BR112012001812B1 - Uso de bactéria para o tratamento da endotoxemiametabólica em mamífero - Google Patents

Abstract

uso de bactérias de ácido lático ou bifidobacterium ou uma mistura dessas a presente invenção refere-se ao uso de uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer dessas para o tratamento de endotoxemia metabólica, inibindo a translocação bacteriana e regulação da absorção de lipídeos em um mamífero.

Description

[0001] Esta invenção refere-se aos novos usos de bactérias láticas e bifidobactérias (em particular, embora não exclusivamente, as bactérias probióticas) e aos produtos alimentícios, produtos de alimentação animal, suplementos de dieta e formulações farmacêuticas que os contêm.

Antecedentes da Invenção [0002] Endotoxemia é definida como a presença de um elevado nível de lipopolissacarídeos (também conhecidos como endotoxinas) no corpo. Lipopolissacarídeos (LPS), também conhecidos como lipoglicanos, são moléculas grandes consistindo de pelo menos uma metade lipídica e pelo menos uma metade polissacarídica unidas por uma ligação covalente. LPS são encontrados na membrana externa das bactérias Gram-negativas, agem como endotoxinas e provocam fortes respostas imunes nos animais.

[0003] Cani et al., Diabetes, 2007, 56, 1761-1772, descreve a indução de um aumento na endotoxemia em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura. Os autores descobriram que a concentração plasmática de LPS varia ao longo do dia, aumentando até um máximo no final do anoitecer, período de alimentação para camundongos alimentados com uma dieta normal, e que uma dieta rica em gordura fez com que a endotoxemia fosse alta durante todo o dia. Os autores definem o termo “endotoxemia metabólica” como um aumento crônico de 2 a 3 vezes na concentração dos lipopolissacarídeos plasmáticos (LPS) a partir de níveis de linha de base, induzidos por uma dieta rica em gordura, e observa-se que os níveis de endotoxemia atingido foram 10 a 50 vezes menor do que o obtida durante o choque séptico.

[0004] Translocação bacteriana é definida como a passagem de bactérias viáveis do trato intestinal através da mucosa epitelial no corpo. As bactérias podem entrar no sistema linfático via linfonodos mesentéricos e, assim, podem circular sistemicamente. As bactérias também podem entrar na

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2/48 circulação sanguínea (bacteremia) e também podem ser localizadas nos tecidos. A translocação bacteriana pode ocorrer em uma série de condições médicas, incluindo supercrescimento bacteriano intestinal, lesão intestinal e choque. Qualquer condição médica associada com a permeabilidade intestinal aumentada pode potencialmente levar à translocação bacteriana.

[0005] Como os LPS se originam das bactérias no intestino, a translocação de bactérias do intestino no corpo pode potencialmente servir como um mecanismo potencial de endotoxemia, incluindo endotoxemia metabólica. Se bactérias Gram-negativas se translocarem para dentro do corpo, elas servem como fonte de LPS. No entanto, a rota exata de LPS no corpo na endotoxemia metabólica é atualmente desconhecida: a translocação bacteriana é considerada uma possível explicação, mas LPS livres do intestino também podem entrar no corpo durante a absorção de lipídeos normal. Também é possível que vários mecanismos ocorram ao mesmo tempo.

[0006] Schiffrin et al., Br. J. Nutr., 2009, 101, 961-966, descrevem o uso de um suplemento de iogurte probiótico em pacientes idosos com pequeno supercrescimento bacteriano intestinal (SIBO). Os efeitos sobre a colonização intestinal, permeabilidade intestinal, translocação de endotoxinas e modificação de funções imunes inatas foram avaliados. No entanto, a endotoxemia nos pacientes descritos neste documento é a endotoxemia de choque séptico, que é causada pela infecção por patógenos, tais como bactérias patogênicas, e em que, conforme descrito no artigo de Cani et al. acima referido, os níveis de LPS plasmáticos são aumentados por um fator muito maior em relação aos níveis normais. Isso é diferente de endotoxemia metabólica que, como descrito acima, é geralmente causada por dieta (em particular, por uma dieta rica em gordura) e em que o aumento nos níveis plasmáticos de LPS (expresso como um múltiplo dos níveis normais) é muito menor.

Resumo da Invenção [0007] Em um aspecto, a invenção fornece o uso de uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou

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3/48 uma mistura de qualquer uma destas na fabricação de um produto alimentar, suplemento da dieta ou medicamento para o tratamento da endotoxemia metabólica em um mamífero.

[0008] Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada das espécies Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis ou Bifidobacterium bifidium, ou uma mistura destas na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para tratamento de endotoxemia em um mamífero.

[0009] Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentar, suplemento dietético ou medicamento para inibir a translocação bacteriana em um mamífero.

[00010] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentar, suplemento dietético ou medicamento para o tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas, tratamento de supercrescimento de bactérias Gram-negativas ou tratamento de um desequilíbrio de bactérias Gram-negativas do intestino e/ou mucosa (em particular no trato gastrintestinal) em um mamífero.

[00011] Em ainda um outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentar, suplemento dietético ou medicamento para o tratamento de translocação de bactérias Gram-negativas em um mamífero.

[00012] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentar, suplemento dietético ou medicamento para reduzir a adesão

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4/48 elevada de bactérias Gram-negativas ou patogênicas na mucosa gastrintestinal de um mamífero.

[00013] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece o uso de uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para o tratamento da endotoxemia em um mamífero pela redução da elevada adesão de bactérias Gram-negativas ou patogênicas na mucosa gastrintestinal do dito mamífero.

[00014] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para reduzir a adesão elevada de bactérias contendo lipopolissacarídeo na mucosa gastrintestinal de um mamífero.

[00015] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para o tratamento da endotoxemia em um mamífero pela redução da elevada adesão de bactérias contendo lipopolissacarídeos à mucosa gastrintestinal do referido mamífero.

[00016] Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para regular a absorção de lipídeos em um mamífero.

[00017] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, um Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para o tratamento da endotoxemia em um mamífero pela regulação da absorção de lipídeos no dito mamífero.

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5/48 [00018] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para o tratamento de bacteremia em um mamífero.

[00019] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma combinação de:

(a) uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer dessas; e (b) um prebiótico;

na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para o tratamento da endotoxemia em um mamífero.

[00020] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso no tratamento de endotoxemia metabólica em um mamífero.

[00021] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada das espécies Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis, ou Bifidobacterium bifidium, ou uma mistura de quaisquer destas para uso no tratamento de endotoxemia em um mamífero.

[00022] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso na inibição da translocação bacteriana em um mamífero.

[00023] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas, tratando do supercrescimento de bactérias Gramnegativas ou tratamento de um desequilíbrio de bactérias Gram-negativas do

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6/48 intestino e/ou mucosa (particularmente no trato gastrintestinal) em um mamífero.

[00024] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso no tratamento de translocação de bactérias Gram-negativas em um mamífero.

[00025] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso na redução da adesão elevada de bactérias Gram-negativas ou patogênicas na mucosa gastrintestinal de um mamífero.

[00026] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso no tratamento de endotoxemia em um mamífero, pela redução da adesão elevada de bactérias Gram-negativas ou patogênicas na mucosa gastrintestinal do referido mamífero.

[00027] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso na redução da adesão elevada de bactérias contendo lipopolissacarídeos à mucosa gastrintestinal de um mamífero.

[00028] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada a partir de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso no tratamento de endotoxemia em um mamífero pela redução da adesão elevada de bactérias contendo lipopolissacarídeos à mucosa gastrintestinal do dito mamífero.

[00029] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso na regulação da absorção lipídica em um mamífero.

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7/48 [00030] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso no tratamento de endotoxemia em um mamífero pela regulação da absorção lipídica no referido mamífero.

[00031] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas para uso no tratamento de bacteremia em um mamífero.

[00032] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma combinação de:

(a) uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer dessas; e (b) um prebiótico;

para uso no tratamento de endotoxemia em um mamífero.

[00033] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de endotoxemia metabólica em um mamífero necessitado disso, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura destas.

[00034] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento da endotoxemia em um mamífero necessitado disso, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada das espécies Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis, ou Bifidobacterium bifidium, ou uma mistura de quaisquer destas.

[00035] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de inibição da translocação bacteriana em um mamífero necessitado disso, o método compreendendo administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

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8/48 [00036] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas, tratamento de supercrescimento de bactérias Gram-negativas ou tratamento de um desequilíbrio de bactérias Gram-negativas intestinais e/ou da mucosa (particularmente no trato gastrintestinal) em um mamífero necessitado disso, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

[00037] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de translocação de bactérias Gram-negativas em um mamífero necessitado disso, o método compreendendo a administração uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

[00038] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de redução da adesão elevada de bactérias Gram-negativas ou patogênicas à mucosa gastrintestinal em um mamífero necessitado disso, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

[00039] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento da endotoxemia em um mamífero necessitado disso pela redução da adesão elevada de bactérias Gram-negativas ou patogênicas na mucosa gastrintestinal do dito mamífero, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

[00040] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de redução da adesão elevada de bactérias contendo lipopolissacarídeos à mucosa gastrintestinal de um mamífero necessitado disso, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria

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9/48 selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

[00041] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento da endotoxemia em um mamífero necessitado disso pela redução da adesão elevada de bactérias contendo lipopolissacarídeos à mucosa gastrintestinal do referido mamífero, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

[00042] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de regulação absorção lipídica em um mamífero necessitado disso, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria do ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

[00043] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento da endotoxemia em um mamífero necessitado disso pela regulação da absorção lipídica no dito mamífero, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

[00044] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de bacteremia em um mamífero necessitado disso, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas.

