CN114558036A - 脆弱拟杆菌在改善和治疗腹泻中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了脆弱拟杆菌在改善和/或治疗腹泻中的应用。通过不同的小鼠腹泻模型试验证明，保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY‑312或其灭活菌，具有改善和治疗腹泻的作用。脆弱拟杆菌灭活菌粉在不同浓度配方下，对改善感染性腹泻或非感染性腹泻效果好，且对机体没有副作用，具有很好的食用和应用前景，提供了一种适合人体服食的保健和改善腹泻的良品。

Description

脆弱拟杆菌在改善和治疗腹泻中的应用
技术领域
本发明涉及一种脆弱拟杆菌的应用，具体而言，涉及脆弱拟杆菌在改善和/或治疗腹泻中的应用。
背景技术
腹泻是一种胃肠道疾病，其特征为较平常大量且频繁(每天排便多于3次)的水状或软性大便。在极端情况下，每天可损失超过20升的液体。同时也是危害机体健康的重要疾病之一，它看起来是一种小病，但其致死率却仅次于肿瘤、糖尿病等，在诸多疾病死亡率中均位居前列。世界卫生组织2018年发布的资料显示，腹泻病是造成全球5岁以下儿童死亡的第二大原因，每年约有52.5万名五岁以下儿童死于腹泻病。成人腹泻的流行情况也不容小觑，大多数成年人每年至少有过一次腹泻，肠道传染病流行时波及面广，由此造成的危害性更大。
腹泻不是一种独立的疾病，而是很多疾病的一个共同表现。腹泻的病因可分为感染性腹泻和非感染性腹泻。感染性腹泻多是由病毒、细菌、真菌和寄生虫感染所致，可伴有腹痛、发热及白细胞增多等症状；非感染性腹泻，包括食品、化学品中毒、药源性腹泻、食饵性腹泻、症状性腹泻、过敏性腹泻、及其他先天代谢性疾病腹泻等。
当前，临床对于腹泻的治疗主要在于药物对症治疗，如蒙脱石散、咯派丁胺、鞣酸蛋白、次碳酸铋、氢氧化铝凝胶等。根据症状的持续时间可区分急性腹泻和慢性腹泻，其症状分别持续不到两周及至少两周。治疗感染性急性腹泻首选抗生素(如氟哌酸、左氧氟沙星、莫西沙星、甲硝唑等)进行病因治疗，但仅仅使用抗生素进行治疗，会增加患者肠胃的副作用，严重时甚至会加重病情，因此需辅以止泻药进行对症治疗。而慢性腹泻的治疗多为长期间歇性治疗，通过饮食调整，辅以如蒙脱石散、次碳酸铋等无中枢反应药物，以及双歧杆菌活菌、地衣芽孢杆菌活菌等微生态调节剂。
共生细菌在肠道稳态中起着重要作用，并对肠道完整性具有一定的保护作用。因此，采用益生菌治疗腹泻成为近年来研究的热点。益生菌是通过定植在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。副益生菌被定义为“无活力的微生物细胞，如果口服或局部使用足够数量，即可为使用者带来好处”，该定义包括形态不完整的微生物细胞和形态完整的微生物细胞(参考Taverniti V,Guglielmetti S.Theimmunomodulatory properties of probiotic microorganisms beyond theirviability(ghost probiotics:proposal of paraprobiotic concept)[J].Genes&Nutrition,2011,6(3):261-274.))。主流研究观点认为，破碎的微生物细胞能够更好地释放功能分子，因此具有更好的效果；但对于完整的灭活微生物细胞，没有统一的观点能够说明其在某些应用中优于活菌的原因。目前针对副益生菌的研究集中在乳杆菌、双歧杆菌等一代益生菌上，研究方向相对固定。因此，有必要开发新型副益生菌，扩展副益生菌的适应症范围。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了脆弱拟杆菌在改善和/或治疗腹泻中的应用。
为了更好地解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了脆弱拟杆菌在制备改善和/或治疗腹泻的组合物中的应用，所述脆弱拟杆菌为活菌或灭活菌。
在本发明的实施方案中，脆弱拟杆菌选自保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
根据本发明的实施方案，所述腹泻为感染性腹泻或非感染性腹泻。
优选的，所述感染性腹泻为病毒感染性腹泻、细菌感染性腹泻和寄生虫感染性腹泻中的一种或多种；和/或，所述非感染性腹泻为非感染性炎症腹泻、肿瘤性腹泻、吸收不良性腹泻、运动性腹泻、肠道菌群失调相关性腹泻和药物相关性腹泻中的一种或多种。
