CN116083277B - 具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌zjuids13及其应用 - Google Patents

具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌zjuids13及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一株具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌ZJUIDS13及其应用。本发明公开了一种具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS13，其保藏号为：CGMCC NO.25529。本发明还同时公开了ZJUIDS13在制备具有缓解溃疡性结肠炎功效的产品中的应用。

Description

具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌ZJUIDS13及其应用
技术领域
本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一株具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌ZJUIDS13及其应用。
背景技术
炎症性肠病(IBD)是一种慢性且反复发作的胃肠道炎症性疾病。IBD根据发病位置和特征不同，分为溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)。UC是IBD的一种，病变多位于乙状结肠和直肠，也可蔓延至降结肠，甚至整个结肠部位。UC表现为持续或反复发作的腹泻，粘液便或脓血便，体重减轻等，单独的UC很少致命，但是UC引起的高度的炎症水平，增加了结直肠癌(Colorectal cancer)的发病风险。目前，现有技术对于UC的预防还没有明确有效的方法和手段，临床上治疗UC的药物主要包括水杨酸类药物、皮质类固醇类药物为主，以及其它包括免疫抑制剂类药物、抗生素、抗凝药物、抗炎性细胞因子、神经免疫调节剂等，存在价格昂贵、副作用多、部分患者疗效不佳、不能根治等不足。因此，寻找安全、有效且经济的治疗方法具有重要意义。
近年来，益生菌用于缓解炎症性肠病成为研究热点，已公开诸多基于益生菌干预炎症性肠病的文献与专利。乳酸片球菌作为乳酸菌的一种，常用于肉品、乳品和蔬菜的发酵，可改善食品的质地、风味、色泽、消化性和营养价值等。
CN113736695A公开了可用于改善肠屏障功能的4株益生菌菌株包括植物乳杆菌(CGMCC No.17941)、乳酸片球菌(CGMCC No.17943)、屎肠球菌和大肠杆菌，能有效缓解肠屏障功能损伤引起的结肠炎和全身炎症症状。CN112469812A公开的格氏乳杆菌KBL697菌株具有减轻变应性症状、减轻炎性症状、改善肠道健康以及免疫调节等作用。上述乳杆菌、乳酸片球菌均未能制备细菌素。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有缓解溃疡性结肠炎的乳酸片球菌ZJUIDS13及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS13，其保藏号为：CGMCC NO.25529。
乳酸片球菌ZJUIDS13(Pediococcus acidilactici)16S rDNA全序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明还同时提供了上述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS13在制备具有缓解溃疡性结肠炎功效的产品中的应用。
作为本发明的应用的改进：所述具有缓解溃疡性结肠炎功效的产品为具有缓解溃疡性结肠炎功效的药物。
作为本发明的应用的进一步改进：乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS13用于制备具有缓解溃疡性结肠炎功效的活菌制剂。
