CN113430133A - 一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌、制备方法及其应用 - Google Patents
一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌、制备方法及其应用,涉及微生物技术领域。其特征在于:该复合益生菌包括长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89;其制备包括以下步骤:分别制备长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89冻干粉;按比例将三种冻干粉混合均匀制备复合益生菌。本发明提供的复合益生菌能够预防和/或治疗溃疡性结肠炎,在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品(如固体饮料)中,具有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域,特别涉及一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌、制备方法及其应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性非特异性炎症性肠病,病变主要累及黏膜及黏膜下层,病变多起自乙状结肠和直肠,自远端逆向发展,可累及全结肠甚至回肠末端,治疗时间较长,且易常反复发作,病程较久还易导致癌变,严重影响患者生活质量和生命健康。其具体发病机制仍不明确,目前认为其发病与遗传因素、环境因素、肠道黏膜屏障功能障碍、感染因素等多种因素有关。目前治疗UC的传统三大类药物有氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂,但现有药物治疗效果有限,仍有部分患者不能缓解,并且上述药物有效的患者,高昂的药费和病情的折磨,给患者带来了很大的身心痛苦。关于其发病机制目前尚无定论,基因因素、免疫反应均被视为重要机制,随着人们对肠道菌群在UC发病机制中作用认识的不断深入,微生态制剂已逐渐运用于UC的治疗。
近年来肠道菌群失调与溃疡性结肠炎的发生、发展之间的关系,尤其是肠道菌群对肠黏膜屏障的影响引起了人们的极大关注。肠黏膜屏障结构破坏、功能紊乱是溃疡性结肠炎患者肠道炎性病变加重的重要因素,可能与肠腔内抗原物质及病原菌透过破坏的屏障移位至肠黏膜固有层,激活免疫、炎症反应,进一步加重黏膜屏障的破坏有关。因此,肠道屏障功能的维持与重塑有利于减轻肠道炎症损伤。研究表明益生菌可以增强紧密连接的完整性,进而预防化学物质或有害病原菌对紧密连接的破坏,但是目前益生菌对UC的治疗尚处于发展阶段。随着人们对肠道菌群在UC发病机制中作用认识的不断深入,需要新的微生态制剂运用于UC的治疗。
发明内容
本发明在于克服背景技术中存在的问题,提供一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌。该能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌,能够预防和/或治疗溃疡性结肠炎。本发明还提供了一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌的制备方法及其应用。
本发明解决其问题可通过如下技术方案来达到:一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌,该复合益生菌包括长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacilluscasei LC89。
优选地,所述长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89的菌体数量比为(1-2):(1-2):(1-2)。
优选地,所述长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89均为活菌菌体形式;所述长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacilluscasei LC89的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
优选地,所述长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum BL21已于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.10452;所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80已于2018年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.15410;所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89已于2018年3月5日保保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.15409,保藏地址均为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌的制备方法,包括以下步骤:
(1)分别制备长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉;
(2)按比例将长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80冻干粉和干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89冻干粉混合均匀制备复合益生菌。
优选地,长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉制备方法分别为:将长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacilluscasei LC89按照占培养基总质量3%的接种量接种到培养基中,于37℃下培养18h,得到培养液;将培养液离心,得到菌体;将菌体用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1),得到重悬液;将重悬液采用真空冷冻法进行冻干,得到三种菌的冻干粉。
优选地,制备三种菌的冻干粉使用的MRS培养基(g/L)为:蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
