CN114164134A - 具有预防及缓解结肠炎症状的长双歧杆菌长亚种及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株具有预防及缓解结肠炎症状的长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.Longum KLDS K5，属于微生物技术领域。实验表明，本发明提供的长双歧杆菌能耐受人体胃肠环境，缓解溃疡性结肠炎患病期间体重减轻，改善结肠粘膜损伤，降低MPO活性，通过iNOS，COX‑2信号通路抑制与氧化相关因子从而缓解炎症性肠病；通过TLR4/MyD88/NF‑κB信号通路抑制NF‑κB p65核转移，减少结肠中促炎因子TNF‑α，IL‑1β，IL‑6，IL‑10的表达量，上调结肠紧密连接相关蛋白Claudin‑1、ZO‑1、和Occludin以及黏蛋白MUC2的转录水平，能够在属水平改善DSS诱导后肠道菌群变化，提高肠道菌群丰富度和多样性。

Description

具有预防及缓解结肠炎症状的长双歧杆菌长亚种及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有预防及缓解结肠炎症状的长双歧杆菌长亚种及其应用。

背景技术

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种主要累积结直肠、回肠的慢性、非特异性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD)，临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便。目前其发病机制尚不完全明确，倾向于是由遗传、饮食、环境等因素作用于遗传易感的宿主触发异常免疫反应导致肠道慢性炎症。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是IBD的一种表现形式，病因不明，主要表现为直肠和结肠的非特异性炎症，以血性腹泻、贫血和腹痛为主要症状。UC是结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症，通常由直肠开始向全直肠蔓延。UC的病程长，容易复发，在降低患者生活质量的同时，还增加患者罹患肠癌的几率。

随着UC在中国发病率的增加，氨基水杨酸、激素和免疫抑制剂等治疗UC的常用药物副作用大且成本昂贵，虽可暂时有效控制疾病活动，但并不能长期大量使用。大多数研究认为，宿主免疫系统与肠道菌群的相互作用是UC发生发展的关键因素之一。所以调节肠道菌群和恢复宿主与肠道菌群之间的体内平衡成为UC治疗的新方向。现已发现益生菌在肠道健康、免疫发育、营养代谢等方面功效显著。益生菌现已广泛应用于多种胃肠道疾病疾病，在呼吸道、泌尿道、生殖道及自身免疫性疾病也发挥出潜在有益作用。

双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物。双歧杆菌作为一种生理性有益菌，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。出生一周的婴儿肠道双歧杆菌含量可达肠道菌群的90％以上，成人肠道中双歧杆菌含量只占肠道菌群的3％-10％，而且，双歧杆菌婴儿肠道和成人肠道中菌种组成差异也较大。对双歧杆菌进行精确鉴定到亚种，发现了长双歧杆菌长亚种，长双歧杆菌长亚种的研究表明不同人源肠道中长双歧杆菌长亚种基因型差异较大，存在基因多态性。因此基于现状，从健康婴儿肠道分离出来具有预防及缓解结肠炎性状的长双歧杆菌长亚种具有非常重要的现实意义及应用价值

发明内容

本发明提供了一株预防和缓解溃疡性结肠炎的长双歧杆菌长亚种，通过用该菌干预DSS诱导的小鼠结肠炎模型，判断其初步预防及缓解效果。

本发明提供了一株预防和缓解溃疡性结肠炎的长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.Longum)KLDS K5，保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号为CCTCC M 20211225，保藏日期2021年9月26日。

所述长双歧杆菌长亚种分离自0-6月健康婴儿肠道，该菌株进行基因测序后，菌株的16s rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，通过NCBI基因数据库进行BLAST核酸序列对比，结果表明该菌株为长双歧杆菌，并命名为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longumsubsp.Longum)KLDS K5。

所述长双歧杆菌在MRS培养基中菌落突起，形态圆形，边缘整齐，奶油白色，不透明，表面湿润光滑，直径为1～2mm。

本发明还提供了长双歧杆菌的培养方法，包括以下步骤:将低温保存的菌株于mMRS液体培养基中进行活化三代恢复活力，每代厌氧培养24h，37℃下厌氧条件扩大培养。

进一步，mMRS培养基配方：培养基蛋白胨5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，硫酸锰0.25g/L，硫酸镁0.58g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，吐温-80 1.0g/L，牛肉膏5.0g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L；mMRS琼脂培养基配方：向mMRS培养基添加1.6％琼脂。