本发明还同时提供了乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS13的另一种用途：制备乳酸菌细菌素。
针对目前缺少研究乳酸片球菌在溃疡性结肠炎中的治疗效果问题，本发明提供一株具有缓解溃疡性结肠炎的乳酸片球菌ZJUIDS13及其应用，通过DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型，考察乳酸片球菌对溃疡性结肠炎的缓解效果。
菌株ZJUIDS13保藏信息如下：保藏名称：乳酸片球菌Pediococcus acidilactici；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.25529，保藏时间2022年08月12日。
本发明的乳酸片球菌ZJUIDS13(Pediococcus acidilactici)耐酸耐胆盐方面比其他乳酸菌有明显的优势，适合肠胃环境并具有增殖能力；乳酸片球菌ZJUIDS13(Pediococcus acidilactici)具有缓解溃疡性结肠炎功效的同时还可以产生细菌素，相较其他乳酸菌有明显的优势；乳酸片球菌ZJUIDS13(Pediococcus acidilactici)的培养液无抗生素耐性，说明菌株没有携带耐药基因；乳酸片球菌ZJUIDS13(Pediococcusacidilactici)具有抗菌活性；乳酸片球菌ZJUIDS13(Pediococcus acidilactici)具有较强的抗氧化能力。
综上，本发明基于云南乳扇样品中分离获得的益生菌，从中筛选出来具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌。该菌株在耐酸耐胆盐方面相较其他乳酸菌有明显的优势，适合肠胃环境生长(耐受胃肠道环境)并具有增殖能力。无抗生素耐性，具有抗菌活性，抑制肠内有害的病原菌以及具有较强的抗氧化能力，具有缓解溃疡性结肠炎功效的同时还可以产生细菌素。因而本发明乳酸片球菌ZJUIDS13可广泛用于开发益生菌等相关产品。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明；
图1为乳酸片球菌ZJUIDS13的菌落形态图；
图2为乳酸片球菌ZJUIDS13革兰氏染色结果图；
图3为乳酸片球菌ZJUIDS13的16S rDNA的电泳鉴定图；
图4为试验各组溃疡性结肠炎小鼠结肠长度对比结果图；
图5为溃疡性结肠炎小鼠模型体重变化百分率图；
图6为各组小鼠结肠形态图；
图7为溃疡性结肠炎小鼠模型结肠长度图；
图8为溃疡性结肠炎小鼠模型结肠组织HE染色结果图；
图9为溃疡性结肠炎小鼠盲肠中短链脂肪酸含量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、乳酸片球菌ZJUIDS13的筛选及鉴定
1.乳酸片球菌ZJUIDS13的筛选
1.1样品来源
本发明所用的菌株来源于云南乳扇样品。样品共采集20份。
1.2菌株的分离纯化
取约5g样品于无菌管中收集，立即送至实验室进行菌株分离纯化。分离时取1g样品放入9mL的MRS液体培养基中，涡旋混匀后于37℃下富集培养48h；然后在超净台中吸取培养液1mL，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度，每个稀释梯度分别取菌悬液100μL涂于MRS固体培养基上，于37℃培养48h。培养结束后，从MRS固体培养基中选择生长有30～300个单菌落的平板，挑取典型菌落，在MRS琼脂平板上多次划线分离，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到MRS液体培养基中扩大培养。得到的菌株在含有40％(w/v)甘油的MRS液体培养基的-80℃冰箱终冷冻保存。
2.乳酸片球菌ZJUIDS13的鉴定
2.1菌落特征
乳酸片球菌ZJUIDS13在MRS固体培养基培养48h后，直径在0.2～1.4mm之间，菌落圆形，边缘整齐白色，表面湿润光滑，见图1。
2.2显微镜下形态：