优选的，所述细菌感染为沙门菌属、志贺菌属、弯曲杆菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、产毒性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、致泻性大肠埃希菌等中的一种或多种；和/或，所述吸收不良性腹泻为继发性小肠吸收不良性腹泻，优选的，所述继发性小肠吸收不良性腹泻为消化不良性腹泻，进一步优选的，所述消化不良性腹泻为乳糖吸收不良性腹泻；和/或，所述肠道菌群失调相关腹泻为艰难梭菌失调相关性腹泻；和/或，所述药物相关性腹泻中的药物为泻药(酚酞、番泻叶、蓖麻油等)、高渗性药(硫酸镁、硫酸钠等)、抗生素(青霉素类、头孢菌素类、林可霉素、克林霉素等)、化疗药(表柔比星、多西他赛、氟尿嘧啶、羟基喜树碱等)、抗高血压药(普萘洛尔、利血平、甲基多巴等)、抗心律失常药(强心苷类、奎尼丁等)、利尿药(呋塞米、依他尼酸等)、降脂药(氯贝丁酯、考来烯胺等)中的一种或多种，进一步优选的，所述药物为泻药、高渗性药和抗生素中的一种或多种。
优选的，所述脆弱拟杆菌为灭活菌，进一步优选的，所述脆弱拟杆菌为形态完整的灭活菌和/或形态不完整的灭活菌，更优选为形态完整的灭活菌。
优选的，上述脆弱拟杆菌是通过干热、湿热、过滤、有机溶剂、化学试剂、紫外或红外射线、发酵、冻干、基因重组、基因修饰或改造的方法中的任意一种或多种灭活的。
优选的，所述脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌灭活菌粉，所述脆弱拟杆菌灭活菌粉经过发酵培养、氯化钠水溶液洗涤与离心、加入赋形剂重悬、灭活和干燥步骤制备得到。
进一步优选的，所述脆弱拟杆菌灭活菌粉通过以下方法制备获得，包括以下步骤：
(1)取脆弱拟杆菌发酵培养；
(2)发酵培养结束后，对发酵液进行离心，收集菌体，按菌体与氯化钠水溶液的重量体积比为1g:(10～30)mL加入氯化钠水溶液洗涤、离心，得到洗涤后菌体；
(3)向洗涤后菌体中加入第一赋形剂溶液混合重悬得到菌体溶液，再进行灭活处理，离心，收集灭活菌泥；
(4)向步骤(3)获得的灭活菌泥中加入第二赋形剂溶液，得灭活菌原液；
(5)将步骤(4)获得的灭活菌原液干燥至残留水分低于5wt％，即得脆弱拟杆菌灭活菌粉。
根据本发明的实施方案，步骤(2)中，发酵液的菌数达到108CFU/mL以上。
根据本发明的实施方案，步骤(2)中，所述氯化钠水溶液的质量浓度为0.6-1.5wt％，优选为0.65-1.2wt％，更优选为0.8-1.0wt％，最优选0.85-0.95wt％，例如为0.9wt％的氯化钠水溶液。
根据本发明的实施方案，所述赋形剂包括甘露醇、山梨醇、麦芽糊精、乳糖、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、右旋糖酐、脯氨酸、赖氨酸、丙氨酸、酪蛋白、脱脂乳中的至少一种。
根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述菌体与第一赋形剂溶液的重量体积比为1g:(5～40)mL。
根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述第一赋形剂溶液中，赋形剂的质量分数为4～30wt％，所述赋形剂具有如上所述含义。
根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述第一赋形剂溶液的溶剂选自氯化钠水溶液，其中，所述氯化钠水溶液具有如上所述含义。进一步优选地，所述第一赋形剂溶液的溶剂选自生理盐水，例如0.9wt％氯化钠水溶液。
根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述灭活处理的方法选自热灭活、冷冻灭活或者化学灭活中的至少一种，优选为热灭活。
示例性地，所述热灭活的温度为60～100℃，热灭活的时间为10～60min。
根据本发明的实施方案，步骤(4)中，加入第二赋形剂溶液使灭活菌原液的总重量与步骤(3)灭活前的菌体溶液重量一致。优选地，所述第二赋形剂溶液与所述第一赋形剂溶液相同或不相同。
根据本发明的实施方案，所述第二赋形剂溶液中，赋形剂的质量分数为4～30wt％，所述赋形剂具有如上所述含义。
优选地，所述第二赋形剂溶液的溶剂选自氯化钠水溶液，其中，所述氯化钠水溶液具有如上所述含义。进一步优选地，所述第一赋形剂溶液的溶剂选自生理盐水，例如0.9wt％氯化钠水溶液。
示例性地，所述第二赋形剂溶液与所述第一赋形剂溶液相同。