本发明还提供一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌在预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。
优选地,一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌在制备缓解溃疡性结肠炎的固体饮料的应用。
优选地,所述固体饮料包括复合益生菌、菊粉。
优选地,所述复合益生菌中长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89的CFU含量比为1:1:1。
本发明与上述背景技术相比较可具有如下有益效果:
本发明提供的一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌,其含有的三种组分长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89,三者联合使用后,具有明显的协同增效作用。具体体现在:
(1)显著增加UC大鼠的体重;
(2)显著降低溃疡性结肠炎大鼠疾病活动指数(Disease activity index, DAI);
(3)显著改善结肠黏膜炎性病变,降低结肠组织病理学评分;
(4)降低溃疡性结肠炎大鼠血清炎症因子:TNF-ɑ、IL-6和INF-gamma水平;
(5)显著改善溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障功能;
(6)显著改善UC大鼠免疫功能;
(7)显著降低UC大鼠结肠重量与长度比。
因此,本发明能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品(如固体饮料)中,具有很大的应用前景。
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是已被纳入《可用于食品的菌种名单》的一种益生菌,因此,本发明筛选得到的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21对人体而言,相对健康,且不易产生不良反应。
动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)是已被纳入《可用于食品的菌种名单》的一种益生菌,因此,本发明筛选得到的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80对人体而言,相对健康,且不易产生不良反应。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是益生菌的一种,目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》,因此,本发明筛选得到的干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89对人体而言,健康且无毒副作用。
附图说明
附图1本发明实施例复合益生菌对改善溃疡性结肠炎大鼠体重的效果对比;
附图2本发明实施例复合益生菌降低DAI评分的效果对比;
附图3本发明实施例复合益生菌改善溃疡性结肠炎大鼠结肠炎症及溃疡的效果对比;(图中:A: CTL组;B: UC组;C: 益生菌干预组)
附图4本发明实施例复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理学损伤评分的效果对比;
附图5本发明实施例复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠血清肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α)的效果对比;
附图6本发明实施例复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠血清INF-gamma的效果对比;
附图7本发明实施例复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠血清白细胞介素-6(Interleukin-6 IL6)的效果对比;
附图8本发明实施例复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠结肠NF-kB蛋白表达的效果对比;
附图9本发明实施例复合益生菌改善溃疡性结肠炎大鼠结肠Occludin蛋白表达的效果对比;
附图10本发明实施例复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠Foxp3表达的效果对比;(Foxp3的免疫组织化学结果(×400);A: CTL组;B: UC组;C: 益生菌干预组)
附图11本发明实施例复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠Foxp3表达评分的效果对比;
附图12本发明实施例复合益生菌改善溃疡性结肠炎大鼠结肠重量长度比的效果对比;
附图13本发明实施例复合益生菌固体饮料改善溃疡性结肠炎大鼠降低DAI评分的效果对比。
图中,“*”表示p < 0 .05,“**”表示与表示p < 0 .01,“***”表示表示p < 0.001。
具体实施方式:
下面将结合本发明附图及实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠与酵母粉、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、吐温80和半胱氨酸氨酸盐购自国药集团化学试剂有限公司。SPF级雄性3周龄SD大鼠,高脂及普通饲料购自上海斯莱克公司;测定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23检测用ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司;测定内毒素LPS酶联免疫试剂盒购自武汉优尔生。
下述实施例中涉及的培养基如下:
MRS培养基(g/L):蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
实施例1:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21冻干粉的制备
将长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21按照占培养基总质量3%的接种量接种到培养基中,于37℃下培养18h,得到培养液;将培养液离心,得到菌体;将菌体海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1),得到重悬液;将重悬液采用真空冷冻法进行冻干,得到长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21冻干粉。
