CN114933992A - 一种长双歧杆菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用 - Google Patents

一种长双歧杆菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种长双歧杆菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用，属于微生物技术领域。本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂能够改善溃疡性结肠炎小鼠疾病活动指数、结肠萎缩等表征指标，同时上调紧密连接蛋白的表达，维持肠道结构完整，增强肠道屏障功能，降低结肠组织炎症因子水平，缓解结肠组织炎症，效果优于果胶及临床药物美沙拉嗪。本发明所述的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂用于制备缓解溃疡性结肠炎的食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂，具有非常广泛的应用前景。

Description

一种长双歧杆菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用
技术领域
本发明涉及一种长双歧杆菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
IBD是病因尚未明确的一种肠道疾病，以慢性、反复发作的肠道炎症为主要特征，分为溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)。进入21世纪以来，IBD已成为对人类健康的重大威胁、给卫生保健系统带来巨大负担的全球性胃肠道疾病。随着工业化的发展和生活方式的改变，IBD的发病率逐年升高，但确切的发病机制仍不清楚，环境污染、饮食结构的改变、基因、免疫功能紊乱和病毒感染等因素都可能引起IBD，其中饮食被认为是最重要的因素。在目前的治疗IBD的方法中，药物或手术治疗，都有较多的副作用和很高的风险。
肠道菌群与IBD的关系是近年来科学研究的热点之一。临床研究表明UC患者普遍存在着肠道粘膜菌群失调的情况。采用基因敲除方法引起的免疫缺陷型小鼠，在肠道无菌环境下无法诱导形成IBD，当其肠道回复正常菌群状态，表现出肠道炎症，由此可见肠道菌群是IBD形成的必须条件。因此调控肠道菌群以缓解炎症反应是未来寻求IBD有效治疗方案的重要研究方向。
长双歧杆菌是在婴儿和成人的肠道微生物群中发现的最常见的双歧杆菌菌种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》及欧洲食品安全局(European FoodSafety Agency)安全资格认定清单，在宿主肠道内具有良好的定植能力，并发挥其益生功能，在各种疾病治疗中具有良好的效果。同时，膳食纤维如果胶、菊粉、β-葡聚糖等能够通过缓解结肠萎缩、增强肠道屏障、调节炎症因子、降低氧化应激水平、维持肠道微生态平衡等方面缓解肠道炎症(Fan L,Zuo S,Tan H,et al.Preventive effects of pectin withvarious degrees of esterification on ulcerative colitis in mice[J].Food&Function,2020,11,2886-2897)。
但是，单独采用膳食纤维进行干预可能会引起不良反应，比如，健康成年人每日摄入30g的阿拉伯胶会导致恶心、腹泻及胀气等症状(Babiker R,Merghani TH,Elmusharaf Ket al.Effects of gum arabic ingestion on body mass index and body fatpercentage in healthy adult females:two-arm randomized,placebo controlled,double-blind trial[J].Nutrition Journal,2012,11:7)。因而通过挖掘益生菌种及其与膳食纤维的组合物，能够为缓解溃疡性结肠炎药物组合物或保健品的开发提供新思路。
发明内容
本发明通过大量实验研究，筛选出了一种具有缓解溃疡性结肠炎的长双歧杆菌，并证明该菌株以及菌株与果胶的复合剂在动物模型中可改善溃疡性结肠炎小鼠体重减轻、疾病活动指数、脾脏肿大、结肠萎缩等表征指标，同时维持肠道屏障完整，降低氧化应激水平，缓解结肠组织炎症，并且发现该菌株与果胶的复合剂比已证明具有缓解结肠炎功效的果胶效果更好，在溃疡性结肠炎的膳食干预方面具有重要意义和广阔前景。
本发明提供了一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61440。
所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002是从来源于江西南昌地区的健康人体粪便样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，并将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示，与双歧杆菌属的核酸序列相似度高达99.79％，该菌株为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，命名为：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002。
所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002具有下列特性：
