CN117143767A - 可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌msjk0025及其应用 - Google Patents
可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌msjk0025及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一株可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025及其应用。所述母乳源发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）MSJK0025保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26426。本申请所提供的母乳源发酵粘液乳杆菌是一株分离自健康产妇母乳的新菌株，并命名为发酵粘液乳杆菌MSJK0025，其具有较好的抗生素敏感性，且性状可稳定遗传；对酸、胆盐、人工胃/肠液耐受性较好；生长速度快，且安全性较好。同时该菌株具有较强的肠道定植能力，能有效抑制如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和白色念珠菌等肠道内致病菌，而对乳杆菌和双歧杆菌等肠道益生菌均无抑制作用，在调节肠道菌群方面应用前景广阔。
Description
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025及其应用。
背景技术
越来越多的研究表明，共生菌群与宿主的健康和疾病有着密不可分的关系。肠道菌群可被视为身体中的“微生物器官”，通过菌群的组成、代谢物和次级代谢产物，以及共生菌移位等机制，参与调控宿主的代谢、免疫、内分泌、神经等多方面的局部和全身性生理过程，从而引起肥胖、II型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病、自身免疫和炎症性疾病、精神神经疾病和癌症等疾病发生的风险。
母乳作为婴儿成长初期必不可少的营养来源，对婴儿的成长发育起着至关重要的作用。母乳现已被证实存在活菌，母乳中具有益生特性的微生物是婴儿初步构建免疫系统并抵御疾病的基础，它通过竞争排斥，将占据在婴儿肠道内的病原菌替代，并定植，通过发挥其益生特性改善婴儿肠道环境。
发酵粘液乳杆菌是母乳源微生物中的一种，属于产乳酸菌，被广泛的应用于食品、医药和农业等领域。如西班牙BiosearchLife公司的知名菌株发酵粘液乳杆菌CECT5716，就是分离自母乳的益生菌，具有预防和治疗哺乳期乳腺炎，缓解哺乳期乳房的肿胀疼痛等症状，提高母婴的免疫力和肠道健康。该菌种已列入欧盟安全资格认定(QPS)推荐的生物制剂列表中，并列入国际乳业联盟(IDF“具有在食品中安全使用记录史的微生物清单”。2011年，发酵粘液乳杆菌列入我国《可用于食品的菌种名单》。而且，该菌种已通过美国食品药品监督管理局的GRAS(一般认为安全的物质)认定，可用于婴幼儿配方粉。含有发酵粘液乳杆菌CECT5716的婴幼儿配方粉在欧洲和亚洲等多个国家(地区)均有销售。
但益生菌的健康功效具有菌株差异性，同一个种的不同菌株可能会产生对人体的不同作用。有研究也证实，某些发酵粘液乳杆菌的菌株可能对人体具有负面影响，如可能会降低肠道细胞屏障的完整性。另外，益生菌一般为经口服用，要发挥其益生特性，需要通过胃肠屏障(特别是胃酸、胆汁)的考验。胆汁由肝脏分泌，经胆囊进入“十二指肠(小肠的一部分)”，对益生菌有较强的杀灭作用。十二指肠中胆盐浓度在0.03％-0.3％波动，而食物在十二指肠的存留时间约为4-6h。正常情况下，人空腹时的胃液pH为0.9-1.5，饭后胃液pH在3.5以上，而胃排空时间大概在3h。现有的一些包括发酵粘液乳杆菌在内的益生菌菌株，往往在抗逆性方面参差不齐，这直接影响到益生菌的功效。同时，对抗生素的耐药性是益生菌安全性评价的一个重要指标，现有的益生菌菌株因分离来源不同，其基因组中往往存在耐药基因，从而对抗生素具有耐药性，存在安全隐患；甚至现有菌株的基因组中往往存在一些毒力因子，虽然经口急性毒理试验显示安全，但还是存在“基因迁移”的可能，因此具有潜在的风险性。最后，益生菌要发挥功效就需要在肠道定殖，而菌株肠道定殖最主要的影响因素就是对胃液、胆盐的耐受性，现有的一些益生菌菌株耐受性参差不齐，往往导致其肠道定殖能力较差。以上这些存在于现有益生菌中的不足，都在实际应用中极大的影响和制约了益生菌发挥其益生功效。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025，该菌株是2021年9月于浙江省杭州市临平区分离自健康产妇母乳，对酸、胆盐、人工胃/肠液耐受性较好，具有较强的肠道定植能力等特点，能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和白色念珠菌等多种肠道致病菌，而对乳杆菌和双歧杆菌等肠道益生菌均无抑制作用，在调节肠道菌群方面应用前景广阔。
为此，本申请第一方面提供了一株可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025，所述母乳源发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)MSJK0025保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26426。
