CN115651856A - 一种具有缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的联合双歧杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)，属于微生物技术领域。本发明提供的联合双歧杆菌能增强肠道屏障功能，调节肠道黏膜免疫，减轻回肠炎症，可通过TLR4介导的NF‑κB/MAPK信号通路上调紧密连接蛋白(Occludin and Claudin‑1、ZO‑1)、粘蛋白(MUC2)的表达，抑制炎症介质(IL‑1β、IL‑6、TNF‑α)的表达。重要的是，联合双歧杆菌组调节了肠道微生物群的组成，促进短链脂肪酸(SCFA)的增加。

Description

一种具有缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的联合双歧杆菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有缓解脂多糖所致的小鼠肠道 损伤的联合双歧杆菌及其应用。

背景技术

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌(病原菌和共生菌)外膜的主要成分。人们发现， 它是一种与细菌有关的物质，叫做内毒素，能引起动物败血症休克。肠道功能障 碍对败血症的发展至关重要，这表明肠道在全身炎症反应中起着“马达”的作 用。肠道是人体最大的消化器官，肠道上皮的完整与否对肠道健康至关重要。肠 黏膜屏障的损伤可引起肠通透性增加，释放大量的促炎细胞因子，进而诱发异常 的黏膜免疫反应。近年来研究发现肠屏障功能的损害与肠易激综合征(IBS)、炎 症性肠病(IBD)等肠道疾病密切相关。促炎细胞因子可以激活与炎症相关的信号 通路，进而引起肠道炎症和症状。一项早期的研究表明，TNF-α促炎细胞因子 可以通过增加肠上皮紧密连接(TJs)的通透性来诱导上皮屏障的破坏。

双歧杆菌直接或间接地对健康有多种益处，包括防止致病微生物、高血压、 糖尿病、炎症和氧化应激等。同时，它还参与调节微生物群、免疫和抗胆固醇活 性。由于黏膜组织结构的不同，双歧杆菌主要在结肠和回肠远端发挥免疫调节活 性，其中高达46％的淋巴集结出现在回肠远端。T细胞可分为CD4+T细胞和CD8+ T细胞。CD4+T细胞也被称为T辅助细胞(Th)，在适应性免疫系统中发挥重要作 用。粘膜中的树突状细胞是toll样受体所特有的，它们驱动免疫球蛋白同型转 换为IgA，标记T和B细胞上的肠归巢受体，同时根据亚型驱动T调节或Th17。 体内研究已经证实双歧杆菌在低级别慢性炎症中具有恢复免疫标志物和肠道屏 障的能力。长双歧杆菌CECT 7347在麦醇溶蛋白诱导的动物模型中可抑制炎症细胞因子的产生，缓解CD4+T细胞介导的免疫应答。更多的研究表明，共生双歧 杆菌对肠道免疫系统的发育有很强的影响，而肠道免疫系统维持着肠道内环境的 稳定。

一项研究表明，LPS可能破坏紧密连接结构，导致粘膜通透性增加。同时， 它可以结合TLR4并激活NF-κB信号通路，释放促炎细胞因子，如IL-1β、IL-6 和TNF-α，产生局部或全身的炎症反应。双歧杆菌已被证明通过其免疫调节功 能促进健康，并已被测试用于IBD的预防和治疗。一项研究发现，在喂食婴儿双 歧杆菌的小鼠肠道免疫细胞培养中，炎症细胞因子(如TNF-α和IFN-γ)的水平 显著降低。许多研究表明，p38的激活与促炎细胞因子的表达有关，抑制p38、 JNK和ERK的磷酸化，发挥抗炎作用。因此，双歧杆菌被认为在肠道免疫平衡中 发挥着重要作用。因此基于现状，从健康婴儿肠道分离出来具有缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的联合双歧杆菌具有非常重要的现实意义及应用价值。

发明内容

本发明提供了一种两歧双歧杆菌E3(Bifidobacterium bifidum E3)，于2022 年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号为CCTCC M 2022384。

本发明提供了一种长双歧杆菌婴儿亚种E4(Bifidobacterium longum subsp.infantis E4)，于2022年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保 藏编号为CCTCCM 2022385。

本发明提供了一种缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的联合双歧杆菌，包括两 歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)。通过用该联合双歧杆菌干预 LPS诱导的小鼠，判断其初步预防及缓解效果。