根据本发明的实施方案，步骤(5)中，所述干燥的方式选自真空冷冻干燥和/或喷雾干燥，优选为真空冷冻干燥。
示例性地，所述真空冷冻干燥的条件包括：冷冻温度为-20～-40℃，冷冻时间为1～3小时，真空度为0.20～0.25mbar。
示例性地，所述真空冷冻干燥的工艺包括：-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥、解析干燥制备成灭活菌粉。
根据本发明的实施方案，所述制备方法中，对所述离心的条件不做具体限定，只要能实现所需的离心效果即可，例如所述离心的转速为10000～20000rpm。
根据本发明的实施方案，上述的应用和/或用途中，组合物可以是药物组合物、食品、保健品或食品添加剂中的任意一种。
优选的，上述的应用和/或用途中，所述的药物组合物含有药学有效剂量的保藏编号为CGMCC No.10685的灭活的脆弱拟杆菌ZY-312菌粉。
上述的药物组合物中，所述药学有效剂量为107-109Cells/mL。
上述的药物组合物中，其中，药物组合物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、散剂、混悬剂、口服液或灌肠剂。
优选地，所述药物组合物通过口服或灌肠的形式给药。
上述的药物组合物，其中，所述药物组合物的给药周期为间歇给药、周期性给药、持续给药或长期给药。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过不同的动物腹泻模型试验证明，脆弱拟杆菌，特别是保藏编号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312裂解液、灭活菌液、灭火菌粉，具有改善和治疗感染性腹泻和非感染性腹泻的作用。本发明提供的形态完整的脆弱拟杆菌灭活菌粉在不同浓度配方下，对改善感染性腹泻和非感染性腹泻效果好且对机体没有副作用，具有很好的食用和应用前景。
附图说明
图1为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312厌氧培养后菌落形态图；
图2为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312革兰氏染色镜检图；
图3为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312灭活菌粉的透射电子显微镜图。
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2015年4月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏。分类命名：脆弱拟杆菌ZY-312(bacteroides fragilis ZY-312)，保藏编号CGMCC No.10685。脆弱拟杆菌ZY-312由本发明申请单位自行分离获得，并且已经在授权专利保护(专利号201510459408.X)，按照专利审查指南的规定，公众能够从商业渠道买到或已经授权，不用保藏，即不用提供保藏证明。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
以下实施例和对比例中，如无特殊说明，均采用本领域已知的方法发酵培养脆弱拟杆菌，其中，脆弱拟杆菌的保藏号为CGMCC NO.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
实施例1脆弱拟杆菌的发酵培养
将脆弱拟杆菌ZY-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。
菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1～3mm之间，参见图1。
显微镜下形态：脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。
选取单个菌落接种于培养基中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌ZY-312菌泥。
实施例2样品制备
一、脆弱拟杆菌活菌液、裂解液及灭活菌液的制备
(1)增菌：从实施例1厌氧培养的菌落中选取单个菌落接种于TSB(胰蛋白胨大豆肉汤，含5％胎牛血清)中进行增菌发酵培养，所得菌液保存备用。
(2)脆弱拟杆菌活菌液：将步骤(1)制备的菌液，用麦氏比浊管做菌数测定，用生理盐水稀释至106CFU/mL，107CFU/mL，108CFU/mL，109CFU/mL和1010CFU/mL，保存备用。