进一步，所述的所有操作均在无菌操作台中进行，保持无菌环境。

本发明还提供了一种具有预防及缓解结肠炎症状的产品，包括长双歧杆菌长亚种KLDS K5。进一步的，所述产品可以是复合菌剂，包括其他双歧杆菌。

本发明所述长双歧杆菌长亚种还可以制备预防及缓解结肠炎药物，实验结果表明，所述长双歧杆菌长亚种可以降低髓过氧化物酶(MPO)的活性、环氧化酶(COX-2)的活性或PEG2的活性。

本发明的有益效果：

本发明提供的长双歧杆菌长亚种能耐受人体胃肠环境，缓解溃疡性结肠炎患病期间体重减轻，改善粪便性状和便血情况，改善结肠粘膜损伤，降低MPO活性，通过iNOS，COX-2信号通路抑制与氧化相关因子从而缓解炎症性肠病；可以有效地减少COX-2的mRNA表达量以及PGE2浓度；通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制NF-κB p65核转移，减少结肠中促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，上调结肠紧密连接相关蛋白Claudin-1、ZO-1、和Occludin以及黏蛋白MUC2的转录水平，能够在属水平改善DSS诱导后肠道菌群变化，提高肠道菌群丰富度和多样性。

附图说明

图1：不同组别小鼠造模期间体重变化和DAI评分。A小鼠体重变化；B小鼠DAI评分。

图2：不同组别小鼠结肠长度变化

图3：不同组别小鼠结肠组织内髓过氧化物酶MPO的活性

图4：不同组别小鼠结肠组织内环氧化酶COX-2的mRNA表达量、前列腺素PGE-2的含量

图5：结肠组织切片HE染色(放大倍数×100)

图6：HE评分

图7：结肠组织切片AB染色(放大倍数×100)

图8：不同组别小鼠结肠组织内MUC2蛋白的表达量

图9：不同组别小鼠结肠组织内ZO-1蛋白、Occludin蛋白、claudin-1蛋白

图10:不同组别小鼠结肠组织内ZO-1和MUC 2的表达水平

图11：不同组别小鼠结肠组织内细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA、IL-10mRNA的表达量。

图12：不同组别小鼠肠道微生物在门水平上的组成

图13：不同组别小鼠肠道微生物在属水平上的组成

图14：不同组别小鼠结肠组织通路分析图((A)DSS-Control，(B)K5-DSS，(C)K15-DSS。代谢通路分析的结果以矩形树图进行展示。矩形树图中每一个方块代表一个代谢通路，方块大小表示该通路在拓扑分析中的影响因子大小，大小越大影响因子越大；方块颜色表示富集分析的P值，颜色越深P值越小，富集程度越显著。)

图15：差异代谢物与相对丰度前30的菌种相关性热图。

图16：不同组别小鼠结肠组织iNOS，COX-2通路中相关基因蛋白表达量

图17：不同组别小鼠结肠组织NF-κB通路关键蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65基因表达量。

图18：不同组别小鼠结肠组织NLRP3通路中相关基因蛋白表达量

本申请中“Control”为空白组，“DSS”为葡聚糖硫酸钠组(模型组)，“K5”为长双歧杆菌长亚种KLDS K5组，“K15”为长双歧杆菌K15组，“BB12”为乳双歧杆菌BB12组。不同字母代表在p<0.05水平具有显著差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的小鼠为7周龄雄性SPF(Specific pathogen free，无特定病原体)级C57BL/6J小鼠，购自北京维生河动物科技有限公司；下述实施例中涉及的MPO检测试剂盒购自南京建成有限公司；下述实施例中ELISA试剂盒购自福建科诺迪生物科技有限公司；下述实施例中涉及的RNAisoPlus试剂盒购自南京诺唯赞有限公司；下述实施例中涉及的引物来自上海生工生物技术有限公司。