实施例2:动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactisBLa80冻干粉的制备
将动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80按照占培养基总质量3%的接种量接种到培养基中,于37℃下培养18h,得到培养液;将培养液离心,得到菌体;将菌体用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1),得到重悬液;将重悬液采用真空冷冻法进行冻干,得到动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80冻干粉。
实施例3:干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89冻干粉的制备
将干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89按照占培养基总质量3%的接种量接种到培养基中,于37℃下培养18h,得到培养液;将培养液离心,得到菌体;将菌体用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1),得到重悬液;将重悬液采用真空冷冻法进行冻干,得到干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89冻干粉。
实施例4:复合益生菌的制备
取1×108CFU的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21冻干粉、1×108CFU的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80冻干粉和1×108CFU的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89冻干粉混合均匀制得复合益生菌。
实施例5:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89组合物制备的复合益生菌对溃疡性结肠炎大鼠体重的影响。
下述实施例中涉及的结肠炎模型大鼠的建立过程如下:
动物分组及模型制备:将实验大鼠随机分为3组,每组10只,分别为正常对照组(CTL组),UC模型组(UC组)和益生菌干预组(BL21+BLa80+LC89组)。所有大鼠禁食、不禁饮36h,10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,除正常组外,余各组大鼠,用直径2 mm的硅胶管插入大鼠结肠至距肛门约8 cm处,用5%三硝基苯磺酸按100 mg/kg溶于等体积500 mL/L乙醇灌肠。正常组大鼠按相同方法,予以生理盐水灌肠,之后将大鼠倒置2-3 min,防止药物流出。将制备的复合益生菌用水复溶后灌胃给溃疡性结肠炎大鼠,连续12周。
从实验开始,每天测量大鼠体重,复合益生菌改善溃疡性结肠炎大鼠体重的效果对比见图1。
由图1可知:正常组大鼠活动、进食正常,无腹泻及便血;UC组大鼠活动少,肉眼可见黏液脓血便,肛周污染严重,于造模后第4天大便性状好转,活动及进食开始增加;与UC组相比,益生菌干预组大鼠腹泻及便血情况相对较轻;从给药后第3天开始好转,体重开始回升。模型评估及体质量的改变:三硝基苯磺酸造模后,大鼠精神变差,活动减少,体质量减轻,肛门处可见稀便,严重者可见黏液脓血便。根据各组大鼠体质量变化,绘制体质量曲线,从图1中可以看出,益生菌干预组在给药治疗后大鼠体质量减轻情况较模型组有明显改善。
实施例6:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉制备的复合益生菌对大鼠一般状况的影响
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例4。
大鼠一般状况:建模期间每日对大鼠进行称体质量并记录,同时观察大鼠的精神、活动、进食、腹泻情况和粪便性状情况等临床症状。
DAI评分:CTL组大鼠反应灵敏,饮食活动正常,毛发有光泽,无便血。UC组进食和饮水量减少、体重下降、粪便隐血阳性。随时间延长,UC组大鼠症状逐渐加重,DAI值逐渐升高,第5-7天出现不同程度的肉眼血便。益生菌干预组症状较CTL组大鼠明显减轻,DAI评分也明显低于UC组(p < 0.01)。
应用复合益生菌降低DAI评分的效果对比如图2所示,由图2可知,与UC组相比,补复合益生菌干预组的大鼠DAI评分显著降低(p < 0.05)。
实施例7:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉制备的复合益生菌对大鼠结肠组织病理学的影响
结肠组织病理学检测:将大鼠结肠组织置于4%多聚甲醛中固定,常规石蜡包埋,4μm切片。苏木素伊红染色,光学显微镜下进行组织病理学观察。
应用复合益生菌改善溃疡性结肠炎大鼠结肠炎症及溃疡的效果对比如图3所示(各组大鼠结肠病理切片(HE染色×200);A: CTL组; B: UC组; C: 益生菌干预组),大鼠结肠的大体形态观察及评分:UC组大鼠结肠黏膜明显充血水肿、糜烂及浅表溃疡,部分结肠壁增厚,少数结肠与周围组织发生黏连。益生菌干预组大鼠见少量糜烂,无溃疡,少数肠壁增厚,无黏连。与模型组比较,益生菌干预组结肠黏膜炎性病变改善,评分降低,差异有统计学意义(p < 0.01)。
结肠组织的病理学改变:CTL组结肠组织见腺体排列整齐,隐窝正常,杯状细胞无减少,未见黏膜糜烂、出血;UC组可见腺管排列紊乱,部分腺体缺失,黏膜及黏膜下层血管高度扩张充血,大量炎细胞浸润,部分部位可见溃疡形成;益生菌干预组腺体破坏较模型组轻,炎性浸润少,无溃疡形成。复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理学损伤评分的效果对比见图4。如图4所示,与UC组比较,益生菌干预组病理学评分下降,差异有统计学意义(p < 0.01)。
实施例8:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉制备的复合益生菌对大鼠血清促炎细胞因子的影响
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例4。
ELISA检测血清TNF-α、IFN-γ表达:操作步骤参照大鼠TNF-α、IFN-gamma ELISA试剂盒的说明书进行,操作完成后以450nm的波长测量各孔的OD值,根据OD值和标准品的浓度得出标准曲线方程,代入OD值计算样品浓度。