(3)脆弱拟杆菌裂解液：通过超声破碎的方法制备脆弱拟杆菌裂解液。具体步骤：采用步骤(2)制备的脆弱拟杆菌活菌液5mL，经超声仪裂解30min，On 10秒，Off 10秒，该体系裂解菌体效率达到99％，裂解后经6000rpm、10min、4℃离心，过滤后备用。
(4)脆弱拟杆菌灭活菌液：采用高温或紫外照射的方法制备脆弱拟杆菌灭活菌液。具体步骤：分别取步骤(2)制备的107Cells/mL，109Cells/mL的脆弱拟杆菌活菌液5mL置于烧杯中，并将盛有菌液的烧杯置于100℃的恒温水浴锅中20～30min或置于紫外线环境30～60min，便可制备脆弱拟杆菌灭活菌液。
二、脆弱拟杆菌灭活菌粉的制备
(1)取实施例1制得的脆弱拟杆菌发酵液，对发酵液进行离心处理，收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:(10～30)(m:v)比例加入生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心收集洗涤后的菌体。m代表质量，v代表体积。
(2)对步骤(1)所得菌体加入5％麦芽糊精+0.9％氯化钠混合成的赋形剂，按菌体：赋形剂＝1:(5～15)(m:m)比例进行添加，搅拌分散后在(70～100)±5℃热灭活(20～40)±5分钟后离心，收集菌泥。
(3)在步骤(2)收集的灭活菌泥中加入赋形剂使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌粉原液。
(4)将步骤(3)所得的灭活菌粉原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3h后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉，菌粉的菌数达到1×1011Cells/g以上。由图3镜检图可以看出，制备的灭活菌粉中的菌体形态完整。
用以上同样的方法制得NCTC 9343灭活菌粉。
本实施例制备的灭火菌粉用于以下实施例。
实施例3脆弱拟杆菌灭活菌粉对番泻叶致腹泻小鼠的影响
一、实验方法
本实施例选用60只SPF级昆明小鼠进行实验，雌雄各半，体重18～22g，每只实验用小鼠均分配有一个唯一编号。在对动物进行分组之前，应在鼠笼的标签上标注项目编号、种属/品系、性别、笼号及动物号。使用BioBook软件根据小鼠的初始体重和性别进行随机分组，分为6组，即空白组(group 1)，模型组(group 2)，阳性对照组(group 3，0.0030g/mL硫酸阿托品溶液)，低(group 4)、中(group 5)、高(group 6)剂量实施例2获得的脆弱拟杆菌灭活菌粉组，每组小鼠10只。
番泻叶溶液的制备：称取番泻叶加水煮沸约10min，过滤，滤液减压浓缩1.33g/mL的药液。
番泻叶腹泻模型造模：番泻叶给药前4h开始禁食，自由饮水，10只小鼠(空白组)灌胃等量生理盐水，其余50只小鼠均按15μL/g体重灌胃给予1.33g/mL的番泻叶药液，每天2次，连续4天。造模结束后将50只造模小鼠再随机分为相应组别。
给药方案：除空白组(group 1)和模型组(group 2)灌胃给予等量生理盐水外，其余各组按10μl/g体重分别进行单次灌胃给予相应药物(约0.2mL)，连续给药治疗7天。治疗结束后，将小鼠置于垫有滤纸的小鼠笼内，每笼1只，每隔1h换一次滤纸，连续观察5h，记录每只小鼠每1h内的稀便数、总便数，并计算稀便率、稀便级和腹泻指数。
小鼠大便可分为5种：正常便、外形正常但含水分多、外形不正常的软便、水样便及黏液便。将前2种视为正常便，后3种为腹泻便。干便与稀便以滤纸上有无污迹为区别标准。粪便次数以每粒或每堆(不能分清粒数者)为1次。
腹泻指数＝稀便率×稀便级。其中，稀便率为每只小鼠所排稀便数与总便数之比。稀便级为以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小定级，分为4级：小于1cm为l级，1～1.9cm为2级，2～3cm为3级，大于3cm为4级。
统计时先逐个统计每一堆湿便的级数，然后将该鼠所有稀便级数相加除以稀便次数，得到稀便的平均级数即稀便级。级数直径的测量：粪便性状为圆形则直接测量直径，若粪便性状为椭圆形则测量最长的和近似圆形的直径，二者相加再除以2。
具体实验分组和给药方案见表1。
表1脆弱拟杆菌灭活菌粉对番泻叶致泻小鼠的影响实验分组和给药方案
Figure BDA0003488772060000081
