极影响还与其能够调节脑源性神经营养因子（BDNF）水平有关。BDNF是一种在大脑中发挥关键作用的蛋白质，对神经元的生存、增长和分化至关重要，而其水平的变化与抑郁和焦虑症状的改善密切相关。同时，益生菌通过减少炎症因子的产生，有助于降低与心理压力相关的炎症水平，进一步促进心理健康。

因此，益生菌在改善抑郁和焦虑方面的潜在作用不仅展现了其作为新型治疗手段的可能性，而且还为心理健康干预提供了新的科学依据。然而现有的能够有效改善焦虑和抑郁的益生菌产品还相对鲜少，开发一种可以有效改善焦虑和抑郁的微生物制剂是非常有必要的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗焦虑和抑郁的复合益生菌及其应用，具体提供一种抗焦虑和抑郁的复合益生菌、抗焦虑和抑郁的微生态制剂、及其在制备预防、改善或治疗抑郁症和/或焦虑症的产品中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗焦虑和抑郁的复合益生菌，所述抗焦虑和抑郁的复合益生菌由保藏编号为CGMCC No. 21801的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC99菌株和保藏编号为CGMCC No. 16923的两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum BBi32菌株组成。

本发明创造性地开发了一种全新的益生菌复配方式和一种全新的抗焦虑和抑郁的策略，即将凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC99菌株和两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum BBi32菌株进行复配联用，发现两者能够相互配合、相互促进、在抗焦虑和抑郁方面的效果上协同增效，在使用菌量一致的情况下，与单一的BC99菌株或单一的BBi32菌株干预方式相比，两种菌的复配在抗焦虑和抑郁方面的效果上显著提高。因此，将该复合益生菌用于制备预防、缓解或治疗焦虑症和/或抑郁症的产品中具有很好的前景。同时，两种菌均为益生菌，产品的安全性高，且不易产生抗性。

所述复合益生菌的制备方法采用本领域常规的技术方法即可，示例性地可以为：将BC99菌株或BBi32菌株活化后，分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，菌体重悬得到菌悬液；按照活菌数比例要求将两种菌悬液混合，即可。或者进一步地加入保护剂进行冷冻干燥，制得冻干菌粉产品。

优选地，所述BC99菌株与BBi32菌株的活菌数之比为1:20-20:1，例如1:20、1:18、1:15、1:12、1:10、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、15:1、18:1、20:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第二方面，本发明提供一种抗焦虑和抑郁的微生态制剂，所述微生态制剂中的菌株包括第一方面所述的复合益生菌。

优选地，在所述微生态制剂中，活菌总数不低于1×10⁹ CFU/mL或1×10⁹ CFU/g，例如1×10⁹CFU/g（CFU/mL）、2×10⁹CFU/g（CFU/mL）、5×10⁹CFU/g（CFU/mL）、8×10⁹CFU/g（CFU/mL）、1×10¹⁰CFU/g（CFU/mL）、5×10¹⁰CFU/g（CFU/mL）、1×10¹¹CFU/g（CFU/mL）、1×10¹²CFU/g（CFU/mL）、1×10¹³CFU/g（CFU/mL）等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述微生态制剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制，包括最常用的冻干粉剂，或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。其中冻干粉剂示例性地可以采用如下方法制得：

将BC99菌株和BBi32菌株活化后，分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，得到菌体；菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；重悬液冻干，按配比混合，即得。

优选地，所述培养基包括MRS培养基。

优选地，所述MRS培养基以浓度计包括：蛋白胨8-12 g/L、牛肉膏8-12 g/L、葡萄糖15-25 g/L、乳糖10-20 g/L、酵母粉3-7 g/L、柠檬酸氢二铵1-3 g/L、K₂PO₄·3H₂O 2-3 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.05-0.2 g/L、MnSO₄ 0.01-0.1 g/L、吐温80 0.5-2 mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.1-1 g/L。

优选地，所述冻干采用真空冷冻法。

优选地，所述微生态制剂中还包括保护剂和/或功能助剂。

优选地，所述保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合；

所述功能助剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供第一方面所述的复合益生菌或第二方面所述的微生态制剂在制备预防、改善或治疗抑郁症和/或焦虑症的产品中的应用。