实施例1：长双歧杆菌长亚种KLDS K5的筛选、鉴定、培养、观察和保存

1、筛选

取1g来源于哈尔滨地区的健康婴儿粪便样本，梯度稀释后涂布于MRS固体培养基(含快速筛选)中，置于37℃厌氧环境中培养72h，观察并记录菌落形态；挑取表面湿润、有凸起的、白色泛黄的菌落在MRS固体培养基上划线，于37℃厌氧的条件下进行纯化培养，重复此操作3次，获得纯化后的单菌落；挑取单菌落在MRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养36h。

2、鉴定

提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16S rDNA进行扩增和测序(扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的序列在NCBI-Blast中进行核酸序列比对，结果显示菌株为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.Longum)；将菌株的hsp60基因扩增和测序，扩增得到hsp60，如SEQ ID NO:2所示，将测序结果在NCBI进行BLAST比对，与数据库中已知菌株的hsp60基因序列进行对比，结合16S rDNA结果判断该菌株为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.Longum)，命名为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.Longum)KLDS K5。

3、培养和观察

挑取长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.Longum)KLDS K5的单菌落接入MRS固体培养基上，37℃培养48h后，观察长双歧杆菌长亚种KLDS K5在mMRS固体培养基上的菌落特征。观察可得，长双歧杆菌长亚种KLDS K5在MRS固体培养基上的菌落突起，形态圆形，边缘整齐，奶油白色，不透明，表面湿润光滑，直径为1～2mm。

4、保存

挑取长双歧杆菌长亚种KLDS K5的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃厌氧的条件下培养24h，得到菌液；在所得菌液中加入灭菌后的40％(v/v)甘油混匀后-80℃保存于甘油管中。同时，将所述长双歧杆菌长亚种KLDS K5保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号为CCTCC M 20211225，保藏日期2021年9月26日。

实施例2

长双歧杆菌长亚种KLDS K5对DSS诱导结肠炎小鼠结肠组织的保护作用：

(1)配制3％的DSS溶液：将葡聚糖硫酸钠(DSS)用灭菌自来水配成浓度为3％(w/v)的DSS溶液。

(2)取C57BL/6J小鼠40只(SPF级，雄性，7周龄，22-24g)，由北京维生河实验动物科技有限公司提供。所有小鼠均在实验前适应7天。小鼠在东北农业大学(哈尔滨)标准温度(20℃±2℃)、湿度(50％±5％)、光周期(12h/12h光照/黑暗周期)条件下的笼中饲养。实验期为22天

(3)所有小鼠随机分为4组，每组10只，分别为空白对照组、造模组(DSS)、长亚种KLDS K5干预组和BB-12组，如表1所示。所有小鼠从第-6天至第0天自由吃喝。长亚种KLDSK5干预组和BB-12组小鼠分别口服200μl(5×10⁹CFU/mL)的长双歧杆菌长亚种KLDS K5和双歧杆菌BB-12，从第1天至第21天，每日1次用脱脂牛奶重悬。空白对照组和DSS组小鼠从第1天至第21天分别灌胃脱脂乳200μl，每日1次。除空白对照组外，其余小鼠均于第15～21天灌服3％(w/v)DSS溶液。

表1动物分组及处理方法

(4)在建模期间，每天测定小数的体重变化，其结果如图1A所示。在建模期间，小鼠体重在第4天出现下降趋势，与空白组相比，DSS组小鼠体重显著降低(p<0.05)，下降了14.08％，KLDS K5干预后小鼠体重显著(p<0.05)提高了DSS引起的体重下降，下降率为7.89％，B.longum K15和BB12干预后小鼠体重下降率分别为12.47％,和11.67％。

在建模期间，小鼠在第4天开始精神萎靡，食欲不振，粪便形态依旧成形，第5天开始小鼠的粪便较松散，第6天开始小鼠粪便出现因血现象，图1B为小鼠建模第七天DAI的结果，与空白组相比，DSS组小鼠DAI显著降低(p<0.05)，所有菌株均能显著(p<0.05)缓解DSS引起的DAI上调，其中，KLDS K5干预后小鼠的DAI显著(p<0.05)低于对照菌株BB12组的DAI。

(5)结肠长度的检测方法：小鼠处死后，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量长度。

小鼠结肠长度如图2所示，与空白组(6.90cm)相比，DSS组小鼠结肠长度(4.89cm)显著降低(p<0.05)，B.longum K15处理后小鼠的结肠长度与DSS组小鼠结肠长度无显著性差异(p>0.05)。KLDS K5和BB12处理后能有显著(p<0.05)增加小鼠的结肠长度，值得注意的是，KLDS K5处理后小鼠的结肠长度显著(p<0.05)高于BB12处理组。