二、实验结果
表2脆弱拟杆菌灭活菌粉对番泻叶致泻小鼠的影响
Figure BDA0003488772060000082
注:与模型组比较，**P<0.01,*P<0.05。
结果如表2所示，阳性对照组、脆弱拟杆菌灭活菌粉各剂量组腹泻指数均极显著低于模型组(P＜0.01)。说明本发明提供的脆弱拟杆菌灭活菌粉可有效改善小鼠腹泻症状，且存在剂量效应。
实施例4脆弱拟杆菌对番泻叶致腹泻小鼠的影响
一、实验方法
同实施例3。不同的是70只SPF级昆明小鼠，随机分为7组，即空白组(group 1)，模型组(group 2)，阳性对照组(group 3，4mg/kg易蒙停)，脆弱拟杆菌活菌液(group 4)、裂解液(group 5)、灭活菌液(group 6)和灭活菌粉(group 7)组，每组小鼠10只。番泻叶连续灌胃造模4天后，进行脆弱拟杆菌治疗，每天上、下午各一次，连续治疗4天。每天观察小鼠行为表征、临床症状等，重点观察腹泻情况并记录。治疗结束后解剖小鼠，进行病理观察。
具体实验分组和给药方案见表3。
表3脆弱拟杆菌对番泻叶致泻小鼠的影响实验分组和给药方案
Figure BDA0003488772060000091
二、实验结果
表4脆弱拟杆菌治疗后各组的软便动物数/动物总数的变化结果
Figure BDA0003488772060000092
注:与模型组比较，*P<0.05。
如表4所示，阳性对照组(易蒙停)在治疗第2天就表现出显著疗效(P＜0.05)，在第3天完全治愈；而脆弱拟杆菌活菌液、裂解液、灭活菌液、灭活菌粉组在第3天表现出显著疗效(P＜0.05)，在第5天基本可完全治愈。说明本发明提供的脆弱拟杆菌活菌液、裂解液、灭活菌液、灭活菌粉均具有明显改善小鼠腹泻症状的作用。
实施例5脆弱拟杆菌灭活菌粉对硫酸镁致腹泻小鼠的影响
一、实验方法
试验分组及方法同实施例3，不同的是小鼠灌胃给予0.8g/mL硫酸镁溶液造模。具体实验分组和给药方案见表5。
表5脆弱拟杆菌灭活菌粉对硫酸镁致泻小鼠的影响实验分组和给药方案
Figure BDA0003488772060000101
二、实验结果
表6脆弱拟杆菌灭活菌粉对硫酸镁致泻小鼠的影响
Figure BDA0003488772060000102
注:与模型组比较，**P<0.01,*P<0.05。
实验结果表明，阳性对照组、脆弱拟杆菌灭活菌粉各剂量组腹泻指数均极显著低于模型组(P＜0.05)。说明本发明提供的脆弱拟杆菌灭活菌粉可有效改善小鼠腹泻症状，并存在剂量效应。
实施例6脆弱拟杆菌灭活菌粉对大肠埃希菌致腹泻小鼠的影响
一、实验方法
(1)菌液的制备
保存于斜面的大肠埃希菌接种于营养琼脂平板，37℃培养24h，再挑取数个菌落接种于MH肉汤，37℃培养24h，用灭菌生理盐水稀释，以0.5麦氏比浊管比浊，调其含菌量为3×108CFU/mL。
(2)对大肠埃希菌腹泻模型小鼠的治疗试验
通过腹腔注射0.2mL含菌量为1×108CFU/mL的大肠埃希菌菌液致小鼠腹泻。阳性对照组为灌胃给药0.01g/mL盐酸小檗碱水溶液，试验分组及方法同实施例3，连续观察5h，记录小鼠腹泻指数。具体实验分组和给药方案见表7。
表7脆弱拟杆菌灭活菌粉对大肠埃希菌致泻小鼠的影响实验分组和给药方案
Figure BDA0003488772060000111
二、实验结果
表8脆弱拟杆菌灭活菌粉对大肠埃希菌致泻小鼠的影响
Figure BDA0003488772060000121
注:与模型组比较，**P<0.01,*P<0.05。
表8结果显示，阳性对照组、脆弱拟杆菌灭活菌粉各剂量组腹泻指数均明显低于模型组(P＜0.01)，说明本发明提供的脆弱拟杆菌灭活菌粉可有效改善腹泻症状，且存在剂量效应。
实施例7脆弱拟杆菌灭活菌粉对抗生素致腹泻大鼠的影响
用三种抗生素(克林霉素、氨苄西林、链霉素)质量比1∶1∶1联用构建抗生素相关性腹泻模型，随后分别用1×109Cells/ml的NCTC 9343灭活菌粉混悬液和1×109Cells/ml的脆弱拟杆菌灭活菌粉混悬液(实施例2制备)进行治疗，观察脆弱拟杆菌灭活菌粉的疗效。
一、实验方法
选取7-8周龄，体重200～250g的雌性SD大鼠50只，随机分为5组，即空白组(group1)，模型组(group 2)，阳性对照组(group 3，易蒙停1.5mg/kg)、NCTC 9343灭活菌粉组(group 4，2×109Cells/只)和脆弱拟杆菌灭活菌粉组(group 5，2×109Cells/只)，每组10只。