本发明提供的缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的联合双歧杆菌，可以抑制炎 症，特别是抑制炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的表达。

本发明提供的缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的联合双歧杆菌，在抑制 NF-κB和MAPK信号通路方面的应用。

本发明提供一种缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的联合双歧杆菌的制备方 法。

本发明还提供了一种具有缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的产品，包括两歧 双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)。进一步的，所述产品可以是多 复合菌剂，包括其他双歧杆菌。

本发明的有益效果：

本发明提供的联合双歧杆菌能增强肠道屏障功能，调节肠道黏膜免疫，减轻 回肠炎症，可通过TLR4介导的NF-κB/MAPK信号通路上调紧密连接蛋白 (Occludin andClaudin-1、ZO-1)、粘蛋白(MUC2)的表达，抑制炎症介质(IL-1β、IL-6、TNF-α)的表达。重要的是，联合双歧杆菌组调节了肠道微生物群的组成， 促进短链脂肪酸(SCFA)的增加。

附图说明

图1双歧杆菌对LPS相关症状的影响。(A)体重，(B)组织学变化(200×)，(C)回 肠绒毛高度/隐窝深度比。红色箭头表示组织轻度水肿，结构松散。黑色箭头表 示黏膜层可见少量炎性细胞浸润。绿色箭头表示粘膜下层轻度水肿。

图2双歧杆菌对肠道通透性的影响。(A)AB-PAS染色(100×)，(B)杯状细胞密度，(C-F)回肠MUC2、Clandin-1、Occludin和ZO-1mRNA的表达。(G-H)血清DAO 和D-乳酸水平。

图3双歧杆菌对回肠IgA浆细胞的影响。(A)免疫荧光(100×)，(B)平均光密度。

图4回肠CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和DC细胞免疫组织评价。 图5双歧杆菌对炎症细胞因子的影响。(A-E)IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 水平，(F-J)IL-1β、IL-4、L-6、IL-10、TNF-αmRNA表达水平。

图6NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的蛋白质印迹。(A)NF-κB p65(在细胞 核内)，(B)NF-κB p65(在细胞质)，(C)IκBα,p-IκBα，(D)p-p38，(E)p-JNK， (F)p-ERK1/2，(G)TLR4。

图7双歧杆菌对肠道菌群组成的影响。(A)OTUs数量，(B)主成分分析(PCA)，(C) 门水平，(D)属水平，(E)肠道菌群的LEfSe比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的小鼠为6周龄雄性SPF级(Specific pathogen free，无特定病原体)Balb/c小鼠，购自北京维生河动物科技有限公司；下述实施例ELISA试 剂盒购自福建科诺迪生物科技有限公司；下述实施例中涉及的RNAiso Plus试剂 盒购自南京诺唯赞有限公司；下述实施例中涉及的引物来自上海生工生物技术有 限公司。

实施例1

两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的筛选、鉴定、培养和保存：

1、筛选

取1g来源于哈尔滨地区的健康婴儿粪便样本，梯度稀释后涂布于MRS固 体培养基中，置于37℃厌氧环境中培养72h，观察并记录菌落形态；挑取表面 湿润、有凸起的、白色泛黄的菌落在MRS固体培养基上划线，于37℃厌氧的 条件下进行纯化培养，重复此操作3次，获得纯化后的单菌落；挑取单菌落在 MRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养36h。

2、鉴定

提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16S r DNA进行扩增和测序(扩增 得到的16S r DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2所示)，将获得 的序列在NCBI-Blast中进行核酸序列比对，结果显示菌株为两歧双歧杆菌E3(BB) 和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)；命名为两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿 亚种E4(BL)。

3、培养

挑取两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的单菌落接入添 加0.05％L-半胱氨酸盐酸盐(2％v/v)的MRS培养液(中国青岛Hopebio公司， HB0384-5)，37℃厌氧培养48h。

4、保存

挑取两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的单菌落接入 MRS液体培养基中，于37℃厌氧的条件下培养24h，得到菌液；在所得菌液中 加入灭菌后的40％(v/v)甘油混匀后-80℃保存于甘油管中。同时，将所述两歧双 歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)保藏于中国典型培养物保藏中心， 武汉，保藏编号为CCTCC M 2022384,CCTCC M 2022385，保藏日期2022年4 月6日。