乳酸片球菌ZJUIDS13菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，球状，见图2。
2.3 16S rDNA鉴定
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，将提取的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用细菌通用引物27F和1492R进行16S rDNA的PCR实验，PCR反应扩增结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1500bp左右，见图3，泳道1为样品(本发明菌株)，泳道2为标准品。PCR产物送至华大基因有限公司进行测序，结果如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与乳酸片球菌的鉴定的16S rDNA序列同源性超过99％。
菌株ZJUIDS13保藏信息如下：保藏名称：乳酸片球菌Pediococcus acidilactici；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.25529，保藏时间2022年08月12日。
实施例2、乳酸片球菌ZJUIDS13对溃疡性结肠炎的缓解作用
1.1灌胃菌悬液的制备
乳酸片球菌ZJUIDS13冻干粉的制备方法为：按照下文实施例9的方法制备的乳酸片球菌ZJUIDS13菌粉。
乳酸片球菌ZJUIDS13冻干粉保存在-20℃下。动物试验每天灌胃前先将冻干菌粉悬浮在PBS缓冲液(0.01M)中，灌胃给药的悬浮液中的活细胞数约为109CFU/mL。每只小鼠灌胃体积为200μL。试验期每周在MRS琼脂平板对冻干菌粉的每克活菌数进行计数校正。
1.2.小鼠溃疡性结肠炎模型的建立
在本试验中，将小鼠进行一周的适应性喂养后，将3％DSS(葡聚糖硫酸钠)溶解于灭菌的饮用水中替代小鼠正常饮用水，小鼠自由获取，连续7天，以诱导溃疡性结肠炎小鼠模型。动物福利和实验程序按照浙江大学实验动物管理条例的指导方针进行。
1.3优势菌株筛选
小鼠在进行一周的常规适应性喂养后，将雄性C57BL/6小鼠随机分为7组，每组5只，分别为正常对照组(CK组)、DSS模型组(DSS组)，5个菌株干预组，其中包括乳酸片球菌ZJUIDS13干预组(PA组)、乳酸片球菌干预组(P2组)、戊糖片球菌干预组(P3组)、约氏乳杆菌干预组(P4组)、副干酪乳杆菌干预组(P5组)，以上P2～P5组的菌株均保藏于浙江大学动物科学学院实验室。CK组给予饮用无菌蒸馏水，并每天灌胃200μl的PBS；另外6组，给予添加3％DSS的无菌蒸馏水自由饮用7天，造模期间每隔2天换用新鲜的无菌水和3％DSS溶液，其中DSS模型组在饮用DSS水的同时，每天灌胃200μl的PBS；另外5组在饮用DSS水的同时，每天分别灌胃200μl乳酸片球菌ZJUIDS13、乳酸片球菌P2、戊糖片球菌P3、约氏乳杆菌P4或者副干酪乳杆菌P5(均为含活菌数1×109CFU/mL)的菌悬液。第8天处死小鼠，解剖取出结肠，测量长度。DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎会导致结肠缩短，所以结肠长度是评价结肠炎小鼠炎症严重程度的重要指标之一。本发明通过对比小鼠结肠长度初步筛选出对于缓解溃疡性结肠炎具有较好效果的乳酸菌。
各组小鼠的结肠长度对比结果图如图4所示，正常组小鼠的结肠长度为8.31±0.10cm，模型组小鼠的结肠长度为5.74±0.39cm，极显著短于正常组(P<0.01)，说明结肠炎建模成功；与模型组相比，PA组小鼠的结肠长度显著长于DSS组(P<0.05)，为6.84±0.57cm。而P2、P3、P4、P5组小鼠的结肠与DSS组相比没有显著性差异。以上实验结果可以表明，在5株乳酸菌中，本发明的乳酸片球菌ZJUIDS13能够有效减少结肠缩短情况，所以本发明选用乳酸片球菌ZJUIDS13作为后续研究对象。
1.4乳酸片球菌ZJUIDS13对溃疡性结肠炎小鼠的缓解作用试验设计