菌体特征：革兰氏染色阳性杆状细菌，有时呈Y型或V型，无孢子，无鞭毛，菌体约0.5～1.5μm宽，1.3～8μm长。
菌落特征：在培养基上形成明显地菌落，直径在0.3～2mm之间，正面形态圆形，中间凸起，边缘整齐，微白，不透明，表面湿润光滑。
生长特性：该菌株为专性厌氧菌，最适生长温度是36℃～38℃，最适生长pH值为6.6～7.0，在含有葡萄糖的培养基中生长良好，16～24h可进入对数后期或稳定前期。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有上述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002或其发酵液，或其提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)NSP002的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明还提供了一种复合制剂，所述复合制剂中含有上述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及益生元，或所述复合制剂中含有上述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002，或含有上述微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述复合制剂中，长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)NSP002的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述复合制剂中，所述益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％，并且不少于总质量的20％。
本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)NSP002；或含有上述微生物菌剂；或含有上述复合制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)NSP002的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，含有上述复合制剂，所述复合制剂中的益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％，并且不少于总质量的20％。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、营养补充剂、保健品、药物组合物或饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、营养补充剂、保健品、药物组合物或饲料添加剂为，含有上述微生物菌剂或复合制剂以及可接受的载体和/或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述可接受的辅料，包括一种或多种通常使用的增稠剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、乳化剂、防腐剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂等。
本发明的一种实施方式中，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙和/或微晶纤维素。
在本发明的一种实施方式中，所述粘合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明的一种实施方式中，所述润湿剂为水、乙醇、淀粉和/或糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和/或聚乙二醇。
在本发明的一种实施方式中，所述矫味剂为单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、樱桃糖浆、柠檬、茴香、薄荷油、海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、酒石酸和/或碳酸氢钠。
本发明的一种实施方式中，所述食品包括饮料、奶制品或其他含有上述微生物菌剂或复合制剂的食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液等剂型。
本发明还提供了上述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002、上述微生物菌剂或复合制剂在预防和/或治疗溃疡性结肠炎方面的应用。
本发明还提供了上述长双歧杆菌，或上述微生物菌剂，或上述复合制剂在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、营养补充剂、保健品、药物组合物或饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)NSP002的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，含有上述复合制剂，所述复合制剂中的益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％，并且不少于总质量的20％。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、营养补充剂、保健品、药物组合物或饲料添加剂为，含有上述微生物菌剂或复合制剂以及可接受的载体和/或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述可接受的辅料，包括一种或多种通常使用的增稠剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、乳化剂、防腐剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂等。