Breve descrição das Figuras [00045] A figura 1 ilustra o nível de LPS plasmático (endotoxemia) em camundongos administrados com ração normal (NC), dieta rica em gordura (HFD), ou dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção, isto é, a cepa de Lactobacillus acidophilus NCFM (NCFM),

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10/48 cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis 420 (B420) ou uma combinação das duas (NCFM + B420);

[00046] A figura 2 ilustra o nível médio do tecido de bactérias da família Enterobacteriaceae (níveis acima do limite de detecção) em camundongos administrados com comida normal, dieta rica em gordura ou dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção (NCFM, B420 ou NCFM + B420);

[00047] A figura 3 ilustra o nível médio do tecido de bactérias do gênero Enterococcus (níveis acima do limite de detecção) em camundongos administrados com comida normal, dieta rica em gordura ou dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção (NCFM, B420 ou NCFM + B420);

[00048] A figura 4 ilustra o nível médio de tecido de bactérias do gênero Lactobacillus (níveis acima do limite de detecção) em camundongos administrados com comida normal, dieta rica em gordura ou dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção (NCFM, B420 ou NCFM + B420);

[00049] A figura 5 ilustra o nível médio de tecido de bactérias da classe Bacteroidetes (níveis acima do limite de detecção) em camundongos administrados com comida normal, dieta rica em gordura, dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção (NCFM, B420 ou NCFM + B420);

[00050] A figura 6 ilustra o nível médio do tecido de Bactéria do Domínio Total (níveis acima do limite de detecção) em camundongos administrados com comida normal, dieta rica em gordura ou dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção (NCFM, B420 ou NCFM + B420);

[00051] A figura 7 ilustra os níveis de E. coli na mucosa ou segmentos do lúmen de camundongos administrados com uma dieta rica em gordura e

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11/48 tratados com veículo ou uma dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção (B420);

[00052] A figura 8 ilustra o efeito sobre a adesão de Escherichia coli na mucosa do ceco de camundongos administrados com uma dieta rica em gordura e tratados com veículo ou uma dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção (B420), isoladamente ou em combinação com um prebiótico;

[00053] A figura 9 ilustra o efeito sobre a translocação de Escherichia coli nos tecidos hospedeiros de camundongos administrados com uma dieta rica em gordura e tratados com veículo ou uma dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção (B420), isoladamente ou em combinação com um prebiótico; e [00054] A figura 10 ilustra o efeito sobre os níveis de insulina em jejum e secreção de insulina no estado alimentado de camundongo administrados com uma dieta rica em gordura e tratados com ou uma dieta rica em gordura suplementada com bactérias de acordo com a presente invenção (B420), isoladamente ou em combinação com um prebiótico.

Descrição Detalhada da Invenção

Bactérias do ácido lático e Bifidobacteria [00055] As bactérias utilizadas nas modalidades da presente invenção são selecionadas de uma bactéria de ácido lático (LAB), uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destas. Neste relatório descritivo, o termo “bactéria de ácido lático” inclui qualquer bactéria capaz de produzir, como o principal produto final metabólico da fermentação de carboidratos, ácido lático ou pelo menos um de seus derivados (incluindo, mas sem se limitar, ao ácido acético ou ácido propiônico): o termo é, portanto, tencionado a incluir bactérias do ácido propiônico (PAB) que produzem ácido propiônico como um produto de fermentação de carboidratos.

[00056] As bactérias podem ser usadas em qualquer forma capaz de exercer os efeitos aqui descritos. Por exemplo, as bactérias podem ser viáveis,

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12/48 dormentes, inativadas ou mortas. De preferência, as bactérias são bactérias viáveis.

[00057] As bactérias podem compreender bactérias inteiras ou podem compreender componentes bacterianos. Exemplos de tais componentes incluem componentes da parede celular bacteriana, tais como peptidoglicano, ácidos nucleicos bacterianos como DNA e RNA, componentes da membrana bacteriana e componentes estruturais bacterianos, tais como proteínas, carboidratos, lipídeos e combinações destes, como lipoproteínas, glicolipídeos e glicoproteínas.

[00058] As bactérias também podem ou, alternativamente, compreender metabólitos bacterianos. Neste relatório descritivo, o termo “metabólitos bacterianos” inclui todas as moléculas produzidas ou modificadas pelas bactérias (probióticas) como resultado do metabolismo bacteriano durante o crescimento, sobrevivência, persistência, trânsito ou existência de bactérias durante a produção e armazenagem do produto probiótico e durante o trânsito gastrintestinal em um mamífero. Exemplos incluem todos os ácidos orgânicos, ácidos inorgânicos, bases, proteínas e peptídeos, enzimas e coenzimas, aminoácidos e ácidos nucleicos, carboidratos, lipídeos, glicoproteínas, lipoproteínas, glicolipídeos, vitaminas, todos os compostos bioativos, metabólitos contendo um componente inorgânico e todas as pequenas moléculas, por exemplo, moléculas com nitrogênio ou moléculas contendo um ácido sulfuroso.

[00059] De preferência as bactérias compreendem bactérias inteiras, mais preferivelmente bactérias viáveis inteiras.

[00060] De preferência a bactéria de ácido lático e/ou Bifidobacterium a ser usada na presente invenção é uma bactéria de ácido lático e/ou Bifidobacterium que é geralmente reconhecida como segura e a qual é de preferência aprovada GRAS.

[00061] Uma pessoa versada qualificada facilmente estará a par de espécies específicas e ou cepas de bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria

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13/48 dos gêneros descritos neste documento, que são utilizadas nas indústrias de alimentos e/ou agrícolas e que são geralmente consideradas adequadas para consumo humano e/ou animal.

[00062] De preferência, a bactéria de ácido lático e/ou Bifidobacterium utilizada de acordo com a presente invenção é uma que é adequada para consumo humano e/ou animal.

[00063] Na presente invenção, a bactéria utilizada pode ser do mesmo tipo (gênero, espécie e cepa) ou pode compreender uma mistura de gêneros, espécies e/ou cepas.

[00064] Bactérias do ácido lático adequadas podem ser selecionadas dos gêneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Carnobacterium, Enterococcus, Propionibacterium, Pediococcus e Streptococcus, e suas misturas. Tipicamente, as bactérias do ácido lático são selecionadas a partir das espécies Leuconostoc spp., Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus jensenii, e combinações de quaisquer destas.

[00065] Bifidobactérias adequadas são selecionadas a partir das espécies Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis, e Bifidobacterium angulatum, e combinações de quaisquer destas.

[00066] De preferência, as bactérias utilizadas na presente invenção são selecionadas dos gêneros Lactobacillus ou Bifidobacterium e suas misturas.

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Mais preferivelmente, as bactérias utilizadas na presente invenção são selecionadas das espécies Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium ou misturas destas. Uma combinação de bactérias das espécies Lactobacillus acidophilus e bactérias das espécies Bifidobacterium animalis é especialmente preferida.

[00067] Em uma modalidade particularmente preferida, as bactérias utilizadas na presente invenção são Lactobacillus acidophilus da cepa NCFM. Lactobacillus acidophilus NCFM são disponíveis comercialmente junto à Danisco A/S sob o nome HOWARU™ Dophilus.

[00068] Em uma modalidade particularmente preferida alternativa, as bactérias utilizadas na presente invenção são Bifidobacterium animalis subsp. lactis da cepa 420 (B420). Esta cepa é comercialmente disponível junto à Danisco A/S.

[00069] Em uma modalidade particularmente preferida alternativa, as bactérias utilizadas na presente invenção são Lactobacillus salivarius da cepa 33 (Ls-33). Esta espécie é comercialmente disponível junto à Danisco A/S.

[00070] Em uma modalidade, a bactéria utilizada na presente invenção é uma bactéria probiótica. Neste relatório descritivo, o termo “bactéria probiótica” é definido como abrangendo qualquer bactéria não patogênica que, quando administrada viva em quantidades adequadas, confere um benefício à saúde do hospedeiro. Essas cepas probióticas geralmente têm a capacidade de sobreviver à passagem através da parte superior do trato digestivo. Elas são não-patogênicas, não-tóxicas e exercem os seus efeitos benéficos sobre a saúde, de um lado, através de interações ecológicas com a flora residente no trato digestivo, e por outro lado, através de suas capacidades de influenciar o sistema imunológico de uma maneira positiva através do “GALT” (tecido linfoide associado ao intestino). Dependendo da definição de probióticos, essas bactérias, quando administradas em um número suficiente, têm a capacidade de progredir vivas através do intestino, porém elas não atravessam a barreira

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15/48 intestinal e seus efeitos primários são, portanto, induzidos no lúmen e/ou na parede do trato gastrintestinal. Elas, então, formam parte da flora residente durante o período de administração. Esta colonização (ou colonização transitória) permite que as bactérias probióticas exerçam um efeito benéfico, como a repressão de microrganismos potencialmente patogênicos presentes na flora e interações com o sistema imune do intestino.

[00071] Em modalidades preferidas, a bactéria utilizada na presente invenção é uma bactéria de ácido lático probiótica e/ou uma Bifidobacterium probiótica.

[00072] Em algumas modalidades preferidas, a Bifidobacterium é usada na presente invenção juntamente com uma bactéria do gênero Lactobacillus. Uma combinação de bactérias Bifidobacterium e Lactobacillus de acordo com a presente invenção apresenta um efeito sinérgico em certas aplicações (isto é, um efeito que é maior que o efeito aditivo das bactérias quando usadas separadamente). Por exemplo, as combinações que, além de ter efeito sobre o mamífero como componentes individuais, podem ter efeito benéfico sobre os outros componentes da combinação, por exemplo, através da produção de metabólitos que são então, por sua vez, utilizados como fonte de energia por outros componentes da combinação, ou manutenção das condições fisiológicas que favorecem os outros componentes.

[00073] Tipicamente, as bactérias Lactobacillus utilizadas na combinação são selecionadas a partir das espécies Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus jensenii, e quaisquer combinações das mesmas.

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16/48 [00074] Em modalidades preferidas, a bactéria Lactobacillus utilizada na presente invenção é um Lactobacillus probiótico.

[00075] De preferência, a bactéria Lactobacillus utilizada na presente invenção é da espécie Lactobacillus acidophilus.

[00076] Em uma modalidade particularmente preferida, as bactérias utilizadas na presente invenção compreendem uma combinação de Bifidobacterium animalis subsp. lactis cepa 420 (B420) e de Lactobacillus acidophilus cepa NCFM.

Dosagem [00077] A bactéria de ácido lático e/ou Bifidobacterium utilizada de acordo com a presente invenção (como uma cepa de Lactobacillus spp.; por exemplo, uma cepa de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius e/ou Lactobacillus plantarum, tal como uma cepa de Lactobacillus acidophilus ou Lactobacillus salivarius, por exemplo, Lactobacillus acidophilus cepa NCFM ou Lactobacillus salivarius cepa 33) e/ou uma cepa de Bifidobacterium spp., tal como uma cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, por exemplo, Bifidobacterium animalis subsp. lactis cepa 420 (B420)), pode compreender de 10⁶ a 10¹² UFC de bactérias/g de suporte, e mais particularmente de 10⁸ a 10¹² UFC de bactérias/g de suporte, de preferência de 10⁹ a 10¹² UFC/g para a forma liofilizada.