实施例2

双歧杆菌对脂多糖处理后的结肠、回肠和空肠组织中的保护作用：

(1)健康Balb/c小鼠36只(SPF，雄性，18-20g，6周龄)，购自北京维生 河实验动物科技有限公司(中国北京)。小鼠在标准条件下(温度：20-22℃；湿度： 50±10％；光/暗循环12h)，随机饲喂标准实验室饲料和水。

(2)首先将小鼠随机分为6组，分别为Control、LPS、BB12(双歧杆菌乳 酸亚种BB-12)、BL(长双歧杆菌婴儿亚种E4)、BB(两歧双歧杆菌E3)和BLBB(长 双歧杆菌婴儿亚种E4：两歧双歧杆菌E3＝1:1)，每组6只。所有小鼠在实验前进 行一周的适应喂养。BB-12、BL、BB、BLBB组(5×10⁹CFU/mL/d)灌胃0.2mL， 每日1次，连续2周。对照组和LPS组灌胃0.2mL生理盐水。LPS组、BB12 组、BL组、BB组和BLBB组小鼠最后一天腹腔注射LPS(5mg/kg)。对照组用 生理盐水替代。21d腹腔注射后6h全部小鼠安乐死。

(3)小鼠分别于7d、11d、17d、19d和21d称重。取回肠、结肠和肠内容 物，-80℃保存，以备进一步实验。动物实验方案按照护理指南执行，使用实验 动物经东北农业大学动物伦理委员会批准(伦理批准代码：NEAUEC20210475)。

表1动物分组及处理方法

(4)在建模期间，每天测定小数的体重变化，其结果如图1A所示。在建模期间， LPS处理6h后，两组小鼠的体重均有不同程度的下降，其中LPS组下降最多。 BLBB组小鼠的体重与对照组最接近。

(5)不同试验组小鼠的结肠组织病理学分析。肠绒毛高度与隐窝深度之比 可反映小肠黏膜形态及小肠吸收能力。因此，绒毛/隐窝比值的增加对应着营养 物质消化和吸收的缓解。结肠、回肠和空肠的组织学变化见图1B。对照组结肠、 回肠、空肠结构清晰，黏膜上皮细胞排列整齐、紧密，隐窝结构完整、紧密，黏 膜下层无水肿，组织内无炎症。同时，回肠和空肠的肠绒毛结构清晰。LPS组结 肠、回肠、空肠组织结构异常，粘膜层局部上皮细胞脱落，固有层暴露，隐窝结 构消失。回肠和空肠组的肠腔扩张，肠绒毛变短，肌层结构消失。在双歧杆菌组， 肠道组织中出现个别细胞坏死，但与LPS组相比，组织学病变有所缓解，黏膜上皮细胞排列紧密。对照组小鼠回肠绒毛高度与隐窝深度之比大于LPS组(p< 0.05)。对照组、BB12组、BB组和BLBB组回肠绒毛高度/隐窝深度比值无显著 差异(p>0.05)(图1C)。实验表明，双歧杆菌的添加增加了LPS刺激后回肠的绒 毛/隐窝比率，两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)联合用药效果 最好。

因此，本发明的两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)联合菌 株对小鼠结肠、回肠和空肠组织有较好的保护作用。

实施例3

两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的联合菌株对肠道通透 性的保护作用：

(1)杯状细胞在小肠和大肠中都存在，它合成并分泌黏蛋白，黏蛋白负责 粘液毯的产生和维持。结肠、回肠和空肠上皮细胞表面的黏蛋白可通过AB-PAS 染色评价，即结肠、回肠和空肠用4％多聚甲醛保存，石蜡包埋后切成5μm厚， 苏木精和伊红(H&E)按标准方法染色。染色后中性粘蛋白呈紫色，酸性粘蛋白呈 蓝色。在各肠道组织中，LPS组酸性粘液减少，而双歧杆菌组酸性粘液增加(图 2A)。如图2B所示，LPS处理后，结肠、回肠和空肠杯状细胞密度较对照组显 著降低(p<0.05)。相反，所有双歧杆菌组都可以改变这一趋势。值得注意的是 BB和BLBB组结肠和回肠杯状细胞密度与对照组相比无显著差异(p>0.05)。结 果表明，双歧杆菌能增加LPS诱导后的杯状细胞数量。