本发明的一种实施方式中，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙和/或微晶纤维素。
在本发明的一种实施方式中，所述粘合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明的一种实施方式中，所述润湿剂为水、乙醇、淀粉和/或糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和/或聚乙二醇。
在本发明的一种实施方式中，所述矫味剂为单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、樱桃糖浆、柠檬、茴香、薄荷油、海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、酒石酸和/或碳酸氢钠。
本发明的一种实施方式中，所述食品包括饮料、奶制品或其他含有上述微生物菌剂或复合制剂的食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液等剂型。
有益效果
本发明提供了一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002，并且该菌株单独使用或在与果胶复配后能够缓解溃疡性结肠炎，具体体现在：
1)能够耐受酸胁迫，有利于通过消化道抵达肠道定植；
2)能够改善溃疡性结肠炎小鼠疾病活动指数；
3)能够增加结肠组织中紧密连接蛋白的水平，维持肠道屏障完整；
4)能够缓解溃疡性结肠炎小鼠结肠萎缩；
5)能够降低溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中促炎因子IL-1β的水平，缓解炎症。
因此，本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002可用于制备能够缓解溃疡性结肠炎的食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂，具有非常广泛的应用前景。
生物材料保藏
一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002，分类学命名为Bifidobacterium longum，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61440，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002在固体培养基上的菌落形态。
图2：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及长双歧杆菌ATCC15707在pH4.0条件下的存活情况。
图3：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂干预溃疡性结肠炎小鼠后疾病活动指数的变化。
图4：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂干预溃疡性结肠炎小鼠后结肠中紧密连接蛋白Occludin水平的变化。
图5：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂干预溃疡性结肠炎小鼠后结肠长度的变化。
图6：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂干预溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理结构的变化。
图7：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂干预溃疡性结肠炎小鼠后结肠中IL-1β的水平变化。
其中，模型组为DSS结肠炎小鼠组，NSP002为DSS+长双歧杆菌NSP002组，NSP002+P为DSS+长双歧杆菌NSP002+果胶组；果胶为DSS+果胶组；美沙拉嗪为DSS+阳性药物美沙拉嗪组。
“*”表示与模型组具有显著性差异(*:p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001)；“#”表示与正常组具有显著性差异(#:p<0.05；##:p<0.01；###:p<0.001)。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的葡聚糖硫酸钠(DSS)购自MPBio公司，所述美沙拉嗪颗粒购自法国爱的发制药有限公司。
下述实施例中所涉及的长双歧杆菌ATCC15707购自广东省科学院微生物研究所。
下述实施例中所涉及的果胶为酯化度低于50％的果胶，购自CPKelco公司。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：MRS液体培养基为青岛海博生物公司产品，将上述产品按说明溶解于蒸馏水中，并加入半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，混合均匀，然后调整其pH为6.6-7.0，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述液体培养基。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上加入1.5-2％的琼脂，混合均匀，然后调整其pH为6.6-7.0，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述固体培养基。