[00078] Adequadamente a bactéria de ácido lático e/ou Bifidobacterium utilizada de acordo com a presente invenção (como uma cepa de Lactobacillus spp.; por exemplo, uma cepa de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius e/ou Lactobacillus plantarum, tal como uma cepa de Lactobacillus acidophilus ou Lactobacillus salivarius, por exemplo, Lactobacillus acidophilus cepa NCFM ou Lactobacillus salivarius cepa 33) e/ou uma cepa de Bifidobacterium spp., tal como uma cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, por exemplo, Bifidobacterium animalis subsp. lactis cepa 420 (B420)), pode ser administrada em uma dosagem de cerca de 10⁶ a cerca de 10¹² UFC de microrganismos/dose, de preferência de cerca de 10⁸ até cerca de 10¹² UFC

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17/48 de microrganismos/dose. Pelo termo “por dose” se entende que esta quantidade de microrganismo é fornecida a um indivíduo por dia ou por ingestão, de preferência por dia. Por exemplo, se o microrganismo deve ser administrado em um produto alimentício (por exemplo, em um iogurte) - então o iogurte irá conter preferencialmente de cerca de 10⁸ a 10¹² CFU do microrganismo. Alternativamente, no entanto, esta quantidade de microrganismo pode ser dividida em administrações múltiplas, cada uma consistindo de uma menor quantidade de carga microbiana - contanto que a quantidade global de microrganismo recebida pelo indivíduo em qualquer momento específico (por exemplo, a cada período de 24 horas) seja de cerca de 10⁶ até cerca de 10¹² UFC de microrganismos, de preferência de 10⁸ até cerca de 10 UFC de microrganismos.

[00079] De acordo com a presente invenção, uma quantidade efetiva de pelo menos uma cepa de um microrganismo pode ser de pelo menos 10⁶ UFC de microrganismos/dose, de preferência de cerca de 10⁶ até cerca de 10¹² UFC de microrganismos/dose, de preferência de cerca de 10⁸ até 10¹² UFC de microrganismos/dose.

[00080] Em uma modalidade, de preferência a bactéria de ácido lático e/ou Bifidobacterium utilizada de acordo com a presente invenção (como uma cepa de Lactobacillus spp.; por exemplo, uma cepa de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius e/ou Lactobacillus plantarum e/ou uma cepa de Bifidobacterium spp., tal como uma cepa de Lactobacillus acidophilus ou Lactobacillus salivarius, por exemplo, Lactobacillus acidophilus cepa NCFM ou cepa de Lactobacillus salivarius cepa 33) tal como uma cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, por exemplo Bifidobacterium animalis subsp. lactis cepa 420 (B420)) pode ser administrada em uma dose de cerca de 10⁶ até cerca de 10¹² UFC de microrganismos/dia, de preferência de cerca de 10⁸ até cerca de 10¹² UFC de microrganismos/dia. Assim, a quantidade efetiva nesta modalidade pode ser de cerca de 10⁶ até cerca de 10¹² UFC de

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18/48 microrganismos/dia, de preferência de cerca de 10⁸ até cerca de 10¹² UFC de microrganismos/dia.

[00081] CFU significa “unidades formadoras de colônia”. Por “suporte” se entende o produto alimentício, suplemento dietético ou o suporte farmaceuticamente aceitável.

Indicações Médicas/Indivíduos [00082] As bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria as quais a presente invenção se refere são administradas a um mamífero incluindo, por exemplo, criações (incluindo gado, cavalos, porcos, galinhas e ovelhas) e seres humanos. Em alguns aspectos da presente invenção, o mamífero é um animal de companhia (incluindo animais de estimação), como um cão ou um gato, por exemplo. Em alguns aspectos da presente invenção, o indivíduo pode adequadamente ser um ser humano.

[00083] Os inventores surpreendentemente descobriram que as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria as quais a presente invenção se refere são capazes de reduzir os níveis de lipopolissacarídeos no plasma sanguíneo (LPS). Esta constatação confere o potencial para as bactérias serem úteis no tratamento da endotoxemia, em particular endotoxemia metabólica.

[00084] LPS é um importante componente da parede celular de bactérias gram-negativas, que ocorre no intestino como um componente da microbiota gram-negativa, mas também como LPS livre. A redução da endotoxemia metabólica pode resultar da redução da translocação de bactérias gramnegativas no hospedeiro, redução da absorção de LPS livre pelo hospedeiro ou depuração melhorada de LPS pelo hospedeiro.

[00085] Neste relatório descritivo, o termo “endotoxemia”, quando usado sozinho, significa a presença de um nível elevado de lipopolissacarídeos (também conhecidos como endotoxinas) no corpo (em particular, embora não exclusivamente, no plasma do sangue) em comparação aos níveis de lipopolissacarídeos basais. O termo “endotoxemia”, quando usado sozinho, se destina a abranger tanto a endotoxemia metabólica, definida em mais detalhes

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19/48 abaixo, e endotoxemia de outras etiologias, tal como endotoxemia causada por infecções patogênicas (especialmente infecções bacterianas) ou endotoxemia causada pelo supercrescimento de bactérias do intestino delgado (SIBO).

[00086] Em algumas modalidades, as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria a que a presente invenção se refere são usadas para tratar endotoxemia metabólica. Em um aspecto, o termo “endotoxemia metabólica” significa endotoxemia (como definido acima) induzida por uma dieta rica em gordura. O termo “dieta rica em gordura” é definido em mais detalhes abaixo.

[00087] Em um aspecto, o termo “endotoxemia metabólica” significa um aumento do nível de lipopolissacarídeos no corpo do mamífero (principalmente, embora não exclusivamente, no plasma sanguíneo) por um fator que varia de 1,5 a 20, de preferência de 2 a 10, como de 2 a 4, de preferência de 2 a 3,5, em comparação aos níveis de lipopolissacarídeos de mamífero basais (normais). O aumento nos níveis de lipopolissacarídeo é tipicamente medido pelo ensaio de Limulus amaebocyte, um teste bem conhecido pelas pessoas versadas na técnica.

[00088] Em contraste, no caso de endotoxemia causada por infecções patogênicas, tais como infecções bacterianas (endotoxemia do choque séptico), os níveis de LPS no corpo do mamífero, especialmente no corpo humano (particularmente, embora não exclusivamente, no sangue) são tipicamente elevados por um fator maior do que 20, tal como maior do que 30, de preferência maior do que 50, como maior do que 70, como maior do que 100, tal como maior do que 150, tal como maior do que 200 vezes em comparação com os níveis de lipopolissacarídeo de mamífero basais (normais).

[00089] Os níveis basais de lipopolissacarídeos em humanos estão tipicamente na faixa de 1 a 2 unidades de endotoxina (EU) por ml, conforme medido pelo ensaio de Limulus amaebocyte, um exemplo do qual é o ensaio do extrato de Limulus amaebocyte com o teste Kinetic-QCL (Bio Whittaker, Cambrex BioScience).

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20/48 [00090] Portanto, em um aspecto alternativo, o termo “endotoxemia metabólica” significa um nível de lipopolissacarídeos no corpo (particularmente, embora não exclusivamente, no plasma sanguíneo) de 1,5 a 40, de preferência de 2 a 20, como de 2 a 8, de preferência de 2 a 7 Unidades de Endotoxina (UE)/mL, conforme medido pelo ensaio do extrato de Limulus amaebocyte.

[00091] Em contraste, no caso de endotoxemia causada por infecções patogênicas, tais como infecções bacterianas (endotoxemia do choque séptico), os níveis de LPS no organismo de mamíferos, especialmente no corpo humano (particularmente, embora não exclusivamente, no sangue) são tipicamente maiores do que 40, tais como maiores do que 60, de preferência maiores do que 100, tais como maiores do que 140, tais como maiores do que 200, tais como maiores do que 300, tais como maiores do que 400 EU/mL conforme medido pelo ensaio do extrato de Limulus amaebocyte.

[00092] Os presentes inventores também surpreendentemente descobriram que as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria as quais a presente invenção se refere podem reduzir o nível de bactérias em tecidos metabolicamente muito importantes, no tecido adiposo mesentérico, tecido adiposo subcutâneo, gânglio mesentérico e gânglio subcutâneo, e o fígado e o baço. Isto confere o potencial para que as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria as quais a presente invenção se refere sejam utilizadas para prevenir ou tratar a translocação bacteriana em tecidos e prevenir ou tratar endotoxemia metabólica.

[00093] Em modalidades particularmente preferidas, as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria as quais a presente invenção se refere podem ser usadas para reduzir os níveis de bactérias da família Enterobacteriaceae no tecido adiposo mesentérico e a classe Bacteriodetes no tecido hepático. Estes dois principais grupos de bactérias contêm LPS como um componente da parede celular bacteriana e, portanto, atuam como fonte potencial de LPS plasmática elevada, que é associada com endotoxemia metabólica. Estes tecidos desempenham um papel particularmente importante na endotoxemia

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21/48 metabólica e outras doenças metabólicas, uma vez que LPS causa a inflamação nestes tecidos, potencialmente levando a uma cascata de eventos adversos, incluindo o metabolismo de glicose prejudicado e sensibilidade reduzida à insulina.

[00094] Os presentes inventores também descobriram surpreendentemente que as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria as quais a presente invenção se refere são capazes de regular a absorção de lipídeos. Sem desejar se ater à teoria, acredita-se que, como LPS são transportados principalmente em lipídeos, a regulação da absorção de lipídeos reduz a quantidade de bactérias e, portanto, a quantidade de LPS que passa pela barreira intestinal. Isto confere o potencial para as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria a que a presente invenção se refere para serem usadas para evitar a passagem de LPS para dentro dos tecidos e, portanto, evitar ou tratar a endotoxemia metabólica.

[00095] Além disso, os presentes inventores descobriram surpreendentemente que as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria as quais a presente invenção se refere são capazes de reduzir a elevada adesão de bactérias gram-negativas no trato gastrintestinal. Sem desejar se ater à teoria, acredita-se que a redução da adesão de bactérias gram-negativas reduz a quantidade de bactérias e, portanto, a quantidade de LPS que passa pela barreira intestinal. Isto confere o potencial para as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria a que a presente invenção se refere de serem usadas para prevenir a passagem de LPS nos tecidos e, portanto, de prevenir ou tratar endotoxemia metabólica.