(2)肠黏膜屏障由肠黏膜上皮细胞、TJs和黏液层组成。TJs是肠上皮细胞 之间最关键的连接，包括跨膜蛋白(Claudin和Occludin)、外周膜蛋白(ZO-1、ZO-2 和ZO-3)和调节蛋白。MUC2是一种粘蛋白，是结肠黏液层的主要成分。

将实施例2中的步骤(3)得到的造模结束后小鼠处死，取回肠组织采用 RT-PCR方法检测不同组结肠中MUC2、ZO-1、Claudin-1、Occludin的表达量(检 测结果见图2C-F)。与LPS组相比，BLBB组ZO-1、Claudin-1、Occludin和MUC2 的相对表达量分别提高了1.46、3.21、4.89和5.27倍，表达倍数最高。双歧杆菌 可以通过调控相关蛋白的mRNA表达来保护肠道屏障上皮的完整性。

(3)血清D-乳酸和DAO活性是反映肠道通透性的关键指标。为评价双歧 杆菌对肠道损伤和通透性的影响，按照说明书使用ELISA试剂盒(科诺迪，中国 福建)检测血清中DAO活性和D-乳酸水平，结果如图2G-H所示。结果表明， LPS处理后，与对照组相比，DAO活性和D-乳酸水平显著升高(p<0.05)。与LPS 组相比，BB12、BL、BB和BLBB组可显著降低DAO活性和D-乳酸水平(p<0.05)， 其中BLBB组效果最显著(p<0.05)。

因此，两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的联合菌株对脂 多糖诱导的肠损伤具有保护肠道通透性的作用。

实施例4

两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的联合菌株对肠道免疫 细胞的促进作用：

IgA是肠黏膜中最重要的免疫球蛋白。本研究采用免疫荧光法测定粘膜IgA 含量。如图3B所示，LPS组回肠IgA阳性细胞的丰度低于对照组(p<0.05)。BB12、 BB组与LPS组比较无明显差异(p>0.05)，但平均光密度值高于LPS组。BL组 和BLBB组IgA阳性细胞的丰度明显高于LPS组(p<0.05)。双歧杆菌可通过促 进肠道IgA浆细胞的增加，减轻LPS诱导的小鼠肠道黏膜免疫功能损伤，从而 增强黏膜屏障。

在宿主免疫系统中，淋巴细胞亚群被认为是免疫生物标志物，在免疫过程中 发挥着重要作用。相反，细胞介导的免疫损伤通常与CD4+/CD8+比值失调相关。 如图4所示，对回肠CD4+T细胞、CD8+T细胞和DC细胞进行免疫组化分析， 结果如表2所示。与对照组比较，LPS组CD4+T细胞评分及CD4+/CD8+T细胞 比值明显下降。与LPS组相比，BB12、BL、BB、BLBB组CD4+T细胞评分明 显升高。因此，BLBB组在缓解CD4+T细胞评分及CD4+/CD8+T细胞评分比值 方面较其他组更为显著。

表2回肠CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞、DC细胞评分。

树突状细胞(DC)是肠黏膜中含量最丰富的抗原呈递细胞，在调节肠黏膜免疫 中发挥重要作用。与对照组比较，LPS组DC细胞评分显著降低(p<0.05)。然而， 双歧杆菌组与对照组之间无显著差异(p>0.05)，BL组得分最高，其次为BLBB 组和BB12组。双歧杆菌可能通过影响DC细胞来保护LPS诱导的肠道损伤。

因此，两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的联合菌株对肠 道免疫细胞具有促进作用

实施例5

两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的联合菌株对小鼠免疫 的调节作用：

具体实施方式同实施例2中的步骤(1)-(3)；

将实施例2中的步骤(3)得到的造模结束后的小鼠处死，取回肠组织采用酶 联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠回肠中的生化指标包括结肠组织内细胞因子 表达(检测结果见图5A-E)。LPS组的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平 明显高于对照组(p<0.05)。相反，与对照组相比，抗炎细胞因子如IL-4和IL-10 水平显著降低(p<0.05)。各双歧杆菌组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著低于LPS 组(p<0.05)。另一方面，与LPS组相比，IL-4和IL-10的水平显着增加(p< 0.05)。BLBB组差异最大，IL-6、IL-10、TNF-α水平与对照组无显著差异(p> 0.05)。细胞因子mRNA表达如图5F-J所示。结果表明，与LPS组相比，双歧 杆菌组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达下调，IL-4、IL-10的mRNA表达显著 上调(p<0.05)。