炎症因子:结肠黏膜TNF-α、IL-6的浓度测定UC组明显高于CTL组。与UC组比较,经益生菌干预后TNF-α、IL-6显著下降(p < 0.01)。
研究表明,许多炎性细胞因子,如TNF-α、IL6和IFN-gamma,在肠黏膜屏障损伤过程中起作用,炎症反应使细胞间通透性增加,从而破坏肠黏膜屏障,加重肠道炎症。在UC组中,TNF-α和IFN-gamma的表达水平明显升高,而给予复合益生菌干预后,这种升高趋势受到抑制,这表明复合益生菌可以抑制炎症,从而起到治疗结肠炎的作用。
血清中相关细胞因子的检测:TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23含量的测定采用ELISA试剂盒,方法参照说明书。
复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠血清肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα)的效果对比见图5。由图5可知,与CTL组比较,UC组大鼠血清TNF-α水平明显升高,差异有统计学意义(p < 0.05)。与UC组比较,复合益生菌干预组(BL21+BLa80+LC89组)大鼠血清TNF-α水平降低,差异具有统计学意义(p < 0.05)。
复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠血清INF-gamma的效果对比见图6。由图6可知,与CTL组比较,UC组大鼠血清IFN-gamma水平明显升高,差异有统计学意义(p < 0.05)。与UC组比较,益生菌干预组大鼠血清TNF-α水平降低,差异具有统计学意义(p < 0.05)。
复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠血清白细胞介素-6(Interleukin-6 IL6)的效果对比见图7。由图7可知,与CTL组比较,UC组大鼠血清IL6水平明显升高,差异有统计学意义(p < 0.05)。与UC组比较,复合益生菌干预组大鼠血清TNF-α水平降低,差异具有统计学意义(p < 0.05)。
实施例9:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉制备的复合益生菌对结肠组织肠黏膜屏障功能的影响
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例4。
Western blot检测结肠组织NF-κB及Occludin蛋白表达: 提取结肠组织总蛋白,各样品取50 μg蛋白上样,根据蛋白分子量配制SDS-PAGE凝胶电泳。浓缩胶电压75 V,进入分离胶后,电压设定为120 V。当溴酚蓝刚跑出即可终止电泳,转膜至PVDF膜。将PVDF膜上加入5%的脱脂牛奶,摇动封闭1 h;按比例加入稀释好的一抗,4 ℃孵育过夜,加入稀释好的二抗,室温下孵育2 h;ECL化学发光法显影定影,分析胶片灰度值。
复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠结肠NF-κB蛋白表达的效果对比见图8。如图8所示,NF-κB的表达在模型组大鼠明显增加(p < 0.05),而在复合益生菌,他的表达则较模型组降低(p < 0.05)。
复合益生菌改善溃疡性结肠炎大鼠结肠Occludin蛋白表达的效果对比见图9。如图9所示,与正常组相比,模型组大鼠肠黏膜Occludin蛋白表达明显下降(p < 0.05),而复合益生菌组,Occludin蛋白表达较模型组上调(p < 0.05)。在UC中,TNF-α诱导的肠上皮通透性增加,是由NF-κB信号通路调控的。在本实施例中,与正常组相比,UC组大鼠的NF-κB蛋白的表达明显增高,而紧密连接蛋白Occludin的表达减少,致使肠黏膜通透性增加。当给予复合益生菌治疗后,NF-κB的表达下调,而Occludin的表达增加,从而改善了肠黏膜屏障功能。
实施例10:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉制备的复合益生菌对免疫的影响
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例4。
结肠组织IL-17,Foxp3的表达:用免疫组织化学SP法检测,组织切片脱蜡;将玻片置柠檬酸缓冲液中用医用微波炉进行抗原修复,水洗;滴加3%H2O2。室温10 min阻断内源性过氧化物酶,PBS液冲洗;正常血清在室温下封闭15 min,清除多余血清,分别滴加羊抗大鼠IL-17,Foxp3多克隆抗体37 ℃孵育1 h或4 ℃过夜,PBS冲洗;滴加生物素化的羊抗大鼠抗体室温孵育15 min,PBS冲液洗;滴加过氧化物酶标记的链酶亲和素温孵育15 min,PBS液冲洗;DAB显色2-5 min,苏木素复染后,封片观察。免疫组织化学的切片在电镜下进行评分。
复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠Foxp3表达的效果对比见图10。如图10所示,Foxp3表达的阳性细胞见于结肠黏膜固有层细胞,黏膜下层,以淋巴细胞细胞核表达为主,呈棕黄色或棕褐色颗粒。与正常对照组比较,各组Foxp3阳性表达均相应减少,差异有统计学意义(p < 0.05);与模型组比较,复合益生菌干预组Foxp3阳性表达相应增多,差异均有统计学意义(p < 0.01)。
复合益生菌降低溃疡性结肠炎大鼠Foxp3表达评分的效果对比见图11。如图11所示,调节性T细胞(Treg)细胞是具有免疫调节功能的CD4+T细胞亚群,在防止自身免疫性疾病的发生、控制胃肠道炎症中起作用,另外,Foxp3在CD4+CD25+T细胞发育和功能发挥中发挥重要作用。本实施例表明UC组大鼠结肠组织Foxp3表达较CTL组明显降低,而益生菌干预组Foxp3阳性表达较UC组显著增加,说明益生菌可以通过抑制Treg细胞的数量减少和局部功能的减退,从而达到改善UC的目的。
实施例11,长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉制备的复合益生菌对结肠重量的影响
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例4。
实验结束后处死大鼠,取结肠组织,观察发现各组大鼠单位结肠长度。
复合益生菌改善溃疡性结肠炎大鼠结肠重量长度比的效果对比见图12。如图12所示,UC组大鼠单位长度结肠质量显著低于CTL组,而益生菌组单位长度结肠质量则相对UC组显著增加。一般来说,结肠炎会导致沉淀和水肿,随后结肠长度缩短,这是结肠炎的一个指标。炎症进展已知会导致免疫系统过度激活,最终损害结肠组织并缩短结肠长度。实验结果表明,益生菌可以减少结肠炎大鼠的结肠长重比,从而可能保护结肠组织免受结肠炎症状的影响。