[00096] As bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria as quais a presente invenção se refere são adequadas para a administração a mamíferos tanto diabéticos quanto obesos. Elas também poderiam ser adequadas para mamíferos diabéticos e não-obesos, bem como para os mamíferos obesos que possuam os fatores de risco para diabetes, mas que ainda não estão em um estado diabético. Este aspecto é discutido em mais detalhes abaixo.

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22/48 [00097] Em modalidades preferidas, a condição a ser tratada ou evitada é induzida pela dieta e/ou associada com a dieta. Os presentes inventores surpreendentemente descobriram que as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção para tratar uma série de condições induzidas pela dieta ou associadas com a dieta, como descrito em mais detalhes neste.

[00098] Em particular, o uso de bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria de acordo com a presente invenção é adequado para o tratamento de mamíferos que ingerem uma dieta rica em gordura. Este aspecto é discutido em mais detalhes abaixo.

[00099] As composições são adequadas para o uso em pacientes obesos e diabéticos. Neste relatório descritivo, o termo “diabetes” inclui todas as formas de diabetes que, como observado acima, são caracterizadas por metabolismo desordenado e níveis de açúcar no sangue anormalmente elevados (hiperglicemia) resultantes de níveis insuficientes do hormônio insulina. O termo inclui, portanto, diabetes do tipo 1, diabetes tipo 2, diabetes gestacional e tolerância à glicose prejudicada. Diabetes tipo 1 é caracterizada pela perda das células beta produtoras de insulina das ilhotas de Langerhans no pâncreas, levando a uma deficiência de insulina. Diabetes mellitus tipo 2 é caracterizada pela resistência à insulina ou sensibilidade à insulina reduzida combinado com a secreção de insulina reduzida. Diabetes gestacional é formalmente definida como “qualquer grau de intolerância à glicose com início ou primeiro reconhecimento durante a gravidez”. Tolerância à Glicose Prejudicada (IGT) é um estado pré-diabético de disglicemia que está associado à resistência à insulina e aumento do risco de patologia cardiovascular. De acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde e a Associação Americana de Diabetes, a intolerância à glicose prejudicada é definida como níveis de glicose de duas horas de 140 a 199 mg por dL (7,8 a 11,0 mmol) no teste de tolerância à glicose oral de 75 g. Um paciente é considerado como estando sob a condição de IGT quando ele/ela tem um nível de glicose

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23/48 intermediariamente elevado após 2 horas, porém menor do que poderia ser qualificado para a diabetes mellitus tipo 2. A glicemia de jejum pode ser normal ou levemente elevada. IGT pode preceder o diabetes mellitus tipo 2 por muitos anos. IGT é também um fator de risco para a mortalidade.

[000100] Neste relatório descritivo, o termo obesidade está ligado ao índice de massa corporal (IMC). O índice de massa corporal (IMC) (calculado como o peso em quilogramas dividido pelo quadrado da altura em metros) é a medida mais comumente aceita para o sobrepeso e/ou obesidade. Um IMC superior a 25 é considerado sobrepeso. A obesidade é definida como um IMC de 30 ou mais, com um IMC de 35 ou mais considerado como obesidade de comorbidade séria e um IMC de 40 ou mais considerado obesidade mórbida.

[000101] Como observado acima, o termo “obesidade”, tal como aqui utilizado, inclui obesidade, obesidade de comorbidade e obesidade mórbida. Portanto, o termo “obeso”, tal como usado aqui, pode ser definido como um indivíduo tendo um IMC de mais de ou igual a 30. Em algumas modalidades, adequadamente um indivíduo obeso pode ter um IMC maior que ou igual a 30, adequadamente 35, adequadamente 40.

[000102] Embora a composição da invenção seja particularmente adequada para uso em pacientes que são tanto diabéticos quanto obesos, a composição também é adequada para as pessoas que são diabéticas, porém não obesas. Isto também pode ser adequado para uso em pacientes obesos que possuem os fatores de risco para diabetes, mas que ainda não estão em um estado diabético, uma vez que poderia ser esperado que uma pessoa obesa (mas não diabética), poderia limitar as consequências metabólicas da sua obesidade, isto é, o diabetes ou pelo menos o desenvolvimento de resistência à insulina.

[000103] Neste relatório descritivo, os termos “tratamento” ou “tratando” se referem a qualquer administração das bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria de acordo com a presente invenção e incluem: (1) prevenção da ocorrência da doença especificada em um animal que pode ser predisposto à

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24/48 doença, mas que ainda não tenha sofrido ou apresentado a patologia ou sintomatologia da doença (incluindo a prevenção de um ou mais fatores de risco associados à doença); (2) inibição da doença em um animal que está sofrendo ou apresentando a patologia ou sintomatologia do doente (isto é, interrompendo o desenvolvimento adicional da patologia e/ou sintomatologia), ou (3) melhoria da doença em um animal que está sofrendo ou apresentando a patologia ou sintomatologia do doente (isto é, revertendo a patologia e/ou sintomatologia).

Dieta [000104] Conforme observado acima, mamíferos diabéticos e/ou obesos tratados com bactérias de acordo com a presente invenção podem continuar a ingerir uma dieta rica em gordura enquanto mitigam as consequências metabólicas da(s) sua(s) condição/condições. Neste relatório descritivo, o termo “dieta rica em gordura” significa uma dieta em geral contendo pelo menos 20%, de preferência pelo menos 25%, como pelo menos 30%, por exemplo, pelo menos 35%, como pelo menos 40%, por exemplo pelo menos 45%, como pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 55%, como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos 65%, como pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 75%, como pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, como pelo menos 90% de calorias provenientes de gordura.

[000105] Em algumas modalidades, indivíduos diabéticos e/ou obesos tratados com bactérias de acordo com a presente invenção podem ingerir uma dieta rica em carboidratos enquanto mitigam as consequências metabólicas de sua(s) condição/condições. Neste relatório descritivo, o termo “dieta rica em carboidratos” significa uma dieta em geral contendo pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 55%, como pelo menos 60%, por exemplo, de pelo menos 65%, como pelo menos 70%, por exemplo pelo menos, 75%, como pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, como pelo menos 90% de calorias provenientes de carboidratos.

Composições

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25/48 [000106] Embora seja possível administrar bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria sozinhas de acordo com a presente invenção, as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria são típica e preferivelmente administradas em ou dentro de um suporte como parte de um produto, em particular como um componente de um produto alimentício, um suplemento dietético ou uma formulação farmacêutica. Esses produtos tipicamente contêm componentes adicionais bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.

[000107] Qualquer produto que possa se beneficiar da composição pode ser usado na presente invenção. Estes incluem, mas não estão limitados a, alimentos, particularmente conservas de frutas e alimentos lácteos e produto derivados de alimentos lácteos, e produtos farmacêuticos. As bactérias do ácido lático podem ser aqui referidas como “a composição da presente invenção” ou “a composição”.

Alimento [000108] Em uma modalidade, as bactérias do ácido lático e/ou Bifidobacteria são utilizadas de acordo com a invenção em um produto alimentício, como em um suplemento alimentício, uma bebida ou um pó à base de leite. Aqui, o termo “alimento” é usado em um sentido amplo - e engloba alimentos para seres humanos, bem como alimentos para animais (isto é, uma ração). Em um aspecto preferido, o alimento é para o consumo humano.

[000109] O alimento pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

[000110] Quando usado como, ou na preparação de um alimento, como um alimento funcional, a composição da presente invenção pode ser usada em conjunto com um ou mais dentre: um veículo nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente ativo.

[000111] A título de exemplo, a composição da presente invenção pode ser usada como um ingrediente para refrigerantes, um suco de fruta ou uma

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26/48 bebida compreendendo proteína do soro de leite, chás saudáveis, bebidas de cacau, bebidas lácteas e bebidas de bactérias do ácido lático, iogurte e iogurte para beber, queijo, sorvete, sorvetes com gelo (‘water ices') e sobremesas, produtos de confeitaria, biscoitos, bolos e misturas para bolos, lanches, alimentos balanceados e bebidas, recheios de frutas, glacês de proteção, recheios de panificação de chocolate, recheio flavorizado para bolo de queijo, recheios para bolos flavorizados de frutas, glacê de bolos e rosquinhas de massa frita, cremes de recheio de panificação instantâneos, recheios para cookies, recheios de panificação de uso instantâneo, recheios de calorias reduzidas, bebidas nutricionais de adultos, bebidas de soja/suco acidificadas, bebidas de chocolate assépticas/purificadas em retorta, misturas de bar, bebidas em pó, leite de soja/puro e achocolatado fortificado com cálcio, bebida de café fortificada com cálcio.

[000112] A composição pode ainda ser utilizada como ingrediente em produtos alimentícios, tais como molho de queijo americano, agente antiaglomerante para o queijo ralado e cortado em pedaços, imersões de pedaços, cream cheese, creme fermentado isento de gordura de glacê de creme misturado a seco, creme batido estável congelado/descongelado, queijo cheddar natural light e com baixo teor de gordura, iogurte tipo suíço com baixo teor de gordura, sobremesas geladas aeradas, sorvetes de embalagem dura, sorvete de rótulo favorável, sorvete de embalagem dura com economia e prazer melhorados, sorvete com baixo teor de gordura: porções leves, molho barbecue, molho de imersão de queijo, tempero de queijo cottage, molho de mistura Alfredo seco, molho de mistura de queijos, molho de mistura de tomate seco e outros.

[000113] O termo “produtos lácteos”, tal como aqui utilizado, significa incluir um meio compreendendo leite de origem animal e/ou vegetal. Como leite de origem animal, pode-se mencionar leite de vaca, de ovelha, de cabra ou de búfala. Como leite de origem vegetal, pode-se mencionar qualquer substância

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27/48 fermentável de origem vegetal que pode ser usada de acordo com a invenção, em particular, proveniente de soja, arroz ou cereais.

[000114] Ainda mais preferivelmente, o produto alimentício empregado de acordo com a invenção é um leite fermentado ou leite humanizado.

[000115] Para certos aspectos, de preferência a presente invenção pode ser usada juntamente com a produção de iogurte, tal como iogurte fermentado para beber, iogurte, iogurte para beber, queijo, creme fermentado, sobremesas à base de leite e outros.