各组动物腹腔注射给予180mg/mL的三联抗生素溶液0.2mL，空白组注射等量生理盐水，每天1次，连续7天；第8天相应组动物分别灌胃(0.1mL/10g体重)生理盐水、易蒙停混悬液、1×109Cells/ml的NCTC 9343灭活菌粉和脆弱拟杆菌灭活菌粉混悬液，每天2次，上下午各一次，连续7天。每天观察大鼠行为表征、临床症状等。治疗结束后解剖大鼠，进行病理观察。
分别在第7天下午(造模结束)、第14天下午(试验结束)采用单笼收集4h内每只大鼠的粪便，并称湿重，然后放置80℃烘箱3h将粪便烘干后称干重并记录。按公式计算：粪便含水量(％)＝(粪便湿重－粪便干重)/粪便湿重×100。
具体实验分组和给药方案见表9。
表9脆弱拟杆菌灭活菌粉对抗生素致腹泻大鼠的影响实验分组和给药方案
Figure BDA0003488772060000131
二、实验结果
表10脆弱拟杆菌灭活菌粉对抗生素致腹泻大鼠的影响
Figure BDA0003488772060000132
注:与模型组比较，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。
表10结果显示，脆弱拟杆菌灭活菌粉组粪便含水量与阳性对照组相当，均极显著低于模型组(P＜0.001)，而NCTC 9343灭活菌粉组粪便含水量较高，但也显著低于模型组(P＜0.05)，说明本发明提供的脆弱拟杆菌灭活菌粉可有效改善抗生素相关性腹泻症状，且疗效强度与易蒙停相当，均优于NCTC 9343灭活菌粉。
实施例8脆弱拟杆菌灭活菌粉对艰难梭菌致小鼠腹泻的影响
用克林霉素腹腔注射联合艰难梭菌灌胃构建艰难梭菌性腹泻模型，随后分别用1×109Cells/ml的NCTC 9343灭活菌粉混悬液和1×109Cells/ml的脆弱拟杆菌灭活菌粉混悬液(实施例2制备)进行治疗，观察脆弱拟杆菌灭活菌粉的疗效。
一、实验方法
1.菌液的制备
保存于斜面的艰难梭菌接种于CCFA琼脂平板上，37℃，厌氧气体混合物(80％N2-10％CO2-10％H2)培养箱中培养72h，再挑取数个菌落接种于CCFA肉汤中，37℃培养72h，用灭菌生理盐水稀释，以0.5麦氏比浊管比浊，调其含菌量为3×108CFU/mL。
2.对艰难梭菌腹泻模型小鼠的治疗试验
选取6-8周龄，体重18～22g的雌性C57BL/6小鼠50只，随机分为5组，即空白组(group1)，模型组(group 2)，阳性对照组(group 3，易蒙停4mg/kg)、NCTC 9343灭活菌粉组(group 4，2×109Cells/只)和脆弱拟杆菌灭活菌粉组(group 5，2×109Cells/只)，每组10只。
各组动物腹腔注射给予100mg/kg的克林霉素溶液，空白组注射等量(0.1mL/10g体重)生理盐水，每天1次，连续3天；第4天灌胃给予3×108CFU/mL艰难梭菌菌液，每天1次，连续7天；第11天相应组动物分别灌胃(0.1mL/10g体重)生理盐水、易蒙停混悬液、1×109Cells/ml的NCTC 9343灭活菌粉混悬液和脆弱拟杆菌灭活菌粉混悬液，每天2次，上下午各一次，连续7天。
每天观察小鼠行为表征、临床症状等。每天记录各只小鼠的腹泻情况，腹泻的评分标准参照Kurita A等研究中的腹泻评分方法。0分：大便正常或没有；1分：轻度腹泻，大便可见轻微湿软；2分：中度腹泻，大便较湿且不成形，并且有轻度的肛周着色；3分：重度腹泻，水样便并伴有重度肛周着色(参考Kurita A,Kado S,Kaneda N,et al.Modified irinotecanhydrochloride(CPT-11)administration schedule improves induetion of delayed-onset diarrhea in rats[J].Cancer Chem other Pharmacol,2000,46(3):211-220))。
治疗结束，第18天上午安乐死后解剖小鼠，进行病理观察。病理评分标准如下(参考Talamisu TSUKAHARA,Yoshie IWASAKI,Keizo NAKAYAMA et al.Microscopicstructure of the large intestinal mucosa in piglets during an antibiotic-associated diarrhea[J].vet.Med.Sci,2003,65(3):301-306.)：
(1)水肿
0分：无水肿。
1分：只有少量(＜2X)多发性黏膜下扩张的轻微性水肿。
2分：中量(2～3X)多发性黏膜下扩张的中度水肿。
3分：大量(＞3X)多发性黏膜下扩张的重度水肿。