本申请的发明人通过在健康的产妇母乳内进行分离筛选，最终获得一株无溶血性，且具有较好的耐酸、耐人工胃液、耐胆盐和耐人工肠液的菌株。根据细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列(GenBank中的序列号为OP861710.1)等实验数据分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》、International Journal ofSystematic and EvolutionaryMicrobiology等有关研究论文，鉴定其为“发酵粘液乳杆菌”，并正式命名为“发酵粘液乳杆菌MSJK0025”。该菌株于2023年01月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26426。
在一些实施方式中，所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且在GeneBank中的登录号为OP861710.1。
本申请中，所述16S rRNA的核苷酸序列为所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025的16S rRNA的基因序列。
在一些实施方式中，所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025的全基因组序列在GeneBank中的登录号为CP121468.1。
本申请中，通过对所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025的全基因组数据分析，结果显示：未检测到毒力因子，判断该菌株无致病危害；未检测到抗生素耐药基因，具有较好的抗生素敏感性，且性状可稳定遗传；且该菌株可产生有利于肠道定植的胞外多糖，具有较强的肠道定植能力，这是其发挥益生特性的基础，该菌株的发现有利于打破欧美等国家对中国益生菌市场的垄断。
本申请第二方面提供了一种如本申请第一方面所述的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025在制备抑制肠道致病菌的益生菌组合物中的应用。
本申请中，所述的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025在肠道内的定植能力强，并对肠道内的致病菌具有明显的抑制作用，因此能较好地应用在制备调节肠道菌群平衡的益生菌组合物中。
在一些实施方式中，所述肠道致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和白色念珠菌中的一种或多种。
本申请的发明人通过抑菌圈实验发现，本申请所述的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025对肠道致病菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和白色念珠菌均有抑制作用，其抑制效果排序：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞鼠伤寒沙门氏菌＞白色念珠菌；而对肠道内的益生菌如乳杆菌和双歧杆菌等却没有抑制作用。
在一些实施方式中，所述益生菌组合物为口服制剂。
本申请中，所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025具有较强的耐酸、耐人工胃液、耐人工肠液和耐胆盐等性能，因此包括所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025的益生菌组合物可以为口服制剂，通过口服使用即可使本申请所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025发挥益生作用。
本申请第三方面提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物中包括如本申请第一方面所述的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025。
本申请中，所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025可产生有利于肠道定植的胞外多糖，具有较强的肠道定植能力，而这是其发挥调节肠道菌群作用的基础。另外，益生菌要发挥益生功能，必须以存活状态到达人体小肠和大肠，应对消化道中的多重胁迫，而本申请中的发酵粘液乳杆菌MSJK0025具有较强的耐酸性和胆汁耐受性，可以有效应对胃部酸性环境和胆汁。即本申请所述的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025能够通过黏附性定植于肠道中，从而保持与宿主相互作用，发挥其益生功效，因此能作为一种效果良好的益生菌组合物。
本申请第四方面提供了一种用于调节肠道菌群平衡的药物组合物，所述药物组合物中包括如本申请第一方面所述的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025。