[000116] Adequadamente, a composição pode ainda ser utilizada como um ingrediente em uma ou mais aplicações de queijo, aplicações de carne ou aplicações compreendendo culturas protetoras.

[000117] A presente invenção também fornece um método de preparação de um alimento ou ingrediente alimentício, o método compreendendo a mistura da composição de acordo com a presente invenção com outro ingrediente alimentício.

[000118] Vantajosamente, a presente invenção refere-se aos produtos que foram colocados em contato com a composição da presente invenção (e, opcionalmente, com outros componentes/ingredientes), em que a composição é usada em uma quantidade para ser capaz de melhorar a nutrição e/ou os benefícios à saúde do produto.

[000119] Como usado aqui, o termo “contatado” se refere à aplicação direta ou indireta da composição da presente invenção ao produto. Exemplos de métodos de aplicação que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, tratamento do produto em um material que compreende a composição, aplicação direta pela mistura da composição com o produto, pulverização da composição sobre a superfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição.

[000120] Onde o produto da invenção é um gênero alimentício, a composição da presente invenção é de preferência misturada com o produto. Alternativamente, a composição pode ser incluída na emulsão ou ingredientes

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28/48 brutos de um gênero alimentício. Em uma alternativa adicional, a composição pode ser aplicada como um tempero, camada fina, mistura corante e similares.

[000121] Para algumas aplicações, é importante que a composição seja disponibilizada em ou para a superfície de um produto a ser afetado/tratado. Isto permite que a composição confira uma ou mais das seguintes características favoráveis: nutrição e/ou benefícios para a saúde.

[000122] As composições da presente invenção podem ser aplicadas aos interstícios, cobertura e/ou impregnar um produto com uma quantidade controlada de um microrganismo viável.

[000123] De preferência, a composição é utilizada para fermentar o leite ou leite fortificado com sacarose ou meio lático com sacarose e/ou maltose, onde os meios resultantes contendo todos os componentes da composição isto é, o referido microrganismo de acordo com a presente invenção - podem ser adicionados como um ingrediente para o leite de iogurte em concentrações adequadas - como, por exemplo, em concentrações no produto final que oferecem uma dose diária de 10⁶ a 10¹⁰ ufc. O microrganismo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado antes ou depois da fermentação do iogurte.

[000124] Para alguns aspectos, os microrganismos de acordo com a presente invenção são usados como, ou na preparação de rações para animais, tais como rações para o gado, em particular ração para aves (como frango), ou alimentos para animais domésticos.

[000125] Vantajosamente, onde o produto é um produto alimentício, a bactéria de ácido lático deve permanecer eficaz até a data normal de “vendido em” ou “expiração”, durante o que o produto alimentício é oferecido para venda pelo varejista. De preferência, o tempo efetivo deve se estender até após tais datas, até o final do período de frescura normal quando a deterioração dos alimentos se torna aparente. As durações de tempo desejadas e o tempo de prateleira normal variam de gênero alimentício para gênero alimentício e as pessoas versadas na técnica irão reconhecer que tempos de vida de prateleira

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29/48 variam de acordo com o tipo de gênero alimentício, o tamanho do gênero alimentício, as temperaturas de armazenamento, condições de processamento, materiais de embalagem e equipamentos de embalagem.

Ingrediente Alimentício [000126] A composição da presente invenção pode ser usada como um ingrediente alimentício e/ou ingrediente de ração.

[000127] Como usado aqui, o termo “ingrediente alimentício” ou “ingrediente de ração” inclui uma formulação que é ou pode ser adicionada aos alimentos ou gêneros alimentícios funcionais como suplemento nutricional.

[000128] O ingrediente pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

Suplementos Alimentícios [000129] A composição da presente invenção pode ser - ou pode ser adicionada a - suplementos alimentício (também referidos aqui como suplementos de dieta).

Alimentos Funcionais [000130] A composição da presente invenção pode ser - ou pode ser adicionada - aos alimentos funcionais.

[000131] Como usado aqui, o termo “alimento funcional” significa alimento que é capaz de proporcionar não só um efeito nutricional, mas também que é capaz de proporcionar um efeito benéfico adicional ao consumidor.

[000132] Deste modo, os alimentos funcionais são alimentos comuns que têm componentes ou ingredientes (tais como aqueles aqui descritos) incorporados neles que conferem ao alimento uma funcionalidade específica por exemplo, um benefício médico ou fisiológico - além do efeito puramente nutricional.

[000133] Embora não exista uma definição legal de um alimento funcional, a maioria das partes com interesse nesta área concorda que eles

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30/48 são os alimentos comercializados como tendo efeitos para a saúde específicos além dos efeitos nutricionais básicos.

[000134] Alguns alimentos funcionais são nutracêuticos. Aqui, o termo “nutracêutico” significa um alimento que é capaz de fornecer não apenas um efeito nutricional e/ou uma satisfação do paladar, mas também que é capaz de proporcionar um efeito terapêutico (ou outro benefício) para o consumidor. Nutracêuticos atravessam as linhas de divisão tradicionais entre alimentos e medicamentos.

Medicamento [000135] O termo “medicamento”, como aqui utilizado, engloba medicamentos para uso tanto humano quanto animal na medicina humana e veterinária. Além disso, o termo “medicamento”, tal como aqui utilizado, significa qualquer substância que proporciona um efeito terapêutico e/ou benéfico. O termo “medicamento”, tal como aqui utilizado, não é necessariamente limitado às substâncias que necessitam de aprovação de venda, mas pode incluir substâncias que podem ser usadas em cosméticos, nutracêuticos, alimentos (incluindo rações e bebidas, por exemplo), culturas probióticas e remédios naturais. Além disso, o termo “medicamento”, tal como aqui utilizado, engloba um produto projetado para a incorporação na ração animal, por exemplo, ração de gado e/ou alimentos para animais de estimação.

Produto Farmacêutico [000136] A composição da presente invenção pode ser usada como - ou na preparação de - um produto farmacêutico. Aqui, o termo “produto farmacêutico” é usado em sentido amplo - e abrange produtos farmacêuticos para os seres humanos, bem como produtos farmacêuticos para animais (isto é, aplicações veterinárias). Em um aspecto preferido, o produto farmacêutico é para uso humano e/ou para a criação de gado.

[000137] O produto farmacêutico pode ser para fins terapêuticos - que pode de natureza curativa ou paliativa ou preventiva. O produto farmacêutico pode até mesmo ser para fins de diagnóstico.

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31/48 [000138] Um suporte farmaceuticamente aceitável pode ser, por exemplo, um suporte na forma de pastilhas de comprimidos, comprimidos, cápsulas, unguentos, supositórios ou soluções para beber. Outras formas adequadas são fornecidas abaixo.

[000139] Quando usado como - ou na preparação de - um produto farmacêutico, a composição da presente invenção pode ser usada juntamente com um ou mais dentre: um veículo farmaceuticamente aceitável, um diluente farmaceuticamente aceitável, um excipiente farmaceuticamente aceitável, um adjuvante farmaceuticamente aceitável e um ingrediente farmaceuticamente ativo.

[000140] O produto farmacêutico pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

[000141] A bactéria de ácido lático e/ou Bifidobacteria as quais a presente invenção se refere podem ser usadas como ingredientes farmacêuticos. Aqui, a composição pode ser o único componente ativo ou pode ser pelo menos uma de uma variedade (isto é, 2 ou mais) dos componentes ativos.

[000142] O ingrediente farmacêutico pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

[000143] A bactéria do ácido lático e/ou Bifidobacteria a que a presente invenção se refere pode ser usada em qualquer forma adequada - seja sozinha ou quando presente em uma combinação com outros componentes ou ingredientes. A bactéria de ácido lático e/ou Bifidobacteria a que a presente invenção se refere podem ser aqui referidas como “a composição”. Da mesma forma, combinações compreendendo a composição da presente invenção e outros componentes e/ou ingredientes (isto é, ingredientes - como ingredientes alimentícios, ingredientes para alimentos funcionais ou ingredientes farmacêuticos) podem ser usadas em qualquer forma adequada.

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32/48 [000144] A bactéria do ácido lático e/ou Bifidobacteria a que a presente invenção se refere pode ser usada na forma de preparações sólidas ou líquidas ou alternativas dos mesmos. Exemplos de preparações sólidas incluem, mas não estão limitadas a, comprimidos, cápsulas, pós, grânulos e pós que podem ser molháveis, atomizados ou liofilizados. Exemplos de preparações líquidas incluem, mas não estão limitadas, às soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou orgânicas aquosas.

[000145] Exemplos de formas adequadas incluem um ou mais dentre: comprimidos, pílulas, cápsulas, óvulos, soluções ou suspensões, que podem conter agentes flavorizantes ou corantes, para aplicações de liberação imediata, retardada, modificada, sustentada, pulsada ou controlada.

[000146] A título de exemplo, se a composição da presente invenção for utilizada em uma forma de comprimido - como para uso como um ingrediente funcional - os comprimidos também podem conter uma ou mais dentre: excipientes, tais como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina; desintegrantes como amido (de preferência amido de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido sódico, croscarmelose sódica e alguns silicatos complexos; aglutinantes de granulação, como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia; agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco podem ser incluídos.

[000147] Exemplos de veículos nutricionalmente aceitáveis para uso na preparação das formas incluem, por exemplo, água, soluções salinas, álcool, silicone, ceras, geleia de petróleo, óleos vegetais, polietilenoglicóis, propilenoglicol, lipossomas, açúcares, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, tensoativos, ácido silícico, parafina viscosa, óleo de perfume, monoglicerídeos e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos tipo petroethral, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares.

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33/48 [000148] Excipientes preferidos para as formas incluem lactose, amido, celulose, lactose ou polietilenoglicóis de alto peso molecular.

[000149] Para suspensões aquosas e/ou elixires, a composição da presente invenção pode ser combinada com vários agentes edulcorantes ou flavorizantes, substâncias corantes ou tinturas, com agentes emulsificantes e/ou de suspensão e com diluentes tais como água, propilenoglicol e glicerina, e combinações dos mesmos.

[000150] As formas podem também incluir cápsulas de gelatina; cápsulas de fibra, comprimidos de fibra, etc., ou mesmo bebidas de fibra.