4分：弥漫性黏膜下扩张的重度水肿。
(2)炎性细胞浸润
0分：无炎症。
1分：少量多灶性中性粒细胞浸润。
2分：中度多灶性中性粒细胞浸润(累及更多的黏膜下层)。
3分：大量多灶性甚至聚集性中性粒细胞浸润(累及更多的黏膜下层及肌层)。
4分：病灶累及同3分，但出现了脓肿或更广泛的肌层受累。
(3)肠上皮损伤
0分：无肠上皮损伤改变。
1分：少量多灶性浅表上皮损伤(空泡出现，个别细胞凋亡，绒毛顶端衰减/坏死)。
2分：中量多灶性浅表上皮损伤(空泡出现，个别细胞凋亡，绒毛顶端衰减/坏死)。
3分：大量多灶性上皮损伤空泡出现，个别细胞凋亡，绒毛顶端衰减/坏死)±伪膜形成(管腔内有含中性粒细胞，脱落上皮的纤维性渗出)。
4分：在3分基础上出现更明显的伪膜或者上皮溃疡(病灶处上皮完全性脱落)。
二、实验结果
表11脆弱拟杆菌灭活菌粉对艰难梭菌致小鼠腹泻评分的影响
Figure BDA0003488772060000151
注:与模型组比较，**P<0.01,*P<0.05。
表12脆弱拟杆菌灭活菌粉对艰难梭菌致腹泻小鼠病理评分变化的影响
Figure BDA0003488772060000152
Figure BDA0003488772060000161
注:与模型组比较，**P<0.01,*P<0.05。
表11和表12结果显示，阳性对照组和脆弱拟杆菌灭活菌粉组腹泻评分和病理评分均显著低于模型组(P＜0.01)，而NCTC 9343灭活菌粉组腹泻评分和病理评分均较高，但也显著低于模型组(P＜0.05)，说明本发明提供的脆弱拟杆菌灭活菌粉可有效改善艰难梭菌感染性腹泻症状，且疗效较强，优于NCTC 9343灭活菌粉。
实施例9脆弱拟杆菌对高乳糖致小鼠慢性腹泻的影响
用高乳糖饲料喂养Wistar大鼠21天，构建慢性腹泻模型，随后分别用实施例2制备的脆弱拟杆菌活菌液、裂解液、灭活菌液及灭活菌粉进行治疗，观察脆弱拟杆菌对慢性腹泻的疗效。
一、实验方法
1.饲料的制备
饲料按AOAC推荐配方进行配制(参考：The Official Mehods of Analysis ofthe AOAC.14th ed.US,1984,877)，具体如表13所示。
表13饲料各成分含量(％)
Figure BDA0003488772060000162
注：a表示1kg基础饲料含：维生素A(干、稳定)20000IU，维生素D(干、稳定)2000IU，维生素E(干、稳定)100IU，维生素K 5mg，胆碱2000mg，肌醇100mg，对氨基苯甲酸100mg，尼克酸40mg.泛酸钙40mg，维生素B1 5mg，维生素B2 8mg，维生素B6 5mg，维生素B12 0.03mg，叶酸2mg，生物素0.4mg。
b表示1kg基础饲料含：KH2PO4 194.5g，CaCO3 190.7g，NaCl 69.6g，MgSO4 28.65g，FeSO4 ·7H2O 13.5g，MnSO4·H2O 2.05g，KI 0.395g，ZnSO4·7H2O 0.274g，CuSO4·5H2O0.239g，CoCl2·6H2O 0.012g。
2.对高乳糖致慢性腹泻小鼠的治疗试验
选取3～4周龄的SPF级Wistar幼龄大鼠80只，雌雄各半，适应性喂养1周后，大鼠予单笼饲养，笼底垫滤纸和铁架。随机分为2组，即空白组(group 1，10只)和造模组(70只)，对照组幼鼠予基础饲料喂养，造模组予高乳糖饲料喂养。21天后造得慢性腹泻模型，将60只慢性腹泻幼龄大鼠随机分为模型组(group 2)，自由恢复组(group 3)，阳性对照组(group 4，300mg/kg整肠生)和脆弱拟杆菌活菌液(group 5)、裂解液(group 6)、灭活菌液(group 7)和灭活菌粉(group 8)组，每组小鼠10只。第22天按组别进行灌胃给药(0.1mL/10g体重)，每天2次，上下午各一次，连续14天。每天观察小鼠行为表征、临床症状等，重点观察腹泻情况并记录。第35天麻醉后进行腹主动脉取血并解剖大鼠，进行病理观察。
具体实验分组和给药方案见表14。
表14脆弱拟杆菌对高乳糖致慢性腹泻大鼠的影响实验分组和给药方案
Figure BDA0003488772060000171
同实施例3，每天观察小鼠行为表征、临床症状等，并记录各只Wistar大鼠的腹泻情况与评分，实验结束后检测血清IL-6水平。
二、实验结果
表15脆弱拟杆菌对高乳糖致慢性腹泻Wistar大鼠体重与腹泻评分的影响
Figure BDA0003488772060000172
Figure BDA0003488772060000181