因此，本发明的长双歧杆菌长亚种KLDS K5对DSS诱导的结肠炎小鼠具有较好的改善效果。

(6)新鲜结肠标本用生理盐水(w/v＝1:19)匀浆，制备5％的组织匀浆。检测结肠组织的髓过氧化物酶(MPO)的活性(检测结果见图3)、环氧化酶(COX-2)的活性以及PEG2的活性(检测结果见图4)。

不同试验组小鼠结肠的MPO活性如图3所示，与空白组相比，DSS刺激后小鼠结肠中的MPO活性显著(p<0.05)升高，所有受试双歧杆菌能显著(p<0.05)降低DSS刺激后小鼠结肠组织的MPO活性，值得注意的是，KLDS K5处理后小鼠的MPO活性(p<0.05)低于对照菌株BB12处理组。

不同试验组小鼠的COX-2的mRNA表达量如图4A所示，与空白组相比，DSS组小鼠的COX-2的mRNA表达水平显著(p<0.05)升高，所有受试双歧杆菌均能显著(p<0.05)降低DSS引起的COX-2的mRNA表达水平上调，值得注意的是，KLDS K5处理后小鼠的COX-2的mRNA表达水平显著(p<0.05)低于对照菌株BB12处理组。

COX-2是合成PGE2的酶，不同试验组小鼠的PGE2浓度如图4B所示，与空白组相比，DSS刺激后，小鼠的PGE2浓度显著(p<0.05)升高，所有双歧杆菌处理组均能显著(p<0.05)降低PGE2浓度，该发现与COX-2的mRNA表达水平的结果一致。上述实验结果表明KLDS K5可以有效地减少COX-2的mRNA表达量以及PGE2浓度。

(7)不同试验组小鼠的结肠组织病理学分析结果如图5所示，空白组结肠上皮组织含有大量的杯状细胞，隐窝较深，肠黏膜下层间隙小且均匀，无细胞浸润，且无明显的病理变化，而DSS袭击后的结肠上皮组织杯状细胞大量减少，隐窝极浅，肠黏膜下层间隙明显增加，肠黏膜出现大量坏死现象，出现大量的炎症浸润现象，经受试双歧杆菌处理后，结肠上皮组织均有改善，但B.longum K15仍有大量炎症浸润现象。

对上述现象对比HE评分标准进行核算后的结果如图6所示，与空白组相比，DSS刺激后小鼠结肠组织的HE评分显著(p<0.05)提高，经双歧杆菌处理后，结肠上皮组织均能显著(p<0.05)改善DSS刺激后小鼠结肠组织的HE评分的上调，KLDS K5处理后小鼠的HE评分显著(p<0.05)低于BB12处理组。

因此本发明的菌株长双歧杆菌长亚种KLDS K5对小鼠结肠组织有很好的保护作用。

实施例3

长双歧杆菌长亚种KLDS K5对结肠炎小鼠结肠粘膜屏障的保护作用：

结肠上皮细胞表面的黏蛋白可通过AB染色后，呈现蓝色，对小鼠结肠组织AB的染色结果如图7所示，空白组小鼠结肠黏蛋白含量丰富，而在DSS组小鼠结肠黏蛋白含量明显减少，这一变化在双歧杆菌处理组均得到改善，其中KLDS K5处理后小鼠结肠黏蛋白含量明显增加。

MUC2是黏蛋白的主要成分之一，长双歧杆菌长亚种对结肠组织中MUC2的mRNA表达水平的影响如图8所示，DSS诱导后，小鼠结肠中MUC2的mRNA表达水平显著(p<0.05)比空白组降低，所有受试双歧杆菌均能显著(p<0.05)上调小鼠结肠中MUC2的mRNA表达水平，值得注意的是，KLDS K5干预后，小鼠结肠中MUC2的mRNA表达水平显著(p<0.05)高于对照菌株BB12处理组。