本申请中，所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025能够有效在肠道内定植，且对肠道内的致病菌(如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和白色念珠菌)具有明显的抑制作用，而对肠道内的有益菌(如植物乳植杆菌、长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌)均没有抑制作用，因此包括所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025的药物组合物具有较好的调节肠胃菌群平衡的作用。
本申请中，所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。本申请中，所述药学上可接受的载体包括但不限于任何药学上可接受的赋形剂、表面活性剂、干燥剂、稀释剂、载剂、佐剂或添加剂。合适的药学上可接受的载体例如可以为碳酸镁、乳糖、果胶、糊精、淀粉、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和可可脂等。本申请中，药学上可接受的载体可以是固体、半固体或液体。
本申请第五方面提供了一种用于调节肠道菌群平衡的功能性食品，所述功能性食品中包括如本申请第一方面所述的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025。
如上所述，本申请所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025能够有效在肠道内定植，且对肠道内的致病菌具有明显的抑制作用，而对肠道内的有益菌均没有抑制作用，因此本申请所述的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025还能应用在具有调节肠道菌群平衡作用的功能性食品中。
本申请中，所述功能性食品，例如可以为发酵乳、发酵果蔬或者酵素等。
本申请的有益技术效果为：本申请所提供的母乳源发酵粘液乳杆菌是一株分离自健康产妇母乳的新菌株，并命名为发酵粘液乳杆菌MSJK0025，其具有较好的抗生素敏感性，且性状可稳定遗传；对酸、胆盐、人工胃/肠液耐受性较好；生长速度快，且安全性较好(无溶血性、未检测到毒力因子、未检测到抗生素耐药基因)。同时该菌株可产生有利于肠道定植的胞外多糖，具有较强的肠道定植能力，且能有效抑制多种肠道内致病菌，具有优异的调节肠道菌群平衡的功能，应用前景广阔。另外，本申请所述发酵粘液乳杆菌MSJK0025具有优异的益生菌性能，加强了本土化益生菌菌株的开发，有利于打破欧美等国家对中国益生菌市场的垄断。
附图说明
图1为实施例1中对各稀释梯度的母乳样本培养后的平板菌落图。
图2为实施例1中MSJK0025菌株在平板上的划线分离照片图。
图3为实施例1中MSJK0025菌株在平板上的菌落照片图。
图4为实施例1中MSJK0025菌株的革兰氏染色镜检照片图。
图5为实施例1中MSJK0025菌株的扫描电镜照片图。
图6为实施例2中发酵粘液乳杆菌MSJK0025的溶血性检测平板照片图。
图7为实施例6中经样品(发酵粘液乳杆菌MSJK0025)处理后斑马鱼肠道荧光强度典型图。
图8为实施例6中经样品(发酵粘液乳杆菌MSJK0025)处理不同时间后斑马鱼肠道荧光强度。
图9为实施例7中发酵粘液乳杆菌MSJK0025对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、植物乳植杆菌、长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的抑菌效果图。
生物保藏信息
发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)MSJK0025，保藏编号为CGMCCNo.26426，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏时间为2023年01月09日。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：发酵粘液乳杆菌MSJK0025的分离、筛选和鉴定
1、分离纯化
由于目前的益生菌大多数为乳酸菌，所以在此以乳酸菌为主要目标菌株进行分离筛选。乳酸菌在生长代谢过程中，会产生乳酸等有机酸，如果在MRS培养基中加碳酸钙，那么平板培养时菌落周围形成透明圈-“溶钙圈”，可作为乳酸菌初筛的指标。溶钙圈越大，说明产酸能力越强。所以，优先选取溶钙圈较大的菌落，进行进一步划线分离。具体的分离纯化方式如下：
新鲜母乳样本，用无菌生理盐水进行梯度稀释至10-1、10-2和10-3，分别涂布于含有0.3％CaCO3的MRS培养基上，每个梯度做2个平行，然后将涂布后的平板于36℃培养箱中培养48h，培养后各稀释梯度的平板菌落如图1所示。挑取具有明显透明圈-“溶钙圈”的呈白色或乳白色的、长势良好的单菌落进行革兰氏染色并镜检，选取形态为杆状、革兰氏染色为阳性的菌株，经5次以上划线分离获得纯菌株。其中MSJK0025菌株的划线分离照片和菌落照片分别如图2和图3所示；MSJK0025菌株的革兰氏染色镜检照片和扫描电镜照片分别如图4和图5所示。从图4和5可知，革兰氏染色镜检照片显示MSJK0025菌株为革兰氏阳性菌，杆状；同时扫描电镜照片显示菌体呈杆状、表面光滑、无纤毛或鞭毛，无芽孢。最后，将分离得到的纯菌株于36℃培养箱中进行富集培养，将菌液与浓度为50％的无菌甘油水溶液按照1:1的比例进行混合，于-86℃的超低温冰箱中保存。