优选地，所述产品中还包括辅料。

优选地，所述辅料选自填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

附图说明

图1是跳台实验中各组小鼠跳下平台的潜伏时间（s）的统计结果图；

图2是高架十字迷宫实验中各组小鼠在开放臂时间占比（%）的统计结果图；

图3是强迫游泳实验中各组小鼠不动时间占比（%）的统计结果图；

图4是悬尾实验中各组小鼠不动时间占比（%）的统计结果图；

图5是各组小鼠的前额皮质脑源性神经营养因子水平的统计结果图；

图6是各组小鼠的前额皮质5-羟色胺前体水平的统计结果图；

图7是各组小鼠的前额皮质5-羟色胺水平的统计结果图；

图8是各组小鼠的下丘脑皮质醇释放因子水平的统计结果图；

图9是各组小鼠的血清促肾上腺皮质激素水平的统计结果图；

图10是各组小鼠的血清皮质酮水平的统计结果图；

图11是各组小鼠粪便样本中乙酸含量的统计结果图；

图12是各组小鼠粪便样本中丙酸含量的统计结果图；

图13是各组小鼠粪便样本中丁酸含量的统计结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乳糖、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K₂PO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄、吐温80和半胱氨酸盐酸盐购自国药集团化学试剂有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS培养基（g/L）：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖15g/L、乳糖15g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。

下述实施例所涉及的BC99菌株的分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年02月01日，保藏编号为CGMCC No. 21801，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述实施例所涉及的BBi32菌株的分类命名为两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年12月10日，保藏编号为CGMCC No. 16923，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述实施例中涉及的菌悬液：将所需菌株接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在6000g下离心10min，使用PBS重悬菌体，即得。

试验结果数据使用R语言的ggplot2进行统计分析，与对照组相比，###代表p<0.001；与模型组相比，***代表p<0.001，**代表p<0.01，*代表p<0.05，NS.代表无显著差异。

实施例

本实施例探究复合益生菌对抑郁焦虑症小鼠的症状改善能力：

（1）试验动物：6周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠（56只，从上海实验动物中心采购），平均体重为（20±2）g。这些小鼠在受控环境下饲养，室温维持在22±2℃，湿度为55%±5%，遵循12h光/暗循环。它们可以随意进食和饮水。所有涉及小鼠的实验程序均符合上海实验动物护理与动物实验中心规定的动物护理和使用伦理指南。

（2）动物分组：按上述小鼠适应性喂养1周后，将56只小鼠随机分为7组（每组8只）：对照组（CTL组）、模型组（dep组）、BC99组（记为S1组）、BBi32组（记为S2组）、市售凝结芽孢杆菌菌株BNCC168437组（记为S3组）、复合菌组1（BC99+BBi32组，活菌数比为1:1，记为S4组）、复合菌组2（BNCC168437+ BBi32组，活菌数比为1:1，记为S5组）。

（3）动物建模及干预方法：

模型组和益生菌干预组通过接受为期5周的慢性不可预知温和刺激（CUMS）法构建抑郁焦虑症小鼠模型。慢性不可预知温和刺激包括以下10种不同的刺激：强制游泳（在一个22cm深的玻璃罐中注入23±2℃的水，将小鼠放在玻璃缸中10min，并用一个厚重的盖子小心地盖上防止其逃跑，然后将小鼠放回干净、干燥的笼子里，并铺上新鲜的垫料，以避免受寒和感冒）；约束力（将小鼠放在一个50mL的塑料管中，用塑料胶带在外面调整，使动物无法移动，管子的远端有一个孔，以便于正常呼吸）；水资源匮乏（在24 h内从笼子里取出水瓶，达到时间点后将水瓶放回）；隔离（将小鼠单独放在一个新笼子里24 h，然后将小鼠与它们的同伴一起送回笼子）；食物匮乏（将食物从笼子里移出24 h，然后将食物放回）；湿垫料（将小鼠单独放在一个新的笼子里，每100克垫料有200毫升水，持续24 h，将小鼠与它们的同伴一起送回笼子）；无垫料（将小鼠单独放在一个没有被褥的新笼子里24 h，将动物与它们的同伴一起送回笼子）；倾斜笼（将笼子以45°倾斜24 h，将笼子恢复到正常状态）；夹尾（在离尾巴末端2厘米处夹住塑料钳，每次持续3分钟，每天共3次，将动物与它们的同伴一起送回笼子）；拥挤的空间（在笼子里放一个塑料隔板，减少一半的活动区域，24 h后，取出隔板）。为了避免动物对特定刺激的适应，从而影响实验结果的准确性，这些刺激每天随机施加1-2种，每周随机刺激6天。此外，为了保证实验的不可预知性，每种刺激在整个实验期间的累计使用次数不超过三次。这种方法旨在创造一个复杂且多变的压力环境，以诱导小鼠出现类似于人类抑郁和焦虑的行为和生理反应。