[000151] Outros exemplos de formas incluem cremes. Para alguns aspectos o microrganismo utilizado na presente invenção pode ser usado em cremes farmacêuticos e/ou cosméticos, como cremes de proteção solar e/ou cremes pós-sol, por exemplo.

[000152] Em um aspecto, a composição de acordo com a presente invenção pode ser administrada em um aerossol, por exemplo, por meio de um spray nasal, por exemplo, para a administração ao trato respiratório.

Prebióticos [000153] A composição da presente invenção pode adicionalmente conter um ou mais prebióticos. Prebióticos são uma categoria de alimentos funcionais definidos como ingredientes alimentícios não digeríveis que afetam beneficamente o hospedeiro pela estimulação seletiva do crescimento e/ou atividade de uma ou um número limitado de bactérias (particularmente, embora não exclusivamente, os probióticos, Bifidobacteria e/ou bactérias do ácido lático) no cólon e, assim, melhoraram a saúde do hospedeiro. Tipicamente, os prebióticos são carboidratos (como oligossacarídeos), mas a definição não exclui os não carboidratos. As formas mais prevalentes de prebióticos são nutricionalmente classificadas como fibra solúvel. Em certa medida, muitas formas de fibras alimentares apresentam algum grau de efeito prebiótico.

[000154] Em uma modalidade, um prebiótico é um ingrediente seletivamente fermentado que permite mudanças específicas, tanto na

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34/48 composição e/ou na atividade na microflora gastrintestinal que confere benefícios ao bem-estar e à saúde do hospedeiro.

[000155] Adequadamente, o prebiótico pode ser usado de acordo com a presente invenção em uma quantidade de 0,01 a 100 g/dia, de preferência de 0,1 a 50 g/dia, mais preferivelmente de 0,5 a 20 g/dia. Em uma modalidade, o prebiótico pode ser usado de acordo com a presente invenção em uma quantidade de 1 a 100 g/dia, de preferência de 2 a 9 g/dia, mais preferivelmente de 3 a 8 g/dia. Em outra modalidade, o prebiótico pode ser usado de acordo com a invenção presente em uma quantidade de 5 a 50 g/dia, de preferência, de 10 a 25 g/dia.

[000156] Exemplos de fontes de dieta de prebióticos incluem soja, fontes de inulina (como alcachofra de Jerusalém, jicama e raiz de chicória), aveia natural, trigo não refinado, cevada não refinada e yacon.

[000157] Exemplos de prebióticos adequados incluem alginato, xantana, pectina, goma de alfarroba (LBG), inulina, goma guar, galactoligossacarídeo (GOS), frutoligossacarídeos (FOS), polidextrose (isto é, Litesse®), lactitol, lactossacarose, oligossacarídeos da soja, isomaltulose (Palatinose™), isomaltoligossacarídeos, glicoligossacarídeos, xiloligossacarídeos, manoligossacarídeos, beta-glicanas, celobiose, rafinose, gentiobiose, melibiose, xilobiose, ciclodextrinas, isomaltose, trealose, estaquiose, panose, pululano, verbascose, galactomananos e todas as formas de amidos resistentes. Um exemplo particularmente preferido de um prebiótico é a polidextrose.

[000158] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma combinação de:

(a) uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer destes; e (b) um prebiótico;

na fabricação de um produto alimentício, um suplemento alimentício ou medicamento para reduzir os níveis de insulina em jejum em um mamífero.

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35/48 [000159] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de uma combinação de:

(a) uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer desses; e (b) um prebiótico;

na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para aumentar a secreção de insulina no estado alimentado em um mamífero.

[000160] É previsto dentro do escopo da presente invenção que as modalidades da invenção podem ser combinadas de tal forma que as combinações de quaisquer das características descritas neste documento estão incluídas no escopo da presente invenção. Em particular, é previsto dentro do escopo da presente invenção que qualquer um dos efeitos terapêuticos das bactérias pode ser exibido concomitantemente.

Exemplos

Exemplo 1

Materiais e Métodos

Modelo animal e tratamento probiótico [000161] Um grupo de cinquenta camundongos machos de 10 semanas de idade C57BL foram alimentados com uma ração normal (NC) (A03, SAFE, Augy, França), ou uma dieta rica em gordura (HFD) (compreendendo 72% de gordura (óleo de milho e lardo) 28% de proteína e < 1% de carboidratos) (SAFE, Augy, França), durante 4 semanas. Esta dieta tem a vantagem peculiar de induzir diabetes antes do início da obesidade (ver, por exemplo, Cani et al 2008 “Role of gut microflora in the development of obesity and insulin resistance following high-fat diet feeding”. Pathol Biol (Paris); Cani et al, Diabetes, 2008, 57, 1470-81; Knauf et al. Endocrinology 2008, 149, 4768-77; Cani et al., Diabetologia 2007, 50, 2374-83; Cani et al. Diabetes 2007, 56, 1761 -1772 e Turini et al. Swiss Med Wkly 2007, 137, 700-4).

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36/48 [000162] Após a alimentação com dieta rica em gordura (antes da alimentação com probiótico), os camundongos foram submetidos a um teste de tolerância à glicose intraperitoneal. A área sob a curva foi calculada e os camundongos foram mortos homogeneamente de acordo com os diferentes grupos experimentais ou dez camundongos por grupo (10 camundongos por grupo). Os dados mostraram que todos os camundongos estavam em estado diabético antes da alimentação com probiótico. Os camundongos foram alimentados durante mais quatro semanas com uma ração normal (n = 10) ou HFD (n = 40). Os camundongos HFD foram tratados diariamente durante 4 semanas com uma das seguintes opções:

1. Tratado com veículo

2. Bifidobacterium animalis subsp. lactis cepa 420 (B420) (10⁹/bactérias por camundongo)

3. Lactobacillus acidophilus NCFM (NCFM) (10⁹/bactérias por camundongo),

4. NCFM + B420 (5 x 10⁸ + 5 x 10⁸ NCFM por camundongo).

[000163] Os camundongos foram alojados em um ambiente controlado (ciclo de luz natural de 12 h invertido, luz desligada às 10:00 da manhã).

Endotoxemia e CD14 de plasma [000164] Amostras de sangue foram coletadas dos camundongos no final dos tratamentos com probiótico ou controle. O ensaio de endotoxina com base em um extrato de Limulus amaebocyte com o teste Kinetic QCL (Bio Whittaker, Cambrex BioScience) foi utilizado para a quantificação de LPS no plasma (endotoxemia) - este é um ensaio quantitativo cinético para a detecção da endotoxina de bactérias Gram-negativas. Os soros são diluídos 1/20 até 1/100 e aquecidos durante ciclos de 10 min a 70 °C. O limite menor de detecção de LPS foi de 0,001 unidade de endotoxina/mL. Plasma sCD14, o receptor de LPS, foi medido utilizando um método imunoenzimático (IBL, GmbH, Hamburgo, Alemanha).

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37/48 [000165] Quantificação de DNA microbiano nos tecidos de camundongos [000166] Após o sacrifício, os seguintes tecidos de camundongo foram coletados assepticamente: tecido adiposo mesentérico, tecido adiposo subcutâneo e fígado. Os tecidos foram congelados rapidamente e mantidos congelados até a análise. Antes da extração do DNA, os tecidos foram homogeneizados usando um aparelho automático Precellys 24 para lisar células de amostras biológicas (Bertin Technologies, Tarnos, França). As amostras foram pesadas e diluídas com 1,4 mL de tampão de ASL (Qiagen, Hilden, Alemanha) em tubos CK14 contendo pérolas de cerâmica (Bertin). As amostras foram moídas com pérolas durante 3 x 30 segundos a 6800 rpm e mantidas em gelo entre as corridas. O sobrenadante foi coletado e transferido para tubos VK01 contendo vidro em pó (Bertin) e o processo de moagem foi repetido. O sobrenadante foi novamente coletado e transferido para tubos de Eppendorf de 2 mL. O DNA bacteriano foi isolado e purificado utilizando o mini kit QIAmp DNA Stool (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

[000167] DNA bacteriano foi medido pelo PCR em tempo real quantitativo usando os iniciadores específicos do grupo ou gênero. Os grupos bacterianos alvos (e os iniciadores e as condições utilizadas) foram: Bactérias de domínio total (não publicado), da família Enterobacteriaceae, (Matsuda et al. App. Env. Microbiol., 2007, 73, 32-39), gênero Bifidobacterium (Makivuokko et al. Nutrition and Cancer 2005, 52(1), 93-103), gênero Lactobacillus (Walter et al. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 2578-2585, Heilig et al Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68, 114-123), classe Bacteroidetes e gênero Enterococcus (Rinttila et al. J. Appl. Microbiol., 2004, 97, 1166-1177). O equipamento utilizado para a análise de PCR quantitativa foi o sistema de PCR em tempo real Applied Biosystems 7500 Fast ou o Sistema de Detecção de Sequências ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA). Os resultados foram expressos como log de células por grama de tecido acima do limite de detecção de cada grupo de bactérias em cada tecido. Os limites de

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38/48 detecção foram determinados separadamente para cada grupo de bactérias em cada tipo de tecido.

Resultados

Endotoxemia e CD14 plasmático [000168] Dieta rica em gordura (HFD) foi associada com um aumento médio de 2 a 3 vezes em comparação com a endotoxemia basal (nível basal de LPS plasmático) dos camundongos alimentados com ração normal (NC) (Figura 1). Este aumento no LPS plasmático associado com uma dieta rica em gordura é definido como endotoxemia metabólica.

[000169] Todos os tratamentos probióticos foram capazes de reduzir a endotoxemia metabólica significativamente nos camundongos e reverter os efeitos adversos da dieta rica em gorduras. O nível médio de sCD14 plasmático, o principal receptor de LPS, dos camundongos tratados com probióticos e dieta rica em gordura foi mais de quatro vezes menor do que o de camundongos que receberam apenas dieta rica em gorduras.

[000170] Tomados em conjunto, os resultados demonstram que o tratamento probiótico reduz a endotoxemia metabólica e, além disso, reduz os receptores circulantes de LPS, que também são elevados com dieta rica em gorduras. LPS é um componente importante da parede celular de bactérias Gram-negativas, que ocorrem no intestino como um componente da microbiota Gram-negativa, mas também como LPS livre. A redução de endotoxemia metabólica pode resultar da redução da translocação de bactérias gramnegativas para dentro do hospedeiro, redução da absorção de LPS livre pelo hospedeiro ou depuração aumentada de LPS pelo hospedeiro. Probióticos podem, portanto, ser usados como um método inovador para a prevenção de tratamento da endotoxemia metabólica.