通过动物预实验筛选的优势菌株乳酸片球菌ZJUIDS13作为本发明的研究对象，来进行如下的正式的动物实验。将小鼠进行一周的常规适应性喂养后，将雄性C57BL/6小鼠随机分为3组，每组8只，分别为正常对照组(CK组)、DSS模型组(DSS组)、乳酸片球菌ZJUIDS13干预组(PA组)。正常组小鼠每天自由饮用无菌蒸馏水，DSS模型组和乳酸片球菌ZJUIDS13干预组小鼠每天自由饮用3％DSS溶液，造模期间每隔2天换用新鲜的无菌水和3％DSS溶液。其中乳酸片球菌ZJUIDS13干预组小鼠从DSS诱导第一天开始至实验结束，每天灌一次乳酸片球菌ZJUIDS13(含活菌数1×109CFU/mL)，每只小鼠200μL，而DSS组和CK组小鼠，每天灌胃相同体积的PBS，其余饲养条件如温度、湿度、光照、饲料均一致。第8天颈椎脱臼处死小鼠，解剖取出结肠，测量长度；取0.5cm左右的结肠组织，立即放于10％福尔马林溶液中固定48h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行HE染色；其余结肠经液氮冷冻后置-80℃超低温冰箱中保藏备用。
1.5小鼠一般状况
建模期间每日定时对小鼠进行称重并记录，同时观察记录小鼠体重变化、活动状态、粪便状态和便血情况等临床症状，采用表1的标准进行评分，然后三者加和进行疾病活动指数(Disease activity index，DAI)的计算。
表1疾病活动指数的评估标准
表2小鼠患病期间疾病活动指数
a,b:P-value<0.05
实验结果如图5和表2所示。建模期间，UC模型组(即DSS模型组)出现明显的便血，粪便松散和体重下降，如图5模型组小鼠体重从第4天开始显著下降，在第七天时体重下降率达到12％左右，此外，模型组小鼠的疾病活动指数从造模第1天开始显著上升，第7天时增长至3.28±0.09(表2)，而乳酸片球菌ZJUIDS13的摄入可显著减少UC小鼠的体重下降，并改善粪便性状和便血情况，降低DAI值，这表明本发明筛选的乳酸片球菌ZJUIDS13具有缓解UC小鼠疾病症状的功能。
1.6小鼠结肠长度的评估
实验结束后处死小鼠，取结肠组织，测量盲肠末端和近端直肠之间的结肠长度。
DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎会导致结肠缩短，所以结肠长度是评价结肠炎小鼠炎症严重程度的重要指标之一。各组小鼠结肠形态图和小鼠结肠长度对比图如图6和图7所示，正常组小鼠的结肠长度为8.04±0.25cm，而模型组小鼠的结肠长度为5.52±0.83cm，极显著短于正常组(P<0.01)，说明结肠炎造模成功；与模型组相比，PA组小鼠的结肠长度显著长于DSS组(P<0.01)，为6.81±0.58cm。以上实验结果表明，乳酸片球菌ZJUIDS13能够减少结肠缩短情况。
1.7组织病理学分析
结肠组织用无菌的PBS缓冲液清理干净，放入10％的福尔马林溶液中固定，之后将所有试验小鼠的结肠组织切片通过苏木精-伊红染色后应用光学显微镜检测，在显微镜下观察结肠组织变化情况。结果如图8所示，正常组小鼠结肠粘膜上皮细胞完整，隐窝正常，腺体排列整齐有序，且无溃疡存在；与正常组相比，模型组小鼠结肠粘膜糜烂严重，隐窝几乎全部被破坏，杯状细胞急剧减少，固有层细胞浸润严重，腺体排列紊乱，而且可见严重溃疡灶；灌胃乳酸片球菌ZJUIDS13显著改善了UC小鼠结肠粘膜损伤，仅表现为轻度炎性细胞浸润和溃疡。以上实验结果表明，乳酸片球菌ZJUIDS13能够很好地保护结肠粘膜的完整性，减少炎症对结肠的损伤。
1.8肠道中的短链脂肪酸含量测定
取小鼠盲肠内容物，使用超纯水稀释3倍，旋涡5min得到约10％的混悬液，静置5min后于4℃5000×g离心25min，取1mL上清液与20μL色谱级磷酸混合，使用0.45μm的一次性针筒式过滤器将混合液过滤后直接注入色谱瓶中，使用气象色谱仪测定样本中短链脂肪酸浓度。色谱条件：以N2为载气，流速3mL/min，进样量0.2μL，分流比50，进样温度200℃，在气相色谱仪上安装SH-stabliwax(30m×0.25mm×0.25μm)极性柱。初始柱温设置80℃，保温1min，以8℃/min的速率升至170℃，接着以20℃/min的速率立即升至220℃，保温4min，总时间为18.75min。提前采用外标法进行标准曲线制作，最后根据SCFA标准曲线计算短链脂肪酸含量。