在整个实验期间，CTL组和dep组常规饲养，各益生菌干预组在常规饲养的同时灌胃益生菌菌液，用量为1×10⁹CFU/只/天。

（4）行为学评价：

第七周开始对所有小鼠的行为学评价，包括跳台实验、高架十字迷宫实验、强迫游泳实验、悬尾实验。

（4.1）跳台实验：跳台实验可以用来评价动物焦虑行为，具体操作为：电击训练阶段：小鼠被放在平台上，电网通电（0.2毫安）；当小鼠跳下平台时，它受到一次电击刺激，从而产生痛觉记忆；训练时间为三分钟；如果小鼠在3分钟内没有跳下平台，它们就被赶走。训练结束后，所有小鼠都回到了原来的笼子里。训练后24 h为记忆再现阶段：将小鼠放在平台上，进行3分钟的测试。这个测试不会通电，统计各组小鼠跳下平台的潜伏时间（s）。

结果如图1所示，由图可知，与对照组相比，模型组小鼠在跳台实验中跳下平台的潜伏时间变长，这暗示了增加的犹豫和焦虑行为，在经过益生菌的干预处理后，该行为学指标趋向正常化，潜伏时间缩短，且S4组小鼠的变化更为显著。

（4.2）高架十字迷宫实验：高架十字迷宫测试可以用来评价动物焦虑行为，具体操作为：小鼠被放置在迷宫的中心区域，面对开放的手臂，允许动物自由移动6分钟，统计各组小鼠在开放臂的时间占比（%）。

结果如图2所示，由图可知，与对照组相比，模型组小鼠在高架十字迷宫实验中在开放臂中的时间占比减少，这暗示了增加的犹豫和焦虑行为，在经过益生菌的干预处理后，该行为学指标趋向正常化，且S4组小鼠的变化更为显著。

（4.3）强迫游泳实验：使用一个30厘米的玻璃缸，里面有23-25℃的水。第一天，强迫所有小鼠游泳15 min，进行训练。第二天，将小鼠放在相同的环境中10 min。使用视频跟踪系统监测运动性活动，并计算每只动物在测试期间的不动时间（不动被定义为除了保持头部高于水面所需的漂浮动作外的无动情况）。

结果如图3所示，由图可知，与对照组相比，模型组小鼠在强迫游泳实验中不动的时间占比显著增加，这反映了较高的绝望行为，是抑郁状态的典型表现，在经过益生菌的干预处理后，该行为学指标趋向正常化，且S4组小鼠的变化更为显著。

（4.4）悬尾实验：

用胶布将小鼠尾巴尖（距尾巴尖2 cm）贴在悬吊杆上（距地面30 cm高）。使小鼠触碰悬挂，小鼠一开始会处于本能激烈地挣扎试图逃离困境，但若不能脱困，会陷入绝望状态静止不动，表现出抑郁样行为，不动的时间越长越抑郁。通过视频跟踪系统监测运动活动，持续6 min，并计算每只动物在测试期间的不动时间（不动被定义为没有自愿或逃避性的运动）。

结果如图4所示，由图可知，与对照组相比，模型组小鼠在悬尾实验中不动的时间占比显著增加，这反映了较高的绝望行为，是抑郁状态的典型表现，在经过益生菌的干预处理后，该行为学指标趋向正常化，且S4组小鼠的变化更为显著。