将实施例2中的步骤(3)得到的造模结束后小鼠处死，取结肠组织采用RT-PCR方法检测不同组结肠中紧密连接蛋白ZO-1的表达量(检测结果见图9A)，紧密连接蛋白Occludin的表达量(检测结果见图9B)，紧密连接蛋白claudin-1的表达量(检测结果见图9C)。与空白对照组相比，其结果如图10所示，其结果与之前的研究结果一致，MUC2和ZO-1蛋白的荧光强度在DSS组中明显少于空白组，并且KLDS K5可以明显缓解这一改变。

实施例4

长双歧杆菌长亚种KLDS K5对结肠炎小鼠免疫的调节作用：

具体实施方式同实施例2中的步骤(1)-(3)；

将实施例2中的步骤(3)得到的造模结束后的小鼠处死，取结肠组织采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠结肠中的生化指标包括结肠组织内细胞因子表达(检测结果见图11)。与空白组相比，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6浓度显著(p<0.05)升高，B.longumK15仅能显著(p<0.05)下调促炎因子TNF-α的水平，IL-1β、IL-6的浓度与DSS模型组无显著性差异(p>0.05)，KLDS K5和BB12均能显著(p<0.05)降低DSS刺激后促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度，其中KLDS K5处理后小鼠结肠中的L-1β、IL-6的浓度显著(p<0.05)低于BB12处理组；KLDS K5处理后小鼠结肠中的IL-10的水平显著(p<0.05)高于BB12处理组。上述结果表明，KLDS K5能够有效地降低TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平，并提高IL-10的表达水平。

因此，长双歧杆菌长亚种KLDS K5干预后显著改善了肠道的免疫反应。

实施例5

门水平小鼠结肠内容物菌群结构变化：

将小鼠肠道内容物进行高通量测序分析小鼠肠道菌群结构的变化，肠道微生物在门水平上的结果如图12所示，小鼠肠道菌群中主要成分是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和变形菌门(Proteobacteria)。与空白组相比，DSS组小鼠肠道菌群厚壁菌门的相对丰度明显增加，疣微菌门的相对丰度明显下降，双歧杆菌干预后均可改善这一变化，其中，KLDS K5在门水平上的菌群结构与空白组最为相似。

实施例6

属水平小鼠结肠内容物菌群结构变化：

小鼠肠道微生物在属水平上的结果如图13所示，与空白组相比，DSS诱导后，小鼠肠道菌群中另枝菌属(Alistipes)、拟杆菌属(Bacteroides)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、颤杆菌属(Oscillibacter)的相对丰度增加，这些菌属在KLDS K5处理组中明显降低，而阿克曼氏菌属(Akkermansia)、瘤胃梭菌属(Ruminococcaceae UCG-014)、、Marvinbryantia菌属的相对丰度与空白组比降低，这些菌属在B.longum K5处理组中明显升高。这些菌属的变化可以在B.longum K15和BB12处理后得到部分改善。这一结果表明KLDS K5能够在属水平改善DSS诱导后肠道菌群变化。

实施例7

小鼠结肠内容物差异代谢分析：

利用OPLS-DA模型的VIP值和T-test中P值对差异代谢物进行筛选。本研究根据VIP≥1，T-test p<0.05以及│log2(Fold Change)│>1为条件筛选标志性代谢物，其结果如表2所示。由表可知，与对照组相比，DSS组中碳水化合物类物质：氨基葡萄糖6-硫酸盐，N-乙酰氨基半乳糖乳糖，乳糖-N-二糖I；氨基酸类：酪氨酰苏氨酸，组氨酰谷氨酰胺，L-天门冬氨酸，组氨酰酪氨酸，苯丙氨酰丙氨酸，苯丙氨酰组氨酸；其他：白三烯D4，尿胆素，胆红素物质的丰度上调，而腺苷类：1-甲基腺苷，腺苷；脂质类：LysoPA(18:2(9Z,12Z)/0:0)，LysoPE(15:0/0:0)，氨基酸类：缬氨酰苯丙氨酸，维生素B6代谢物类：吡哆醛，吡哆醇的丰度下调，这种变化在KLDS K5组中得到改善，但是K15组中酪氨酰苏氨酸和白三烯D4的丰度要高于DSS组。