实验结果如图9所示。由实验结果可以看出，与空白组相比，模型组小鼠粪便中短链脂肪酸总量减少，尤其是乙酸和丙酸含量明显减少；乳酸片球菌ZJUIDS13灌胃处理显著提高了小鼠粪便中乙酸的含量，与模型组相比，乳酸片球菌ZJUIDS13干预组的总短链脂肪酸总量、丙酸以及丁酸含量都有提高的趋势。
实施例3、乳酸片球菌ZJUIDS13的抗氧化能力验证
1.样品制备：将于甘油管中保存的ZJUIDS13菌株在MRS固体培养基上划线分离，37℃倒置培养48h。用接种环挑取单菌落接种于灭菌MRS液体培养基中，37℃静置培养18-24h，得到培养液。将培养液用蒸馏水调整至乳酸菌菌体浓度为1010CFU/mL，4℃、8000×g离心20min，收集上清液即为发酵上清液。用0.02M PBS缓冲液(pH＝7.4)将离心后的菌体沉淀重悬洗涤，4℃、8000×g离心20min，重复3次。将洗涤干净的菌体细胞重悬于PBS缓冲液中，并调整菌体浓度为1010CFU/mL，即得到菌体悬液。
2.总抗氧化能力测定
总抗氧化能力(FRAP法)需在酶标板中加入150μL TPTZ工作液(0.3M醋酸-醋酸钠缓冲液、20mM氯化铁溶液、10mM TPTZ缓冲液，以V:V:V＝10:1:1混合，现用现配)和20μL的样品，振荡混匀，37℃反应10min，测定溶液在593nm处的吸光度。将样品测得的吸光度代入硫酸亚铁标准曲线，样品抗氧化能力以硫酸亚铁当量表示(μmol FeSO4/mL样品)。每个样品做3个平行，计算平均值。
硫酸亚铁标准曲线：配制不同质量浓度(0μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM)的硫酸亚铁溶液，将不同摩尔浓度的硫酸亚铁溶液、10mM TPTZ缓冲液、0.3M醋酸盐缓冲液以V:V:V＝1:1:10混合，取170μL混合液加入酶标板，37℃反应10min，测定溶液在593nm处的吸光度。以硫酸亚铁质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
3.还原能力测定
取1mL样品于离心管中，加入0.2M，pH6.6的PBS溶液及1％(w/v)铁氰化钾溶液各1mL，混匀。50℃水浴20min，冰浴冷却。再加入10％(w/v)三氯乙酸1mL，6000×g离心5min，取上清液1mL，加入0.1％(w/v)三氯化铁1mL、蒸馏水1mL，充分混合均匀，静置待其反应10min，测定样品在700nm处的吸光度。用PBS缓冲液或MRS液体培养基代替样品为空白组。每个样品做3个平行，计算平均值。
还原能力(％)＝[(As-Ab)/Ab]*100％
式中：As-样品组吸光度；Ab-空白组吸光度
4.DPPH自由基清除能力测定
配制不同浓度梯度的VC溶液(0-30μg/ml)。在酶标板中加入100μL待测样品(或VC标准溶液)和100μL 0.2mM DPPH乙醇溶液(无水乙醇配制,4℃避光保存，现配现用)，摇匀后于室温下避光30min，测定溶液在517nm处的吸光度；用100μL无水乙醇代替100μL DPPH乙醇溶液为空白组；用100μL PBS缓冲液(或MRS液体培养基)代替100μL待测样品为对照组，并以100μL PBS缓冲液(或MRS液体培养基)和无水乙醇混合液空白调零。每个样品重复做3个平行，计算平均值。
DPPH自由基清除能力(％)＝[1-(As-Ab)/Ac]*100％
式中：As-样品组吸光度；Ab-空白组吸光度；Ac-对照组吸光度。
表3乳酸片球菌ZJUIDS13体外抗氧化性
指标 菌体悬液 发酵上清液
总抗氧化能力/Fe2SO4当量μmol·mL-1 0.31±0.013 0.31±0.028
还原能力/％ 6.9±0.72 43.2±1.38
DPPH自由基清除率/％ 43.0±0.71 87.2±4.26
实施例4、乳酸片球菌ZJUIDS13的耐酸性及耐胆盐性的确认
1.耐酸实验