2、16S rRNA测序初筛对分离到的所有单菌株进行16S rRNA测序，经比对发现MSJK0025菌株的16S rRNA的基因序列与发酵粘液乳杆菌相似度最高，达到100.00％(比对菌株为Limosilactobacillus fermentum(CIP 102980))，因此初步判定其为发酵粘液乳杆菌，编号为MSJK0025。其中MSJK0025菌株的16S rRNA的基因序列具体如下所示：
AATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGT
GAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTA
ATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCATATCGCTATCAC
TTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGAT
GATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATAC
TCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAA
CACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTAAAAGAAGAACAC
GTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACG
TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAA
GAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTVTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGT
GCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCG
GTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAA
CTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAT
GCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAAC
GCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGAC
GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTT
ACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAG(SEQID NO:1)。
3、菌种鉴定及保藏为进一步明确MSJK0025菌株的分类学地位，从细胞形态、生理生化特征和分子生物学角度进行鉴定(委托中科院微生物所进行)，其中MSJK0025菌株的细胞形态和生理生化特征检测结果如表1所示。
表1：MSJK0025菌株的细胞形态和生理生化特征检测结果
注：表中的F1表示第一代MSJK0025菌株，F5表示第五代MSJK0025菌株。
对表1中MSJK0025菌株的细胞形态和生理生化特征检测结果，以及MSJK0025菌株16S rRNA的基因序列(GenBank中的序列号为OP861710.1)等实验数据进行分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》、International Journal ofSystematic and EvolutionaryMicrobiology等有关研究论文，鉴定其为“发酵粘液乳杆菌”，并正式命名为“发酵粘液乳杆菌MSJK0025”。该菌株于2023年01月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26426。
实施例2：发酵粘液乳杆菌MSJK0025的溶血性试验
发酵粘液乳杆菌MSJK0025活化后，接种于血平板，以溶血性葡萄球菌为阳性对照，36℃厌氧培养48h，观察其溶血性，培养后的平板照片如图6所示。
如图6所示，阳性对照(溶血性葡萄球菌)有菌落长出，出现溶血现象；发酵粘液乳杆菌MSJK0025有菌落长出，且未出现溶血现象。说明发酵粘液乳杆菌MSJK0025无溶血性，不会导致细菌溶血性疾病，安全性较好。
实施例3：发酵粘液乳杆菌MSJK0025的抗生素敏感性试验
采用K-B法，测定发酵乳杆菌MSJK0025对30种常见抗生素的敏感性，对F1代菌株和F5代菌株的抗生素敏感性进行检测，结果如表2所示。
表2：发酵粘液乳杆菌MSJK0025的抗生素敏感性试验结果
注：表中的F1表示第一代MSJK0025菌株，F5表示第五代MSJK0025菌株。