（5）样本收集：

第7周末对所有小鼠实施安乐死并取材。

在研究过程中，小鼠被安置在高温消毒的笼子中，便于自然排便。每个实验周的第一天进行粪便样本的系统收集。每只小鼠在上午8点-9点之间每次收集约3g的粪便样本。这些样本被存放在无菌2 mL离心管中，立即用液氮冷冻，然后运送到实验室保存在-80℃。每只小鼠每次粪便样本在两个离心管中收集，取最后一次收集的粪便样本进行短链脂肪酸的测定。血液采样是在实验结束时进行的，每只小鼠收集100-200 μL的血液，采集时间为上午10-11点。离心1200×g 10 min后，提取约100 μL血清，存放在-80 ℃中。

（6）指标检测：

（6.1）使用酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉纯度生物技术有限公司），按照制造商的指导进行量化测定前额皮质（PFC）的脑源性神经营养因子（BDNF）、5-羟色胺（5-HTP）和5-羟色氨酸（5-HT）、下丘脑皮质醇释放因子（CRF）、血清促肾上腺皮质激素（ACTH）和血清皮质酮的浓度进行分析。

结果如图5-图10所示，由图可知，与对照组相比，模型组小鼠脑源性神经营养因子（BDNF）、5-羟色胺前体（5-HTP）、5-羟色胺（5-HT）的水平出现了显著下降，皮质醇释放因子（CRF）、促肾上腺皮质激素（ACTH）以及血清皮质酮的水平出现了显著升高，这些变化反映了抑郁状态下神经传递、应激反应和神经保护机制的广泛受损。然而益生菌干预后，抑郁焦虑模型小鼠的脑源性神经营养因子、5-羟色胺前体、5-羟色胺、皮质醇释放因子、促肾上腺皮质激素和皮质酮水平显著的恢复，甚至增强。这一结果证明了益生菌干预在恢复神经化学平衡、提升神经保护因子水平、调节应激激素反应以及促进情绪调节机制方面的潜在效力，且两菌联合的S4组的效果更优。

（6.2）短链脂肪酸（SCFAs）测量：使用乙醚萃取小鼠粪便中的短链脂肪酸。使用配备毛细管柱的GC-MS系统测量样品。选择氦气作为载气，流速为0.89 mL/min。将样品注入GC系统后，柱箱温度以7.5℃/min的速率从100℃升至140℃，随后以6.0℃/min的速率升至200℃，并保持3 min。柱头压力为62.7 kPa，分流比为10:1。质谱仪中离子源和界面温度分别为220℃和250℃，扫描范围设置为m/z 2-100。

结果如图11-图13所示，由图可知，与对照组相比，模型组小鼠的乙酸、丙酸和丁酸水平显著下降，这一发现揭示了抑郁状态可能与肠道微生物群落的变化及其代谢产物的减少密切相关，进一步强调了肠道-大脑轴在心理健康中的重要作用，但益生菌干预后短链脂肪酸水平显著升高，尤其是S4组效果最为显著。这突显了益生菌在调节肠道微环境和促进健康肠道微生物群落平衡方面的潜在效能。这种显著的正向变化不仅为益生菌在改善抑郁焦虑症状和调节情绪方面的作用提供了有力的生物学证据，也为进一步探索肠道微生物与心理健康之间的复杂相互作用提供了重要的科学基础。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种抗焦虑和抑郁的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂中的菌株包括复合益生菌，所述复合益生菌由保藏编号为CGMCC No. 21801的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC99菌株和保藏编号为CGMCC No. 16923的两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum BBi32菌株组成；

所述BC99菌株与BBi32菌株的活菌数之比为1:5-5:1；在所述微生态制剂中，活菌总数不低于1×10⁹ CFU/mL或1×10⁹ CFU/g。

2.根据权利要求1所述的抗焦虑和抑郁的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

3.根据权利要求1所述的抗焦虑和抑郁的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂中还包括保护剂和/或功能助剂。

4.根据权利要求3所述的抗焦虑和抑郁的微生态制剂，其特征在于，所述保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合；

5.权利要求1-4中任一项所述的微生态制剂在制备预防、改善或治疗抑郁症和/或焦虑症的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品中还包括辅料。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料选自填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。