挑取乳酸片球菌ZJUIDS13单菌落在MRS液体培养基中扩大培养18h，将扩大后菌悬液以1％(v/v)的量接种到MRS肉汤培养基，37℃培养18h后，菌液的浓度达到108CFU/mL左右。将培养液于4℃经5000r/min离心5min收集菌体，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次后，菌体悬浮于pH 3.0的MRS液体培养基中，37℃培养3h。以未进行pH调节的MRS为对照，采用倾注平板法对0h和3h样品中的活菌进行计数，倾注后的平板于37℃培养48h，测定其存活率，存活率计算公式如下：
上式中，N0为测试菌株0h的活菌数(CFU/mL)；Nt为测试菌株3h的活菌数(CFU/mL)。
2.耐胆盐实验
将活化扩大后的乳酸片球菌ZJUIDS13菌悬液以1％(v/v)的量接种到MRS肉汤培养基，37℃培养18h后，菌液的浓度达到108CFU/mL左右。漩涡混匀，以2％的量接种到含0.3％(m/v)牛胆盐的MRS肉汤培养基(对照为不含牛胆盐的MRS肉汤培养基)中，于37℃培养3h。然后采用倾注平板法对样品中的活菌数进行计数。倾注后的平板于37℃培养48h。菌株的胆盐耐受能力用下式表示：
上式中，N0为对照样品中的活菌数(CFU/mL)；Nt为测试样品中的活菌数(CFU/mL)。
3.以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ATCC 53103作为对照，进行上述耐酸、耐胆盐性能测定。
表4菌株对酸和胆盐耐受性结果
4.如表4所示，乳酸片球菌ZJUIDS13的耐酸耐胆盐性能明显优于对照菌株ATCC53103。其在pH为3.0的MRS培养基中的存活率高达105.16％，在含有0.3％的牛胆盐的环境中仍具有较高的存活率。实验证明，乳酸片球菌ZJUIDS13具备较高的胃肠道生存能力。
5.益生菌必须耐受胃肠道中胃酸和胆汁等一系列不良环境，并且能在胃肠道中存活才能发挥其益生作用。结果表明，本发明提供的乳酸片球菌ZJUIDS13在pH 3.0的条件下能够生长增殖，其能顺利通过胃中的酸性环境到达小肠。
实施例5、乳酸片球菌ZJUIDS13的抗生素感受性的确认
根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)的技术指南，采用纸片扩散法来检测菌株的抗生素敏感性。离心和洗涤菌体后，控制菌体悬液浓度达到108CFU/mL。取100μL菌液均匀涂布于MRS固体培养基上。然后用无菌镊子将抗生素纸片轻压贴紧在平板表面，放于37℃恒温箱培养24h。使用游标卡尺测量并记录抑菌圈的直径，根据抑菌圈的直径大小来判断菌株的抗生素敏感性，根据CLSI制定的《抗菌药物敏感性试验执行标准》(十七版)判定乳酸菌对抗生素的耐药性，共分为三个等级，分别为敏感(S)、中介(I)和耐药(R)。
乳酸片球菌ZJUIDS13对抗生素感受性抑菌圈直径如表5所示。参考CLSI(2017)药敏试验标准可得，乳酸片球菌ZJUIDS13对头孢唑林、红霉素和氯霉素呈现敏感性。对于青霉素G、氨苄西林、头孢曲松和四环素呈现中度敏感。实验结果表明，乳酸片球菌ZJUIDS13对常见的抗生素敏感，菌株安全性较好。
表5乳酸片球菌ZJUIDS13对抗生素敏感性结果
药品名称 药片含量 抑菌圈直径(mm) 敏感类型
青霉素G 10U 23.19±0.65 I
氨苄西林 10μg 11.27±0.11 I
头孢唑林 30μg 24.59±0.76 S
头孢曲松 30μg 17.13±1.76 I
庆大霉素 10μg 9.44±0.19 R
红霉素 15μg 23.19±0.65 S
四环素 30μg 15.37±0.19 I
氯霉素 5μg 25.24±0.90 S
注：S，敏感；I，中介；R，耐药
随着抗生素在临床治疗的广泛应用，乳酸菌的耐药性也越来越严重，长期摄入耐药性的乳酸菌会给临床治疗带来很大的困难。本发明所提供的乳酸片球菌ZJUIDS13对常见的抗生素敏感，不会对人体健康造成危害。
实施例6、乳酸片球菌ZJUIDS13的病原菌抑制能力的确认