双歧杆菌液体培养基的制备：配制MRS培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)，溶解于蒸馏水中，并加入半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，混合均匀，然后调整其pH为6.6-7.0，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述双歧杆菌液体培养基。
双歧杆菌固体培养基的制备：按照双歧杆菌液体培养基的配方，再加入1.5-2％的琼脂，混合均匀，然后调整其pH为6.6-7.0，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述双歧杆菌固体培养基。
下述实施例中所涉及的溶液的配制方法如下：
3％DSS的灭菌蒸馏水的配制方法为：称取30g的DSS，溶于1L蒸馏水中，采用高压蒸汽灭菌锅，121℃灭菌15min后，即得到所述3％DSS的灭菌蒸馏水。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
疾病活动指数(DAI)的判断标准如表1：
表1：疾病活动指数(DAI)评分
Figure BDA0003677211720000061
注：正常粪便：成形粪便；松散粪便：不黏附于肛门的糊状、半成形粪便；稀便：黏附于肛门的稀水样粪便。
实施例1：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002的分离筛选
具体步骤如下：
1、样品采集
采集江西南昌地区的健康人体粪便样本，样本置于保藏管中，保存于装有冰袋的保温盒中，带回实验室后迅速置于-80℃冰箱待分离筛选。
2、长双歧杆菌的分离纯化
(1)粪便样品梯度稀释：在无菌厌氧环境中，取约1g步骤1采集到的粪便样本，加入到9mL生理盐水，得到第一梯度稀释液，吸取1mL第一梯度稀释液于9mL生理盐水，得到第二梯度稀释液，以此类推，共配制9个梯度稀释液；
(2)涂布培养：分别吸取100μL上述所有梯度稀释液分别置于双歧杆菌固体培养基上，涂布后至于37℃厌氧条件下培养48h，得到稀释涂布平板；
(3)纯化培养：挑取双歧杆菌固体培养基上不同形态的菌落进行划线分离，直至得到边缘整齐，微白，不透明，表面湿润光滑，且形态一致的纯的单菌落(如图1所示)；挑取双歧杆菌固体培养基上的纯菌落接种于5mL双歧杆菌液体培养基中，至于37℃厌氧条件下培养24h，得到纯化培养液。
3、菌种保藏与鉴定
取10μL步骤2获得的纯化培养液在载玻片上进行涂片固定，用草酸铵结晶紫试剂染1分钟后，蒸馏水冲洗；再加碘液覆盖涂面染约1分钟，蒸馏水冲洗；加95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分；用蕃红染色液染1分钟后，蒸馏水冲洗。干燥后镜检。结果如图2所示，发现编号NSP002的菌株为革兰氏阴性杆菌。
4、将步骤2获得的NSP002培养液在8000rpm条件下离心10min，弃上清得菌体。用细菌16S rDNA引物(见表2)进行PCR。
表2引物名称
Figure BDA0003677211720000071
PCR产物经核酸电泳分析确认后，扩增产物送至公司进行测序，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，测序结果与NCBI数据库中序列进行比对分析；比对结果发现编号NSP002的菌株为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，命名为：长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)NSP002。
实施例2：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002的胁迫耐受能力
1、培养基配制
酸性MRS液体培养基的配置：MRS液体培养基为青岛海博生物公司产品，将上述产品按说明溶解于蒸馏水中，并加入半胱氨酸盐酸盐0.5～1g/L，混合均匀，然后调整其pH为3.0，115～121℃灭菌15～20min后，即得到所述培养基。
2、实验方法
分别将长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及ATCC15707在MRS固体培养基上划线，长出单菌落后，挑取单菌落接种至酸性MRS液体培养基中生长24h后，分别将108cfu菌液接种至10mL步骤1配制得到的培养基中，在37℃下厌氧培养8h；
期间于0、2、4、6、8h分别测定培养液中长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及ATCC15707的活菌数，计算长双歧杆菌的存活率(各时间点培养液中长双歧杆菌的活菌数除以0h培养液中长双歧杆菌的活菌数×100％得到的)，结果如图2所示。
结果显示：
厌氧培养2h时，长双歧杆菌NSP002的存活率为72.12％，高于长双歧杆菌ATCC15707的63.42％；
厌氧培养4h时，长双歧杆菌NSP002的存活率为60.06％，高于长双歧杆菌ATCC15707的49.39％；
厌氧培养6h时，长双歧杆菌NSP002的存活率为在50.70％，而ATCC15707存活率持续显著下降，仅为39.18％；
厌氧培养8h时，长双歧杆菌NSP002的存活率维持在49.59％，而ATCC15707存活率也保持平稳，为38.06％。
以上结果表明，本发明的长双歧杆菌NSP002对接近于胃液的酸性环境的耐受能力优于长双歧杆菌标准株ATCC15707，该优势有利于长双歧杆菌NSP002耐受上消化道的胁迫，有利于顺利到达肠道发挥益生功能。