Redução de translocação bacteriana nos tecidos [000171] Dieta rica em gordura foi associada a níveis elevados de DNA bacteriano nos tecidos, em comparação com ração normal. O impacto foi particularmente evidente no tecido adiposo mesentérico, onde os níveis

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39/48 elevados da família Enterobacteriaceae (Figura 2), gênero Enterococcus (Figura 3), gênero Lactobacillus (Figura 4) e Bactérias de Domínio total (Figura 6) foram associados com dieta rica em gordura. No tecido adiposo subcutâneo, níveis elevados da classe Bacteroidetes foram detectados em camundongos alimentados com dieta rica em gordura (Figura 5). O gênero Bifidobacterium não foi detectado em quantidades significativas em qualquer um dos tecidos.

[000172] O tratamento probiótico reduziu significativamente os níveis de DNA bacteriano nos tecidos. No tecido adiposo mesentérico, o tratamento de B420 reduziu significativamente o nível da família Enterobacteriaceae (Figura 2), e o tratamento de NCFM mostrou uma tendência para redução dos níveis da família Enterobacteriaceae (Figura 2) e o gênero Lactobacillus (Figura 4). No fígado, a combinação de NCFM e B420 tendeu a reduzir o nível do gênero Lactobacillus (Figura 4), enquanto o tratamento de NCFM sozinho tende a reduzir os níveis da classe Bacteroidetes (Figura 5) e as Bactérias de Domínio (Figura 6), e o tratamento de B420 tendeu a reduzir os níveis da classe Bacteroidetes (Figura 5). Tendências para baixo estatisticamente não significativas também foram observadas para outras bactérias e tecidos (Figuras 2 a 6).

[000173] Os resultados demonstram que o tratamento probiótico pode reduzir o nível de bactérias em tecidos metabolicamente muito importantes, o tecido adiposo mesentérico e o fígado. Assim, os probióticos podem ser utilizados como um método inovador para prevenir ou tratar a translocação bacteriana nos tecidos, associada à dieta rica em gorduras e endotoxemia metabólica. Fisiologicamente particularmente importante pode ser a redução da família Enterobacteriaceae no tecido adiposo mesentérico e a classe Bacteriodetes no tecido hepático. Estes dois principais grupos de bactérias contêm LPS como um componente da parede celular bacteriana e, portanto, atuam como fonte potencial de LPS plasmático elevado, que é associado com endotoxemia metabólica. Estes tecidos desempenham um papel particularmente importante na endotoxemia metabólica e outras doenças

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40/48 metabólicas, uma vez que LPS provoca inflamação nestes tecidos, podendo levar a uma cascata de eventos adversos, incluindo o metabolismo de glicose prejudicado e sensibilidade à insulina reduzida.

Exemplo 2

Introdução [000174] O objetivo deste estudo foi determinar em camundongos o efeito da alimentação rica em gordura sobre a flora intestinal, a translocação bacteriana e a glicemia, bem como a função protetora potencial de Lactobacillus acidophilus NCFM™ (NCFM™) nestes parâmetros.

Materiais e métodos [000175] Obesidade e diabetes foram induzidos em camundongos machos C57BL/6 por uma dieta rica em gordura animal (60% de gordura, HFD). Os camundongos de controle receberam dieta padrão (4% de gordura, LFD). A partir de 19 semanas de idade, estes camundongos receberam 10⁹ UFC/dia de Lactobacillus acidophilus NCFM™ durante 3 semanas. A glicemia de jejum foi medida antes e após o tratamento com NCFM™.

[000176] Um teste de sensibilidade à insulina intraperitoneal foi realizado no dia antes do sacrifício. A análise da flora de colônias aderentes e da translocação bacteriana foi feita pelos seguintes métodos.

Análise bacteriana [000177] Após dissecção, o cólon e o íleo foram coletados. A parede do íleo e cólon foi utilizada para identificar e quantificar a flora aderente.

[000178] As amostras foram conservadas até 2 horas em meio de Ringer/Tween 80 sobcondições anaeróbias. Após a homogeneização, as amostras foram incubadas em Caldo Cérebro Coração para enriquecer e identificar o maior número de bactérias anaeróbias e aero-anaeróbias.

[000179] Diluições 1 em 10 e 1 em 100 foram realizadas em meio cisteína Ringer. Estas diluições foram espalhadas em ágar Columbia enriquecido com 5% de sangue de cavalo desfibrinado (CS) e incubadas a 37

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41/48 °C sob atmosfera aeróbia ou anaeróbia. As colônias foram contadas e identificadas 2 e 7 dias após o espalhamento.

[000180] Três tipos de meios foram utilizados. Alguns não seletivos ao ágar, ágar DCL (desoxicolato, citrato e lactose) para isolar enterobactérias e ágar MRS (Man, Rogosa, Sharpe) específico para Lactobacillus spp. A identificação das bactérias foi realizada pela determinação do tipo respiratório, a coloração de Gram e as características metabólicas.

Translocação bacteriana [000181] Após a dissecção, linfonodos mesentéricos (MLN) e tecido adiposo mesentérico (MAT) foram coletados. A translocação bacteriana foi quantificada em MLN e MAT.

[000182] As amostras foram conservadas até 2 horas em meio Ringer/Tween 80 sobcondições anaeróbias. Após a homogeneização, 1 mL das amostras iniciais foi inoculado no caldo de enriquecimento cérebro coração a fim de diminuir o limiar de detecção para as amostras com um baixo nível de bactérias. As culturas de enriquecimento foram cobertas por uma camada de parafina a fim de permitir o crescimento de anaeróbios incubados durante quatro dias e verificadas em relação ao crescimento diariamente.

[000183] As culturas positivas foram isoladas nas placas de ágar sangue Columbia modificadas incubadas durante 48h em condições anaeróbicas. Diferentes tipos de colônias foram sub-cultivadas e identificadas. Todas as incubações foram feitas a 37 °C. As contagens bacterianas foram estabelecidas e expressas como log de UFC/g de tecido.

Resultados [000184] Em 18 semanas de idade, camundongos de dieta com alto teor de gordura (HFD) pesavam 39% a mais do que os camundongos da dieta controlada (LFD) (39,2 ± 3,3 vs 28,1 ± 1,1 g, p < 0,01). Hiperglicemia de jejum aumentou em 77% (174 ± 31 vs 98 ± 6 mg/dL, p < 0,01), e a sensibilidade à insulina diminuiu (2 vs 48% da glicemia diminuiu 60 min após a injeção de insulina) foram encontrados no grupo HFD em comparação com LFD.

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42/48 [000185] A administração de Lactobacillus acidophilus NCFM™ não alterou a glicemia de jejum de camundongos LFD (95 ± 5 mg/dL vs 92 ± 6 mg/dL). No entanto, a glicemia de camundongos HFD diminuiu significativamente, o que tendeu à normalização (226 ± 23 mg/dL vs 125 ± 10 mg/dL, p < 0,02). Camundongos HFD tratados com NCFM™ permaneceram resistentes à insulina.

[000186] Camundongos HFD mostraram flora aderente à colônias significativamente mais abundante (6,5 ± 0,7 vs 4,6 ± 0,4 log de UFC/g, p < 0,01), incluindo mais lactobacilos (6,0 ± 0,5 vs 4,5 ± 0,2, p < 0,01) e enterococos (5,4 ± 0,4 vs 4,4 ± 0,2 UFC/g, p < 0,01). Este excesso foi cancelado pelo tratamento com NCFM™ (de volta para 5,4 ± 0,6 UFC/g para a flora total, 4,3 ± 0,2 UFC/g para lactobacilos e 4,6 ± 0,4 log de UFC/g para enterococos). O aumento de bactérias detectadas em gordura mesentérica de camundongos HFD (3,8 ± 1,5 vs 2,2 ± 0,9 log de UFC/g) foi ligeiramente modificado pelo tratamento com NCFM™ (4,0 ± 1,2 UFC/g). No cólon e no íleo de camundongos HFD, a flora se diversificou com aparecimento de bactérias Gram-negativas, que não foram depuradas por NCFM™. Nos linfonodos mesentéricos, as bactérias Gram-positivas apareceram em camundongos com dieta rica em gordura, e desapareceram após o tratamento com NCFM™.

Conclusão [000187] A cepa probióticas de Lactobacillus acidophilus NCFM™ tendeu a normalizar a hiperglicemia de jejum de camundongos obesos e diabéticos. Estes últimos mostraram flora intestinal aderente mais abundante e mais diversificada do que os camundongos de controle. O tratamento com Lactobacillus acidophilus NCFM™ levou à diminuição dos níveis de bactérias aderidas à mucosa no cólon, e à depuração de bactérias gram-positivas potencialmente patogênicas no íleo, cólon e linfonodos mesentéricos.

Exemplo 3

Medição de Escherichia coli aderente à mucosa e luminal e translocação de E. coli

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43/48 [000188] O efeito do tratamento probiótico na adesão da mucosa e translocação bacteriana de E. colifoi determinado através de cultura. O modelo de camundongo e o tratamento probiótico utilizados foram os mesmos descritos no Exemplo 1 acima. Além disso, um grupo que recebeu uma combinação de probiótico com um componente prebiótico (frutoligossacarídeos a 0,2 g por animal por dia) foi incluído.

[000189] Camundongos em jejum foram alimentados forçadamente com 10⁹ unidades formadoras de colônia de E. coli resistentes à ampicilina isoladas do camundongo e tornaram-se resistentes à ampicilina através de um plasmídeo expressando o gene da β-lactamase sob o controle de um promotor procariótico. Duas horas depois, os camundongos foram sacrificados e a mucosa ou o lúmen do duodeno, jejuno, íleo, ceco e cólon foram coletados separadamente, diluídos, plaqueados em agarose contendo ampicilina e incubados de um dia para o outro a 37 °C. O número de colônias foi contado. Da mesma forma, E. coli fluorescente resistente à ampicilina foi cultivada a partir dos tecidos coletados, incluindo fígado, baço, tecido adiposo mesentérico, tecido adiposo subcutâneo, gânglios mesentéricos e gânglios subcutâneos. A concentração de insulina foi medida a partir do plasma em jejum, assim como no estado alimentado.