采用国际通用琼脂扩散法测定乳酸菌抗菌活性。将冻存的三个指示菌株(大肠杆菌、沙门氏菌和金黄葡萄球菌)在LB固体培养基上活化2～3次。分别挑取活化好的单菌落于LB培养基中，37℃培养18h。离心收集细菌细胞，重悬于生盐水中使浓度达到108CFU/mL。将指示菌菌悬液按1％(v/v)的量加入冷却至55℃左右的灭菌的LB固体培养基中，混合均匀后倒入培养皿中(15mL/皿)，冷凝后拔掉事先放置的无菌牛津杯。将活化后的乳酸片球菌ZJUIDS13在MRS培养基中扩大培养18h后，离心(8000rpm，5min，4℃)后收集上清液，弃去菌体沉淀。将乳酸片球菌ZJUIDS13的代谢上清加入杯孔中(200μL/孔)，并且以未接菌的MRS培养基(pH6.2)作为空白对照。在37℃下培养，24h后测量抑菌圈直径。挑选出小孔周围有明显抑菌圈的菌株，测量抑菌圈直径，每个重复三次。
如表6所示，乳酸片球菌ZJUIDS13的代谢产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌均有一定的抑制作用。可见这株菌的代谢产物具有抑菌特性。
表6菌株对病原菌抑制能力的结果(抑菌圈直径，单位mm)
a,b:P-value<0.05
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，一些大肠杆菌可引起严重腹泻和败血症，一些沙门氏菌种也会引起人类食物中毒。乳酸菌代谢产生的细菌素、有机酸、过氧化氢等抑菌产物均能单独或共同地抑制这些致病菌的生长。本发明所提供的乳酸片球菌ZJUIDS13的代谢产物对这三种致病菌具有一定的拮抗作用，这对其维持肠道微生态平衡发挥重要作用，并起到健康促进效果。
实施例7、一种具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌ZJUIDS13细菌素的制备1.一种具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌ZJUIDS13发酵上清液的制备
用接种环将乳酸片球菌ZJUIDS13接种于100mL MRS液体培养基中，放置37℃培养箱中培养18h。再以2％(体积％)的接种量转接到已灭菌的250mL MRS液体培养基中。放置在细菌培养箱中以37℃，培养18h。所得到发酵液在10000r/min下离心20min，收集菌体。将菌体悬浮于250mL蒸馏水中，在10000r/min下离心20min，收集上清液。用2M NaOH将上清液pH值调至6.0，再经0.45μm滤膜过滤后，即可得到无菌发酵上清液，保存在4℃冰箱备用。
2.硫酸铵沉淀
向乳酸片球菌ZJUIDS13发酵上清液中缓慢搅拌加入预先称量好的(NH4)2SO4固体粉末至硫酸铵终饱和度为60％。加入过程用磁力搅拌器搅拌。之后样品放置在4℃下过夜以便达到充分沉淀。在4℃下离心20min，转速10000r/min，分离沉淀。再用50mmol/L pH 6.0的磷酸缓冲液(PBS)溶解沉淀；得硫酸铵盐处理后所得的粗细菌素溶液；最后将其保藏在4℃冰箱中待用。
3.G-25葡聚糖凝胶层析
取硫酸铵盐处理后所得的粗细菌素溶液过0.22μm滤膜后缓慢加进G-25葡聚糖凝胶层析中，用超纯水洗脱，流速为1.0mL/min，同时在280nm处检测收集蛋白组分(即，收集满足有抑菌活性的活性馏分)，并用BaCl2检测收集到的蛋白组分是否有盐残留，未与BaCl2产生沉淀的蛋白组分即为纯化后的细菌素溶液，将其收集。
4.冷冻浓缩
将过葡聚糖凝胶层析后收集的细菌素溶液使用真空冷冻浓缩。细菌素溶液于-80℃超低温冰箱预冻不少于2h后，迅速取出放入真空冷冻干燥机中进行抽真空处理，真空度维持约0.1P。浓缩至原体积的1/5后，开真空冷冻干燥机取出细菌素，放入4℃冰箱，待其冻结状态缓慢溶解。即可得到乳酸片球菌ZJUIDS13的细菌素。
5.乳酸片球菌ZJUIDS13制备的细菌素的抑菌活性分析
取指示菌菌液100μL分别均匀涂布于指示菌相应的常用固体培养基上，用牛津杯打孔(孔径6mm)，乳酸片球菌ZJUIDS13的细菌素加样量50μL/孔，4℃扩散2h，放入37℃培养箱过夜培养后，测定抑菌圈直径大小，结果如表7所示。
表7抑菌谱测定结果
从上表7可以看出，乳酸片球菌ZJUIDS13制备的细菌素对致病菌金黄鱼葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌均有明显抑菌效果。说明乳酸片球菌ZJUIDS13制备的细菌素既能抑制革兰氏阳性菌，也能抑制革兰氏阴性菌，是一类具有广谱抑菌活性的细菌素。