实施例3：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂对溃疡性结肠炎小鼠病理表征指标的影响
1、长双歧杆菌NSP002冻存剂的制备：
(1)菌株培养：将长双歧杆菌NSP002在MRS固体培养基上划线，长出单菌落后，挑取接种至MRS液体培养基，在37℃下厌氧培养18～24h，制备得到长双歧杆菌NSP002种子液。
(2)保护剂制备：用蒸馏水配制体积分数为20％～25％的甘油溶液，并加入质量分数为0.1％的半胱氨酸盐酸盐，121℃灭菌15min后，即得到所述保护剂。
(3)保存方法：将步骤(1)制备得到的长双歧杆菌NSP002种子液在4℃下5000rpm离心10min后，取沉淀，即为长双歧杆菌NSP002菌体，将长双歧杆菌NSP002菌体用无菌PBS溶液(pH 7.2)清洗1～2次后，采用步骤(2)制备的保护剂重悬长双歧杆菌NSP002菌体，得到重悬液，调整重悬液中菌浓为5.0×108CFU/mL，即得所述长双歧杆菌NSP002冻存剂，于-80℃保存备用。
2、果胶溶液的制备及灌胃方法
根据小鼠体重称取酯化度低于50％的果胶(如CPKelco产品)溶于水中，制备得到不同浓度的果胶溶液，具体灌胃时，按照小鼠的体重进行灌胃，体积为0.2mL，灌胃剂量为：每千克小鼠体重300mg果胶。
3、实验方法
取5周龄健康雄性C57BL/6小鼠60只，随机分为六组：正常组、溃疡性结肠炎组(模型组)、DSS+长双歧杆菌NSP002组(NSP002组)、DSS+长双歧杆菌NSP002+果胶组(NSP002+果胶组)、DSS+果胶组(果胶组)及DSS+美沙拉嗪(阳性药物对照，美沙拉嗪组)，每组含小鼠10只。
小鼠饲养于25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照12h黑暗的标准化实验室中，适应性正常喂养7天后开始为期14天的实验，实验流程如表3所示。
表3实验流程
Figure BDA0003677211720000091
Figure BDA0003677211720000101
实验全程(1～14天)NSP002组小鼠每24小时灌胃一次0.2mL步骤1制备的长双歧杆菌NSP002冻存剂(菌浓为5.0×108CFU/mL)，NSP002+果胶组小鼠每24小时各灌胃一次0.2mL步骤1制备的长双歧杆菌NSP002冻存剂(5.0×108CFU/mL)和0.2mL步骤2制备的果胶溶液(300mg/kg bw)，果胶组小鼠每24小时各灌胃一次0.2mL步骤2制备的果胶溶液(300mg/kgbw)，美沙拉嗪组小鼠每24小时灌胃一次0.2mL步骤3制备的美沙拉嗪溶液(300mg/kg bw)。第1～7天：所有小鼠均自由饮用灭菌蒸馏水。第8～14天：除正常组小鼠自由饮用灭菌蒸馏水，其余组小鼠均改为自由饮用含3％DSS的灭菌蒸馏水。实验期间，每日监测记录各组小鼠的状态，计算小鼠DAI值。
实验结果如图3所示，结果显示，正常组小鼠的DAI值为0，模型组小鼠的DAI值升至2.76(p<0.001)；经长双歧杆菌NSP002干预后，小鼠DAI指数明显降低至2.39(p<0.01)；NSP002+果胶组小鼠的DAI值降至2.10(p<0.001)，低于单独果胶干预的果胶组小鼠(2.21)及阳性药物美沙拉嗪组小鼠(2.38)。
以上结果表明，本发明的长双歧杆菌NSP002及其与果胶的复合物均能够降低溃疡性结肠炎小鼠的疾病活动指数，并且长双歧杆菌NSP002与果胶复配制剂的效果优于果胶。
实施例4：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂对溃疡性结肠炎小鼠肠道屏障的影响
具体实施方式同实施例3，在实验后处死所有小鼠，分别收集各组小鼠结肠组织样本。采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司的产品)测定结肠组织中紧密连接蛋白(Occludin)的含量，实验结果如图4所示。
结果显示，模型组小鼠结肠中的紧密连接蛋白(Occludin)含量从110.64pg/mL(正常组)显著降至75.14pg/mL(p<0.001)；
长双歧杆菌NSP002组小鼠结肠中的紧密连接蛋白(Occludin)含量为102.25pg/mL(p<0.001)；NSP002+果胶组小鼠结肠中的紧密连接蛋白(Occludin)含量为103.99pg/mL(p<0.001)，均高于单独果胶干预的果胶组小鼠结肠紧密连接蛋白水平(101.11pg/mL)及阳性药物美沙拉嗪组小鼠结肠紧密连接蛋白水平(87.38pg/mL)。
以上结果表明，本发明的长双歧杆菌NSP002及其与果胶的复合物均能够上调紧密连接蛋白的水平，维持肠道屏障完整，并且长双歧杆菌NSP002与果胶复配制剂的效果优于果胶及临床药物。
实施例5：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂对溃疡性结肠炎小鼠器官指数的影响。
具体实施方式同实施例3，在实验后处死全部小鼠，分别收集各组小鼠结肠组织样本，量取结肠组织的长度，实验结果如图5所示。
结果显示：模型组小鼠的结肠长度由8.23cm(正常组)缩短至5.96cm(p<0.001)。
长双歧杆菌NSP002组小鼠的结肠长度为6.94cm(p<0.01)，NSP002+果胶组小鼠的结肠长度为7.36cm(p<0.001)，效果优于单独果胶干预的果胶组小鼠(7.22cm)；并且，采用长双歧杆菌NSP002的效果要优于阳性药物美沙拉嗪组小鼠(6.88cm)的结肠长度。
以上结果表明，本发明的长双歧杆菌NSP002及其与果胶的复合物均能够恢复溃疡性结肠炎小鼠的器官指数异常，增加结肠组织长度，并且长双歧杆菌NSP002与果胶复配制剂的效果优于果胶及临床药物。