表2差异代谢物分析

注：DSS-Control代表DSS-Control的Fold change取以2为底的对数，K5-DSS代表DSS-Control的Fold change取以2为底的对数，K15-DSS代表DSS-Control的Fold change取以2为底的对数。红色向上箭头代表上调，黑色向下箭头代表下调。

进一步，对差异代谢物通路进行分析，本研究先通过差异代谢物对KEGG、PubChem等权威代谢物数据库进行映射，在取得差异代谢物的匹配信息后，我们对对应物种Musmusculus(mouse)的通路数据库进行搜索和代谢通路分析。代谢通路分析结果如图14所示，DSS组对比空白组主要富集在甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，β-丙氨酸代谢以及组氨酸代谢通路上；KLDS K5组对比DSS组，主要富集在苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成以及苯丙烷代谢通路上，富集的通路中维生素B6代谢虽然富集不如前两个通路显著，但其在拓扑分析中的影响因子很大；K15组对比DSS组，主要富集在苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙烷代谢以及甲烷代谢代谢通路上。

为了进一步分析差异代谢物与小鼠肠道菌群的关系，我们对丰度前30的菌属与差异代谢物进行相关性分析，其结果如图15所示，阿克曼氏菌属(Akkermansia)与吡哆醇(Pyridoxine)、LysoPE(15:0/0:0)、LysoPA(18:2(9Z,12Z)/0:0)、腺苷(Adenosine)、1-甲基腺苷(1-Methyladenosine)显著正相关，与苯丙氨酰丙氨酸(Phenylalanyl-Alanine)、组氨酰酪氨酸(Histidinyl-Tyrosine)、氨基葡萄糖6-硫酸盐(Glucosamine6-sulfate)显著负相关；另枝菌属(Alistipes)及丁酸单胞菌属(Butyricimonas)均与酪氨酰苏氨酸(Tyrosyl-Threonine)、苯丙氨酰丙氨酸(Phenylalanyl-Alanine)、白三烯D4(LeukotrieneD4)、组氨酰酪氨酸(Histidinyl-Tyrosine)显著正相关；拟杆菌属(Bacteroides)与酪氨酰苏氨酸(Tyrosyl-Threonine)、苯丙氨酰丙氨酸(Phenylalanyl-Alanine)、白三烯D4(Leukotriene D4)、组氨酰酪氨酸(Histidinyl-Tyrosine)显著正相关。

实施例8：长双歧杆菌长亚种KLDS K5对结肠炎小鼠的代谢通路的调节作用

具体实施方式同实施例2中的步骤(1)-(3)；

将实施例2中的步骤(3)得到的造模结束后小鼠处死，取远端结肠组织1cm进行固定，脱水，包埋，采用Western blot法检测不同组小鼠结肠信号通路关键蛋白iNOS和COX-2、TLR4，MyD88，以及细胞核内的NF-κB p65的蛋白表达量进行评估，其结果如图16所示，与空白组相比，KLDS K5处理后小鼠结肠中iNOS的蛋白表达量显著(p<0.05)低于对照菌株BB12处理组。COX-2的蛋白表达量结果与iNOS结果一致，KLDS K5下调(p<0.05)DSS引起的COX-2表达升高，且表现优于BB-12；这一结果表明KLDS K5可以通过iNOS，COX-2通路抑制与氧化相关因子从而缓解炎症性肠病。

KLDS K5处理后小鼠结肠中TLR4,MyD88,以及细胞核内的NF-κB p65的表达量显著(p<0.05)低于对照菌株BB12处理组(图17)。这一结果表明KLDS K5可以通过抑制炎症相关TLR4/MyD88/NF-κB通路，调节炎症因子，从而缓解炎症性肠病。

测定与炎症相关NLRP3通路，采用Western blot的方法对小鼠结肠的NLRP3,ASC,Capase-1的蛋白表达量进行评估，其结果如图18所示，DSS组小鼠结肠中NLRP3,ASC,Capase-1的蛋白表达量显著(p<0.05)高于空白组，B.longum15干预后小鼠结肠中这三种蛋白的表达量与DSS组无显著差异(p>0.05),KLDS K5和BB12干预后均可显著(p<0.05)下调小鼠结肠中NLRP3,ASC,Capase-1的蛋白表达量，值得注意的是KLDS K5处理后小鼠结肠中NLRP3,ASC,Capase-1蛋白的表达量显著(p<0.05)低于对照菌株BB12处理组。这一结果表明KLDS K5可以通过抑制炎症相关NLRP3通路，调节炎症因子，从而缓解炎症性肠病。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 具有预防及缓解结肠炎症状的长双歧杆菌长亚种及其应用