双歧杆菌组均能降低促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的mRNA表达水 平，升高IL-4和L-10的表达水平。因此，两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴 儿亚种E4(BL)的联合菌株具有良好的抗炎作用。

实施例6

两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的联合菌株再TLR4介 导的NF-κB和MAPK信号通路方面具有抗炎作用：

将实施例2中的步骤(3)得到的造模结束后的小鼠处死，取回回肠组织。回 肠组织添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯基甲烷磺酰氟的RIPA裂解缓冲液 中裂解(RocheDiagnostics公司，曼海姆，德国)。裂解液4℃，12000×g离心15 分钟，收集上清。蛋白印迹的过程按照以前的方法进行³⁰。将30μg蛋白裂解液 用10％SDS-PAGE分解后转移到PVDF膜上。PVDF膜置于培养皿中，加入含 5％脱脂牛奶的封闭液，在摇床上摇1.5-2小时。用TBST冲洗膜，用一抗(抗-IκB 抗体,抗-TLR4抗体,NF-κB p65抗体，抗-p-p38抗体,anti-ERK1/2抗体，和抗 -p-pJNK抗体(1:50 000，万雷生物，中国))。丢弃一抗，用TBST冲洗膜。然后， 将膜放入用5％脱脂奶粉封闭液稀释的二抗(山羊抗兔IgG-HRP，1：5000，万 类生物，中国)溶液中，振荡反应。最后采用ECL western blotting检测试剂(万 类生物，中国)进行蛋白检测。使用Gel-Pro Analyzer 4软件对结果进行灰度分 析。β-actin and Histone H3作为对照。

初步研究显示BLBB组效果最好。为了探究TLR4介导的NF-κB和MAPK 信号通路是否在联合双歧杆菌抗炎作用中发挥重要作用，NF-κB和MAPK信号 通路中的关键蛋白如图6所示。本研究中，LPS组小鼠NF-κB p65(核内)、p-IκBα、 TLR4,p-p38,p-JNK和p-ERK1/2表达水平明显高于对照组(p<0.05)。与LPS 组比较，BLBB组NF-κB p65(核内)、p-IκBα、TLR4 p-p38、p-JNK、p-ERK1/2 表达水平显著降低。同时，与LPS组相比，NF-κB p65(细胞质)和IκBα水平 升高(p<0.05)。

本实验中，LPS处理增加了p38、JNK和ERK1/2的磷酸化，而BLBB组改 变了其表达，与LPS组相比，其磷酸化水平分别下降了41.10％、46.85％和26.98％。 这些结果证实了BLBB组通过抑制MAPK信号通路的激活来缓解LPS诱导的炎 症，从而减少炎症因子的分泌。因此，两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿 亚种E4(BL)的联合菌株再TLR4介导的NF-κB和MAPK信号通路方面具有良好 的抗炎效果。

实施例7

两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的联合菌株对肠道菌群 组成的调节作用：

采用BLBB组来分析其对肠道菌群组成的调节作用。如图7A所示，control 组、LPS组和BLBB组共有450个OTU，说明各组都有较强的核心菌群。另外， 对照组有716个OTU,BLBB组有610个OTU。通过PCA对β-多样性进行分析， 如图7B所示，结果显示，对照组与BLBB组的β-多样性比对照组与LPS组的β- 多样性更接近。因此，对照组和BLBB组的相似性高于对照组和LPS组。以上 结果表明，不同组小鼠的肠道微生物结构存在一定的差异。

门水平小鼠肠道内容物菌群结构变化：肠道微生物组样品的门水平如图7C 所示。厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)为优势门，总丰度均超过 50％，其次是变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteriota)。LPS处理后， 厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)的相对丰度降低，变形菌门 (Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteriota)的相对丰度增加。与LPS组相比， BLBB组变形菌门的相对丰度降低了88.92％。

属水平小鼠肠道内容物菌群结构变化：属水平如图7D所示。LPS组另枝菌 属(Alistipes)、毛螺菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、梭菌属 (Closrtidia_Ucg-014)和Muribaculaceae的相对丰度较对照组降低。与LPS组相 比，BLBB组这些属的丰度均有所增加。与LPS组相比，大肠杆菌志贺氏菌 (Escherichia-Shigella)和肠杆菌(Enterorhabdus)的相对丰度均下降50％以上，双歧 杆菌(Bifidobacterium)的相对丰度增加。