实施例6：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理学的影响。
具体实施方式同实施例3，在实验后处死全部小鼠，分别收集结肠组织样本，通过苏木精-伊红染色法结合显微镜观测小鼠结肠组织病理结构的变化，实验结果如图6所示。
结果显示，正常组小鼠结肠黏膜上皮细胞结构完好，结肠绒毛及隐窝结构完整，无溃疡或损伤。模型组小鼠，可见明显的肠黏膜破坏，胞质疏松，出现大量炎症细胞浸润，结肠绒毛破坏，肠隐窝消失。果胶及阳性药物美沙拉嗪的干预能明显改善DSS引起的结肠组织结构损伤。长双歧杆菌NSP002能够有效减少的炎症细胞浸润，维持肠黏膜上皮细胞完整，相比果胶组小鼠的结肠组织细胞排列更为致密。同时，NSP002与果胶复配后，结肠组织形态也表现出明显改善。
实施例7：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002及其复合制剂对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子水平的影响。
具体实施方式同实施例3，收集正常组、模型组、NSP002组、NSP002+果胶组及果胶组小鼠的结肠组织样本。采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司的产品)测定结肠中IL-1β的含量，实验结果如图7所示。
结果显示：模型组小鼠结肠中IL-1β的含量从286.84pg/mL(正常组)显著上升1060.52pg/mL(p<0.001)。
经长双歧杆菌NSP002干预后，结肠中IL-1β的含量降低至600.01pg/mL(p<0.01)；
NSP002+P组小鼠结肠中IL-1β的含量为480.88pg/mL(p<0.001)，低于果胶组小鼠结肠中IL-1β的含量(501.19pg/mL)。
以上结果表明，本发明的长双歧杆菌NSP002及其与果胶的复合物均能够降低溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中促炎因子的水平，从而缓解结肠炎症。并且长双歧杆菌NSP002与果胶复配制剂的效果优于果胶。
实施例8：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002的应用
长双歧杆菌NSP002可用于制备发酵乳，发酵乳的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的长双歧杆菌NSP002纯化后的培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，于厌氧工作站中37℃培养36h，6000r/min离心20min，收集菌泥；使用PBS对菌泥进行清洗后，用保护剂重悬至浓度为1×1010CFU/mL，得到悬浮液；将悬浮液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到冻干粉；
其中，培养基为MRS液体培养基；
保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠；
(2)将冻干粉与商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌按照质量比1:1:1的比例混合，得到发酵剂；
(3)将糖添加至鲜奶中至浓度为5％，得到混合液；将混合液在65℃、20MPa的条件下进行均质后在95℃下保温杀菌5min，得到发酵原料；将发酵原料降温至35℃后以0.03％(v/v)的接种量将步骤(2)制得的发酵剂接种至发酵原料中，于35℃下保温发酵16h，得到发酵乳；将发酵乳于42℃的条件下凝乳后，在4℃下冷藏24h进行后熟，得到发酵乳成品。
实施例9：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002复合制剂的应用
长双歧杆菌NSP002复合制剂可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的长双歧杆菌NSP002纯化后的培养液以3％(v/v)的接种量接种到培养基中，37℃培养36h，6000rpm离心20min，收集菌泥；使用无菌水对菌泥进行清洗后，用脱脂乳重悬至浓度为2×1010CFU/mL，得到悬浮液；
(2)将步骤(1)制得的悬浮液添加至浓度为3％的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得长双歧杆菌NSP002的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为2％的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；
(3)将步骤(2)制得的粉剂与果胶粉末一起装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大学
<120> 一种长双歧杆菌及其复合制剂在缓解溃疡性结肠炎中的应用
<130> BAA211683A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1432
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcattaagg gggtcttacc atgcagtcga acgggatcca tcaggctttg cttggtggtg 60
agagtggcga acgggtgagt aatgcgtgac cgacctgccc catacaccgg aatagctcct 120
ggaaacgggt ggtaatgccg gatgctccag ttgatcgcat ggtcttctgg gaaagctttc 180