<141> 2021-09-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1027

<212> RNA

<213> 1

<400> 1

aggggaacgg ggagaagcgg accgaccgcc ccaacaccgg aaagcccgga aacgggggaa 60

gccggagccc aggacgcagg ccgggaaagc cgcggaggga ggggcgcgcc acagcgacgg 120

cggggaacgg cccaccgggc cgacgggagc cggccgagag ggcgaccggc cacagggacg 180

agaacggccc agacccacgg gaggcagcag ggggaaagca caagggcgca agccgagcag 240

cgacgccgcg gagggaggag gcccggggaa acccacgggg agcaagcgag aggagacccg 300

gaaaagcacc ggcaacacgg ccagcagccg cggaaacgag gggcaagcga ccggaaaggg 360

cgaaagggcc gaggcggcgc gcgccgggga aagccacgca acggggaccg cgccgggacg 420

ggcgggcgag gcggagggga gacggaaccc gggaacgggg aaggagaacg ggaagaacac 480

caaggcgaag gcaggccggg ccgacgacgc gaggagcgaa agcgggggag cgaacaggaa 540

gaacccggag ccacgccgaa acggggagcg gagggggccc gccacgggcc ggcggagcaa 600

cgcgaagcac ccgccgggga gacggccgca aggcaaaacc aaagaaagac gggggcccgc 660

acaagcggcg gagcagcgga aacgagcaac gcgaagaacc accgggcgac agcccgacgg 720

cgagagaacg gcccccgggg cgggcacagg gggcaggcgc gcagccggcg gagaggggaa 780

gcccgcaacg agcgcaaccc cgccccgggc cagcggaagc cgggaaccac gggggaccgc 840

cggggaaccg gaggaagggg ggagacgcag acacagcccc acgccagggc cacgcagcac 900

aaggccggac aacgggagcg acgcggcgac gcggagcgga cccgaaaacc ggccagcgga 960

cgcagcgcaa ccgacgcgga aggcggagcg cagaacgcga acagcaacgc gcgggaagcg 1020

cccgggc 1027

<210> 2

<211> 521

<212> RNA

<213> 1

<400> 2

gagacgagcg aagacccgac gagcgcacgg cgccgagcgg caaggaagcg ccaagaagac 60

cgacgacgcg ccgggacggc accaccacgc aaccggcgcc agcccggcac gagggcgaag 120

aacgggcgcc ggcccaaccc gacgcccgcg cgcggcacga gaaggccacc gaggcacgca 180

aggaaccgcg cgccgccaag gacgcgagac caaggaccag acgcgcaccg ccaccacccg 240

ccgcgacccg aggcggcgag aagacgcgag gccggacaag gcggccagga cggcgggacc 300

ggaagacaac aaccgccggc cggacccgac caccgagggc agcggacaag ggcacacgcc 360

ccgaccgcac caacgcgacg accagaccgc aggccgaaga ccgacacgcg accccggcaa 420

ggccacccag caggacacgg cacgggccga gcggcagaag accggcaagc cgcgcgacac 480

gcgaggacgc gacggcgaag cacgccgacc gaccgaacaa g 521

Claims (6)

1.一株具有预防及缓解结肠炎症状的长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longumsubsp. Longum KLDS K5，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号为CCTCC M 20211225，保藏日期2021年9月26日。

2.一种具有预防及缓解结肠炎症状的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的长双歧杆菌长亚种。

3.权利要求2所述具有预防及缓解结肠炎症状的产品，其特征在于，所述产品为复合菌剂。

4.权利要求3所述具有预防及缓解结肠炎症状的产品，其特征在于，所述复合菌剂中包括其他双歧杆菌。

5.权利要求1所述长双歧杆菌长亚种在制备预防及缓解结肠炎药物中的应用。

6.权利要求1所述长双歧杆菌长亚种在制备降低髓过氧化物酶(MPO)的活性、环氧化酶(COX-2)的活性或PEG2的活性的药物中的应用。

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