LEfSe用于比较不同群体之间的物种差异并识别样本中的生物标志物，结果 如图7E所示。对照组富集噬纤维菌目(Cytophagales)、嗜甲基菌科 (Methylophilaceae)、黄杆菌科(Xanthobacteraceae)和梭状芽孢杆菌 (Clostridium_perfingens)，而LPS组的肠道菌群中变形杆菌(Proteobacteria)、 伽玛变形杆菌(Gammaproteobacteria)、肠杆菌(Enterobacterales)、志贺氏杆菌 (Escherichia_Shigella)、大肠杆菌(Escherichia_coli)和肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)更丰富。BLBB组富集了颤螺菌目(Oscillospirales)、颤螺 菌科(Oscillospiraceae)、长双歧杆菌(Bifidobacterium_longum)和瘤胃球菌科 (Ruminococcaceae)。

因此，两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)联用可调节肠道 菌群，缓解脂多糖诱导的肠道紊乱。

实施例8

两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的联合菌株对肠道内容 物中短链脂肪酸的促进作用：

短链脂肪酸是由肠道菌群发酵难以消化的碳水化合物(如抗性淀粉)产生的， 包括乙酸、丙酸和丁酸。短链脂肪酸是肠上皮细胞的重要能量，具有增强肠屏障 功能的作用。

短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)的测定采用气相色谱法(GC)。简单地 说，将0.8000±0.010g的肠道内容物准确称入粪便样品盒，用HALO-F100粪便 处理器处理，制备10％的悬浮液。取500μL的悬液置于1.5mL离心管中，加入 100μL的巴豆酸偏磷酸溶液，-30℃冷冻24h，解冻后在4℃下5000×g离心3 分钟，去除蛋白质等杂质。上清液用0.22μm水基过滤器过滤，然后在机器上测 量。采用Agilent DB-FFAP毛细管柱(30m×0.25mm ID×0.25μm)，FID检测器 检测短链脂肪酸。进样口温度250℃，进样量1.0μL，分流比5:1，载气为高纯氮 气。不同处理对SCFAs水平的影响如表3所示。与对照组相比，LPS组小鼠的 总短链脂肪酸(TSCFAs)、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸水平均显著降低(p<0.05)。 结果表明，与LPS组相比，BLBB组可显著提高TSCFAs、乙酸和丙酸水平(p< 0.05)。此外，在丙酸、丁酸和戊酸水平方面，BLBB组与对照组相比无显著差 异(p>0.05)。然而，LPS和BLBB组的乙酸、丙酸和丁酸水平存在显着差异(p <0.05)。因此，两歧双歧杆菌E3(BB)和长双歧杆菌婴儿亚种E4(BL)的联合菌株 可以提高SCFAs的水平，进而保护肠道屏障功能。

表3双歧杆菌对肠道内容物中短链脂肪酸水平的影响。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用 本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同 理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种具有缓解脂多糖所致的小鼠肠道损伤的联合双歧杆菌

<141> 2022-06-13

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtcgacgg gatccatcgg gctttgcttg gtggtgagag tggcgaacgg gtgagtaatg 60

cgtgaccgac ctgccccatg ctccggaata gctcctggaa acgggtggta atgccggatg 120

ttccacatga tcgcatgtga ttgtgggaaa gattctatcg gcgtgggatg gggtcgcgtc 180

ctatcagctt gttggtgagg taacggctca ccaaggcttc gacgggtagc cggcctgaga 240

gggcgaccgg ccacattggg actgagatac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atggaggcct 360

tcgggttgta aacctctttt gtttgggagc aagccttcgg gtgagtgtac ctttcgaata 420

agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggcgcaag cgttatccgg 480

atttattggg cgtaaagggc tcgtaggcgg ctcgtcgcgt ccggtgtgaa agtccatcgc 540

ttaacggtgg atctgcgccg ggtacgggcg ggctggagtg cggtagggga gactggaatt 600

cccggtgtaa cggtggaatg tgtagatatc gggaagaaca ccgatggcga aggcaggtct 660

ctgggccgtc actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct 720

ggtagtccac gccgtaaacg gtggacgctg gatgtggggc acgttccacg tgttccgtgt 780

cggagctaac gcgttaagcg tcccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag 840

aaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgcggat taattcgatg caacgcgaag 900

aaccttacct gggcttgaca tgttcccgac gacgccagag atggcgtttc ccttcggggc 960

gggttcacag gtggtgcatg gtcgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1020

cgcaacgagc gcaaccctcg ccccgtgttg ccagcacgtt atggtgggaa ctcacggggg 1080

accgccgggg ttaactcgga ggaaggtggg gatgacgtca gatcatcatg ccccttacgt 1140

ccagggcttc acgcatgcta caatggccgg tacagcggga tgcgacatgg cgacatggag 1200

cggatccctg aaaaccggtc tcagttcgga tcggagcctg caacccggct ccgtgaaggc 1260

ggagtcgcta gtaatcgcgg atcagcaacg ccgcggtgaa tgcgttcccg ggccttgtac 1320

acaccgcccg tcaagtcatg aaagtgggca gcacccgaag ccggtggcct aacccct 1377

<210> 2

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatccatcaa gcttgcttgg tggtgagagt ggcgaacggg tgagtaatgc gtgaccgacc 60

tgccccatac accggaatag ctcctggaaa cgggtggtaa tgccggatgt tccagttgat 120

cgcatggtct tctgggaaag ctttcgcggt atgggatggg gtcgcgtcct atcagcttga 180

cggcggggta acggcccacc gtggcttcga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc 240

acattgggac tgagatacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac 300

aatgggcgca agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat ggaggccttc gggttgtaaa 360

cctcttttat cggggagcaa gcgtgagtga gtttacccgt tgaataagca ccggctaact 420

acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcaagcgtt atccggaatt attgggcgta 480

aagggctcgt aggcggttcg tcgcgtccgg tgtgaaagtc catcgcttaa cggtggatcc 540

gcgccgggta cgggcgggct tgagtgcggt aggggagact ggaattcccg gtgtaacggt 600

ggaatgtgta gatatcggga agaacaccaa tggcgaaggc aggtctctgg gccgttactg 660

acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 720

taaacggtgg atgctggatg tggggcccgt tccacgggtt ccgtgtcgga gctaacgcgt 780

taagcatccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaagaaat tgacgggggc 840

ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggc 900

ttgacatgtt cccgacgatc ccagagatgg ggtttccctt cggggcgggt tcacaggtgg 960

tgcatggtcg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020

ccctcgcccc gtgttgccag cggattgtgc cgggaactca cgggggaccg ccggggttaa 1080

ctcggaggaa ggtggggatg acgtcagatc atcatgcccc ttacgtccag ggcttcacgc 1140

atgctacaat ggccggtaca acgggatgcg acgcggcgac gcggagcgga tccctgaaaa 1200

ccggtctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaaggcggag tcgctagtaa 1260

tcgcgaatca gcaacgtcgc ggtgaatgcg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcaa 1320

gtcatgaaag tgggcagcac ccgaagccgg tggcctaacc ccttgtggga tgga 1374

Claims (7)

1.一种具有缓解LPS引起的肠道损伤的两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum E3，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号为CCTCC M 2022384，保藏日期2022年4月6日。

2.一种具有缓解LPS引起的肠道损伤的长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longumsubsp. infantis E4，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉，保藏编号为CCTCC M 2022385，保藏日期2022年4月6日。

3.具有缓解LPS引起的肠道损伤的联合双歧杆菌，其特征在于，包括权利要求1所述的两歧双歧杆菌E3和权利要求2所述的长双歧杆菌婴儿亚种E4。

4.一种具有缓解LPS引起的肠道损伤的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的两歧双歧杆菌E3和权利要求2所述的长双歧婴儿亚种E4。

5.如权利要求4所述的具有缓解LPS引起的肠道损伤的产品，其特征在于，所述产品为复合菌剂。

6.权利要求1所述两歧双歧杆菌E3、权利要求2所述的长双歧杆菌婴儿亚种E4、权利要求3所述的联合双歧杆菌、或权利要求4-5任一项所述的产品在制备缓解肠道损伤药物中的应用。

7.权利要求6所述的在制备缓解肠道损伤药物中的应用，其特征在于，所述药物抑制炎症介质的表达，所述炎症介质包括IL-1β、IL-6、TNF-α。

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