Resultados [000190] A fim de investigar o papel de adesão da mucosa neste processo, a aderência de Escherichia coli comensais resistentes a antibiótico no muco intestinal de camundongos foi quantificada. A quantificação das colônias resistentes a antibióticos em uma placa de agarose proveniente da mucosa ou segmentos diferentes do lúmen mostrou que a dieta HFD elevou os níveis de E. coli associada com a mucosa, mas o tratamento com a cepa B420 probiótica reduziu a aderência à mucosa de E. coli induzida por HFD ao jejuno e íleo (Figura 7). Embora os testes iniciais não revelaram alterações no ceco ou cólon, outros testes mostraram que a cepa probiótica B420 reduziu a aderência à mucosa de E. coli induzida por HFD ao ceco (Figura 8).

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44/48 [000191] Tratamento com B420 sozinho ou em combinação com um prebiótico também reduziu a translocação de E. coli em tecidos de camundongos incluindo os tecidos incluindo o fígado, baço, tecido adiposo mesentérico, tecido adiposo subcutâneo, gânglio mesentérico e gânglio subcutâneo (Figura 9). A redução da aderência à mucosa e translocação de E. coli foi acompanhada com os níveis de insulina aumentados, isto é, os níveis de insulina em estado alimentado reduzidos e secreção de insulina melhorada no estado alimentado (Figura 10).

Exemplo 4

Redução da expressão gênica

Materiais e Métodos [000192] Células Caco-2 (ECACC, Salisbury, Reino Unido) foram utilizadas como modelo para células epiteliais do intestino humano (IECs) como em Putaala H, et al. (“Effect of four probiotic strains and Escherichia coli O157:H7 on tight junction integrity and cyclo-oxygenase expression”, Research in Microbiology 2008) e Makivuokko H, et al. (Nutr. Cancer, 2005, 52, 94-104). Em condições de cultura in vitro padrão compreendendo uma atmosfera umidificada a 37 °C com 5% de CO2, e meio de cultura de células Caco-2 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA e BD Biosciences, São José, CA, EUA).

[000193] Para a exposição das células Caco-2 de Bifidobacterium animalis ssp. lactis 420 foi propagada em caldo Man, Rogosa e Sharpe (MRS) de um dia para o outro, as densidades das células bacterianas foram determinadas por citometria de fluxo (FACS Calibur, Becton Dickinson, São José, CA, EUA), peletizadas (25 °C, 5 min, 3000 g), lavadas uma vez com o meio de cultura Caco-2 e diluídas em meio de cultura Caco-2 em uma proporção de 20 para 100 células bacterianas para uma célula Caco-2. Depois disso, as células Caco-2 foram tratadas durante 8 horas nas condições padrão in vitro. Como controle, células Caco-2 tratadas com meio de cultura Caco-2 sem B. animalis ssp. lactis adicionado foram usadas.

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45/48 [000194] Para a exposição de células Caco-2 com polidextrose, 1% (v/v) e 2% (v/v) de polidextrose (Litesse®) em meio de simulação de cólon foram as primeiras fermentadas em um simulador de cólon in vitro como em Makivuokko et al. acima referido. A simulação de cólon in vitro consiste em quatro fases e de quatro unidades paralelas foram utilizadas neste estudo.

[000195] Uma única unidade compreende quatro recipientes conectados em sequência (V1, V2, V3 e V4) com as condições ajustadas para representar diferentes partes do cólon humano em série que representam as diferentes partes do cólon: cólon proximal, ascendente, descendente e distal. Após a simulação, os sobrenadantes da fermentação de polidextrose foram peletizados (25 °C, 5 min, 10.000 g), diluídos a 10% (v/v) em meio de cultura Caco-2. As células foram tratadas por 24 h em condições in vitro padrão. Como controle, células Caco-2 tratadas de forma similar com o meio de simulação de cólon fermentado sem polidextrose adicionada foram usadas.

[000196] Após a exposição, o RNA total celular foi isolado de células Caco-2 com o minikit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha). Affymetrix U133+2.0 GeneChips (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA, EUA) foram usados para estudar o transcriptoma da célula humana. Todo o processamento, marcação, hibridizações, lavagem, coloração e varredura do RNA durante o processamento de microarranjo foram realizados de acordo com as recomendações padrão do fabricante.

[000197] Dados de microarranjos foram preprocessados com GC-RMA e analisados estatisticamente utilizando a linguagem de programação R (versão 2.5.0) (R Development Core Team; “R:A language and environment for statistical computing”, Viena, Áustria: R Foundation for Statistical Computing; 2006), e Bioconductor (versão 2.0) (Gentleman RC et al. “Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics” Genome Biol. 2004, 5, R80). Genes diferencialmente expressos foram selecionados com base na expressão gênica com uma diferença de razão de mais de 1,6 log na intensidade do sinal em comparação a do controle para as amostras tratadas

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46/48 com B. animalis ssp. lactis 420. No caso de amostras Caco-2 tratadas com polidextrose, genes diferencialmente expressos foram selecionados com base em seus comportamentos como um todo calculado usando a norma de genes dos três últimos recipientes (V2, V3, V4) de simulação.

[000198] A maioria dos genes seguiu um padrão similar através dos quatro recipientes: dentro dos perfis infrarregulados ou suprarregulados a expressão diminuiu ou aumentou para o último recipiente. Também, se um perfil de gene foi suprarregulado no controle, 0% polidextrose, ele foi um pouco mais suprarregulado no tratamento com 1% de polidextrose e ainda mais em 2% de polidextrose. Da mesma forma, nos perfis infrarregulados, o tratamento com 2% de polidextrose foi mais infrarregulado do que 1%, que foi mais infrarregulado do que o controle. Deste modo, os genes foram definidos como supra ou infrarregulados com base nos últimos três recipientes. A diferença entre as amostras não tratadas e as duas concentrações de polidextrose foi calculada usando o teste t de Student para amostras pareadas com valor de corte de p < 0,01.

Resultados [000199] A expressão dos genes relacionados com a absorção do colesterol intestinal é regulada em células Caco-2 por B. animalis ssp. lactis 420 (Tabela 1) ou por sobrenadantes da fermentação de polidextrose (Tabela 2).

[000200] O efeito infrarregulador em APOB, APOC2, APOC3, APOAIV e MTTP tem efeito redutor na absorção de triglicerídeos e colesterol do intestino (Iqbal J e Hussain MM, American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism 2009, 296, E1183-E1194), enquanto que o efeito suprarregulador em NPC1 aumenta a formação de HDL no intestino (Brunham LR et al, J Clin Invest 2006, 116, 1052-1062). NR2F2 e HNF4A são fatores de transcrição que regulam a expressão de genes da apolipoproteína: ver Antes TJ, et al. Biochemistry 2001, 40, 6720-30 e Leng SY, et al. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2007, 293, G475-G483.

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Tabela 1

Efeito de Bifidobacterium animalis ssp. lactis 420

Gene	Nível de expressão
Apolipoproteína B (APOB)	-2,89
Apolipoproteína C-II (APOC2)	-2,53
Apolipoproteína C-III (APOC3)	-1,47
Apolipoproteína A-IV (APOAIV)	-2,84
Proteína de transferência de triglicerídeo microssomal (MTTP)	-2,99
Subfamília 2 do receptor nuclear, grupo F, membro 2 (NR2F2), também conhecida como ARP1	-1,67
Fator nuclear de hepatócito, 4, alfa (HNF4A)	-2,3

Tabela 2

Efeito da fermentação de polidextrose

	Nível de expressão
	1 % de V1	1 % de V2	1 % de V3	1 % de V4	2 % de V1	2 % de V2	2 % de V3	2 % de V4
Doença de Niemann- Pick, tipo C1 (NPC1)	1,03	1,87	1,62	1,68	1,20	1,82	1,99	1,78

[000201] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistema descritos da presente invenção serão evidentes para as pessoas versadas na técnica sem se afastar do escopo e do espírito da presente invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita juntamente com modalidades preferidas específicas, deve-se compreender que a invenção tal como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para a

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48/48 realização da invenção que são óbvias para as pessoas versadas em bioquímica e biotecnologia ou áreas afins têm a intenção de estar dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (11)

1. Uso de uma bactéria selecionada de uma bactéria de ácido lático, uma Bifidobacterium ou uma mistura de quaisquer dessas, CARACTERIZADO pelo fato de ser na fabricação de um produto alimentício, suplemento dietético ou medicamento para o tratamento da endotoxemia metabólica em um mamífero, em que a bactéria é Bifidobacterium animalis subsp. lactis cepa 420, Lactobacillus acidophilus cepa NCFM e mistura dessas duas bactérias.

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2. Uso de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a endotoxemia metabólica compreende um aumento do nível de lipopolissacarídeos no corpo do mamífero por um fator na faixa de 1,5 a 20 em comparação com os níveis de lipopolissacarídeo basais.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a endotoxemia metabólica compreende um aumento do nível de lipopolissacarídeos no corpo do mamífero por um fator na faixa de 2 a 4 em comparação com os níveis de lipopolissacarídeo basais.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a endotoxemia é induzida por dieta e/ou associada à dieta.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é diabético e obeso.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é diabético e não obeso.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é não diabético e obeso.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero continua a ingerir uma dieta rica em gordura durante o tratamento.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a bactéria é administrada em combinação com um prebiótico ou uma mistura de prebióticos .

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10. Uso de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico é selecionado a partir de alginato, xantana, pectina, goma de alfarroba, inulina, goma guar, um galactoligossacarídeo, frutoligossacarídeo, polidextrose, lactitol, lactossacarose, um oligossacarídeo da soja, palatinose, um isomaltoligossacarídeo, um glicoligossacarídeo ou um xiloligossacarídeo, ou uma mistura de quaisquer dos mesmos.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico é polidextrose.

Petição 870180162869, de 13/12/2018, pág. 8/8 (S0‘0 > luspnis ap } aisa) op d ap jo|ba) sooijoiqojd + ejnpjoB ap toa) o^e itioo ejaip ap sodruS so a ejnpjoO ap joaj oj|e ωοο eiaip ap odru6 o aj}ua baiiboijiuBis eóuajajjQ = · (SOO > luapnig θΡ i ajsa) op d op J0|e/\) ejnpjoB ap joa) 0}|e luoo ejsip ap odruB o a leuxiou ogóej ap odruB o ajjua eAijeoijiuOis eâuajajiQ ₌

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