实施例12:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉制备的复合益生菌用于固体饮料
本发明的一种复合益生菌固体饮料,该产品由复合益生菌0.1克、菊粉1.9克加工而成;可制成小袋产品用于冲饮。按每袋2.0克计,该产品每袋内含有20亿CFU益生菌。所述20亿CFU益生菌包括10亿CFU的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,5亿CFU的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和5亿CFU的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89。菊粉是一种益生元,复合益生菌与菊粉复合制备的固体饮料能够相互增效,有利于预防及治疗溃疡性结肠炎。
实施例13:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉制备的复合益生菌复合益生菌固体饮料对大鼠一般状况的影响
SD大鼠分组、造模及处理方法同实施例4。
DAI评分同实施例6。
CTL组和UC组正常饮食,复合益生菌组除正常饮食外,每天灌胃0.1g固体饮料(溶于0.5g无菌水)。
大鼠一般状况:建模期间每日对大鼠进行称体质量并记录,同时观察大鼠的精神、活动、进食、腹泻情况和粪便性状情况等临床症状。
DAI评分:CTL组大鼠反应灵敏,饮食活动正常,毛发有光泽,无便血。UC组进食和饮水量减少、体重下降、粪便隐血阳性。随时间延长,UC组大鼠症状逐渐加重,DAI值逐渐升高,第5天出现不同程度的肉眼血便。益生菌固体饮料干预组症状较CTL组大鼠明显减轻,DAI评分也明显低于UC组(p < 0.01)。
应用复合益生菌降低DAI评分的效果对比如图13所示,由图13可知,与UC组相比,补复合益生菌固体饮料的大鼠DAI评分显著降低(p < 0.01)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌,其特征在于,该复合益生菌包括长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89。
2.根据权利要求1所述的一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌,其特征在于:所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89的菌体数量比为(1-2):(1-2):(1-2)。
3.根据权利要求1所述的一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌,其特征在于:所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89均为活菌菌体形式;所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80和干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
4.根据权利要求1所述的一种能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌,其特征在于:所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21已于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC 10452;所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80已于2018年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC 15410;所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89已于2018年3月5日保保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC 15409。
5.一种权利要求1所述的能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)分别制备长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC89冻干粉;
(2)按比例将长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa80冻干粉和干酪乳杆菌Lactobacilluscasei LC89冻干粉混合均匀制备复合益生菌。
6.根据权利要求5所述的能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌的制备方法,其特征在于:长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89冻干粉制备方法分别为:
将长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21,动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis BLa80,干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89按照占培养基总质量3%的接种量分别接种到MRS培养基中,于37℃下培养18h,得到培养液;将培养液离心,得到菌体;将菌体用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1),得到重悬液;将重悬液采用真空冷冻法进行冻干,得到三种菌的冻干粉。
7.根据权利要求6所述的能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌的制备方法,其特征在于:制备三种菌的冻干粉使用的MRS培养基(g/L)为:蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
8.一种权利要求1所述的能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌在预防和/或治疗溃疡性结肠炎的产品中的应用。
9.一种权利要求1所述的能够缓解溃疡性结肠炎的复合益生菌在制备缓解溃疡性结肠炎的固体饮料的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述固体饮料包括复合益生菌、菊粉。
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