gcggtatggg atggggtcgc gtcctatcag cttgacggcg gggtaacggc ccaccgtggc 240
ttcgacgggt agccggcctg agagggcgac cggccacatt gggactgaga tacggcccag 300
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcga 360
cgccgcgtga gggatggagg ccttcgggtt gtaaacctct tttatcgggg agcaagcgag 420
agtgagttta cccgttgaat aagcaccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
tagggtgcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaaggg ctcgtaggcg gttcgtcgcg 540
tccggtgtga aagtccatcg cttaacggtg gatccgcgcc gggtacgggc gggcttgagt 600
gcggtagggg agactggaat tcccggtgta acggtggaat gtgtagatat cgggaagaac 660
accaatggcg aaggcaggtc tctgggccgt tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga 720
gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac ggtggatgct ggatgtgggg 780
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ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tgggcttgac atgttcccga cggtcgtaga 960
gatacggctt cccttcgggg cgggttcaca ggtggtgcat ggtcgtcgtc agctcgtgtc 1020
gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gccccgtgtt gccagcggat 1080
tatgccggga actcacgggg gaccgccggg gttaactcgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140
agatcatcat gccccttacg tccagggctt cacgcatgct acaatggccg gtacaacggg 1200
atgcgacgcg gcgacgcgga gcggatccct gaaaaccggt ctcagttcgg atcgcagtct 1260
gcaactcgac tgcgtgaagg cggagtcgct agtaatcgcg aatcagcaac gtcgcggtga 1320
atgcgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcaagtcat gaaagtgggc agcacccgaa 1380
gccggtggcc taaccccttg tgggatgagg ccgtctaacg tagttcccgg gg 1432

Claims (10)

1.一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61440。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的长双歧杆菌NSP002或其发酵液，或其提取物。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，长双歧杆菌NSP002的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
4.一种复合制剂，其特征在于，所述复合制剂中含有权利要求1所述的长双歧杆菌NSP002，或含有权利要求1所述的长双歧杆菌NSP002及益生元，或含有权利要求2或3所述的微生物制剂。
5.如权利要求4所述的复合制剂，其特征在于，所述的复合制剂中，长双歧杆菌NSP002的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g；所述益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％，所述果胶的添加量不少于总质量的20％。
6.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的长双歧杆菌NSP002，或所述产品中含有权利要求2或3所述的微生物菌剂，或所述产品中含有权利要求4或5所述的复合制剂。
7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、营养补充剂、保健品、药物组合物或饲料添加剂。
8.如权利要求6或7所述的产品，其特征在于，所述产品中，长双歧杆菌NSP002的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
9.权利要求1所述的长双歧杆菌NSP002，或权利要求2或3所述的微生物菌剂，或权利要求4或5所述的复合制剂在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂。
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