对比1：
现有的乳酸片球菌Pediococcus acidilactici(CGMCC No.17943)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)KBL697对于缓解DSS小鼠结肠炎症状的效果，按照上述实施例2中的“1.4”溃疡性结肠炎小鼠试验设计方式对小鼠的结肠长度进行相应的评估。
本发明的乳酸片球菌ZJUIDS13干预组的小鼠结肠长度约是DSS模型组的1.24倍；而CGMCC No.17943干预组的小鼠结肠长度约是DSS模型组的1.06倍；KBL697干预组小鼠结肠长度约是DSS模型组的1.08倍。所以本发明菌株乳酸片球菌ZJUIDS13可以较好的减轻DSS小鼠结肠炎症状。
实施例8、一种具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌ZJUIDS13发酵剂的制备
将乳酸片球菌ZJUIDS13的原始菌种接种于11％的脱脂乳(115℃灭菌20min)中，37℃培养18-24h至凝乳，连续活化两代，作为母发酵剂。将母发酵剂按3％-5％接种量接种于11％的的脱脂乳(115℃灭菌20min)中，37℃培养18-24h至凝乳，此时活菌数可达到109-1010CFU/mL，即得到乳酸片球菌ZJUIDS13发酵剂。
实施例9、利用一种具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌ZJUIDS13制备菌粉
用接种环将乳酸片球菌ZJUIDS13接种于50mL MRS液体培养基中，放置37℃培养箱中培养18h。再以5％的接种量转接到已灭菌的250mL MRS液体培养基中。放置在细菌培养箱中以37℃，培养24h。所得发酵液离心(5000r/min，10分钟)，之后弃去上清液收集菌体沉淀，用无菌磷酸缓冲液(PBS)漂洗菌体2次，每次10min，离心速度为5000r/min。即可得到乳酸片球菌ZJUIDS13菌体沉淀。
分别称取海藻糖4.1g、谷氨酸钠2.8g、蔗糖8g溶于10mL 40℃蒸馏水中，采用0.22um微孔滤膜过滤除菌后加入到90mL无菌水中，得溶液Ⅰ，备用。取脱脂乳粉15g溶于蒸馏水中，得到15％脱脂乳粉溶液100mL，110℃灭菌，得溶液Ⅱ，备用。溶液Ⅰ与溶液Ⅱ按照1:1的体积比例进行混合，得保护剂溶液。
将上述制备的乳酸片球菌ZJUIDS13菌体沉淀按1:5(g/ml)的比例与保护剂溶液充分混匀，即制得菌悬液。取5mL菌悬液分装入10mL无菌带塞玻璃瓶中，放在-70℃下预冻，2h后取出置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干条件为真空度5Pa、隔板加热温度20℃、冷阱温度为-55℃，冻干30h后破碎即可得到乳酸片球菌ZJUIDS13菌粉。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.具有缓解溃疡性结肠炎功效的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS13，其特征在于保藏号为：CGMCC NO.25529。
2.如权利要求1所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS13在制备具有缓解溃疡性结肠炎功效的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述具有缓解溃疡性结肠炎功效的产品为具有缓解溃疡性结肠炎功效的药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS13用于制备具有缓解溃疡性结肠炎功效的活菌制剂。
5.如权利要求1所述的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZJUIDS13的用途，其特征在于：制备乳酸菌细菌素。
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