注:与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
表16脆弱拟杆菌对高乳糖致慢性腹泻Wistar大鼠血清IL-6的影响
Figure BDA0003488772060000182
注:与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
表15和表16结果显示，试验结束后，阳性对照组和脆弱拟杆菌各组的大鼠体重均显著高于模型组、腹泻评分和血清IL-6含量均显著低于模型组(P＜0.01)，说明本发明提供的脆弱拟杆菌可有效改善慢性腹泻症状，机制可能与降低促炎因子IL-6的表达有关；同时发现，脆弱拟杆菌各组体重、腹泻评分及IL-6含量与阳性组比较均无显著性差异，说明本发明提供的脆弱拟杆菌治疗慢性腹泻的疗效与整肠生(地衣芽孢杆菌活菌胶囊)相当。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.脆弱拟杆菌在制备改善和/或治疗腹泻的组合物中的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为活菌或灭活菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌选自保藏编号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述腹泻为感染性腹泻或非感染性腹泻；
优选的，所述感染性腹泻为病毒感染性腹泻、细菌感染性腹泻和寄生虫感染性腹泻中的一种或多种；和/或，所述非感染性腹泻为非感染性炎症腹泻、肿瘤性腹泻、吸收不良性腹泻、运动性腹泻、肠道菌群失调相关性腹泻和药物相关性腹泻中的一种或多种；
进一步优选的，
所述细菌感染为沙门菌属、志贺菌属、弯曲杆菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、产毒性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、致泻性大肠埃希菌等中的一种或多种；
所述吸收不良性腹泻为继发性小肠吸收不良性腹泻；更进一步优选的，所述继发性小肠吸收不良性腹泻为消化不良性腹泻，更进一步优选的，所述消化不良性腹泻为乳糖吸收不良性腹泻；
所述肠道菌群失调相关腹泻为艰难梭菌失调相关性腹泻；
所述药物相关性腹泻中的药物为泻药(酚酞、番泻叶、蓖麻油等)、高渗性药(硫酸镁、硫酸钠等)、抗生素(青霉素类、头孢菌素类、林可霉素、克林霉素等)、化疗药(表柔比星、多西他赛、氟尿嘧啶、羟基喜树碱等)、抗高血压药(普萘洛尔、利血平、甲基多巴等)、抗心律失常药(强心苷类、奎尼丁等)、利尿药(呋塞米、依他尼酸等)、降脂药(氯贝丁酯、考来烯胺等)中的一种或多种；更进一步优选的，所述药物为泻药、高渗性药和抗生素中的一种或多种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为形态完整的灭活菌和/或形态不完整的灭活菌；
优选为形态完整的灭活菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌是通过干热、湿热、过滤、有机溶剂、化学试剂、紫外或红外射线、发酵、冻干、基因重组、基因修饰或改造的方法中的任意一种或多种灭活的。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌灭活菌粉，所述脆弱拟杆菌灭活菌粉经过发酵培养、氯化钠水溶液洗涤与离心、加入赋形剂重悬、灭活和干燥步骤制备得到。
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述组合物可以是药物组合物、食品、保健品或食品添加剂中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物含有药学有效剂量的权利要求6所述的脆弱拟杆菌灭活菌粉。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药学有效剂量为107-109Cells/mL。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、散剂、混悬剂、口服液或灌肠剂；
优选的，所述药物组合物通过口服或灌肠的形式给药；
优选的，所述药物组合物的给药周期为间歇给药、周期性给药、持续给药或长期给药。
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