从表2可知，发酵粘液乳杆菌MSJK0025具有较好的抗生素敏感性，对绝大多数抗生素不具有耐药性，且性状可稳定遗传。
实施例4：发酵粘液乳杆菌MSJK0025全基因组测序及分析
对发酵粘液乳杆菌MSJK0025进行全基因组测序，全基因组序列提交Genebank，获得序列号CP121468.1。该菌株的全基因组序列与Lactobacillus fermentum的标准菌株基因组之间的ANI值(基因组平均遗传相似度，Aversge nucleotide identity,ANI)为97.6284％。
发酵粘液乳杆菌MSJK0025的全基因组数据分析结果分别如表3-5所示。
表3：发酵粘液乳杆菌MSJK0025中与调节肠道菌群相关的基因
表4：发酵粘液乳杆菌MSJK0025的全基因组中的肠道定植相关基因
表5：发酵粘液乳杆菌MSJK0025的基因组结构
通过对表3-5中发酵粘液乳杆菌MSJK0025的全基因组数据进行分析，获得以下结论：
(1)未检测到毒力因子，判断该菌株无致病危害；
(2)未检测到抗生素耐药基因；
(3)该菌株存在有利于肠道定植的胞外多糖；
(4)该菌有较强的耐酸性、粘附性、胆汁耐受性、竞争性、持久性，利于在肠道内定植。
实施例5：发酵粘液乳杆菌MSJK0025的体外耐受性试验
1、试验方案
下述试验中的对照组均为：知名商业化菌株发酵粘液乳杆菌CECT5716；实验组均为：发酵粘液乳杆菌MSJK0025。
耐酸性试验：以MRS肉汤培养基为基础培养基。按照1％的接种量，将菌种分别接种于对照培养基(基础培养基，pH6.0)、pH2.0、pH3.0、pH4.0和pH5.0的基础MRS培养基。37℃静置培养17h。用无菌生理盐水进行10倍系列梯度稀释，然后进行菌落计数。存活率测定公式为：
P＝lgP1/lgP0
其中，P—受试菌株活菌对数比率，％；P0—对照组活菌数，CFU/mL；P1—实验组活菌数，CFU/mL。
耐胆盐试验：以MRS肉汤培养基培养菌液约17h；吸取1mL菌液，接种于4根含有10mLMRS肉汤培养基的无菌离心管中；配置高浓度胆盐母液，过滤除菌，加入离心管中使胆盐含量分别为0％、0.1％、0.2％和0.3％，然后于36℃培养，分别在0、2、4、6h测定活菌数。存活率测定公式为：
P＝lgP1/lgP0
其中P—受试菌株存活率，％；P0—对照组活菌数，CFU/mL；P1—实验组活菌数，CFU/mL。
耐人工胃/肠液试验：以MRS肉汤培养基分别培养发酵粘液乳杆菌MSJK0025和发酵粘液乳杆菌CECT5716，培养菌液约17h。菌液摇匀，取10mL于4000rpm离心4min，菌泥用PBS缓冲液洗涤3次，然后分别重悬于10mL人工胃液中/人工肠液，37℃保温消化。分别于0、1、2、3h取样测定人工胃液组的活菌数；分别于0、2、4、6h取样测定人工肠液组的活菌数。存活率测定公式为：
P＝lgP1/lgP0
其中P—受试菌株活菌对数比率，％；P0—消化0小时活菌数，CFU/mL；P1—消化n小时活菌数，CFU/mL。
2、结果及分析
(1)对酸耐受性
乳酸菌在代谢过程中会产生大量的有机酸，所以都具有一定的耐酸能力，这是作为益生菌通过胃液屏障的关键因素之一。此外，耐酸性也是发酵过程中影响菌体产率的重要因素。发酵粘液乳杆菌MSJK0025和CECT5716在不同pH值下进行培养的存活率见表6。
表6：发酵粘液乳杆菌MSJK0025和CECT5716对酸的耐受性结果
| 处理方式 | MSJK0025活菌对数比率(％) | CECT5716活菌对数比率(％) |
| CK(pH6.0的MRS培养基) | 100.00 | 100.00 |
| pH 2.0的MRS肉汤培养基 | 56.90 | 58.21 |
| pH 3.0的MRS肉汤培养基 | 69.14 | 66.35 |
| pH 4.0的MRS肉汤培养基 | 82.18 | 83.06 |
| pH 5.0的MRS肉汤培养基 | 88.72 | 89.23 |
从表6可知，随着pH值的增加，菌株MSJK0025和CECT5716活菌数对数比率均呈增加的趋势，且二者增加的幅度比较接近。
(2)对胆盐耐受性
胆汁由肝脏分泌，经胆囊进入“十二指肠(小肠的一部分)”，对益生菌有较强的杀灭作用。十二指肠中胆盐浓度在0.03％-0.3％波动，而食物在十二指肠的存留时间约为4-6h。发酵粘液乳杆菌MSJK0025和CECT5716在不同胆盐浓度下的存活率见表7。
表7：发酵粘液乳杆菌MSJK0025和CECT5716对胆盐耐受性结果
从表7可知，菌株MSJK0025的耐胆盐能力略低于菌株CECT5716，但差异不大。
(3)对人工胃液耐受性
正常情况下，人空腹时的胃液pH为0.9-1.5，饭后胃液pH在3.5以上，而胃排空时间大概在3h。发酵粘液乳杆菌MSJK0025和CECT5716在不同pH值的人工胃液中的存活率见表8。
表8：发酵粘液乳杆菌MSJK0025和CECT5716对人工胃液的耐受性结果
从表8可知，菌株MSJK0025在pH 1.5的人工胃液中处理1h仍有21.20％存活率，而菌株CECT5716则检测不到活菌。随着pH的增加，二者耐受性增加且较为一致。总的体来看，菌株MSJK0025耐胃酸能力略优于菌株CECT5716。
(4)对人工肠液耐受性
肠道是消化道内益生菌定植的主要场所，发酵粘液乳杆菌MSJK0025和CECT5716在人工肠液中处理不同时间的存活率见表9。
表9：发酵粘液乳杆菌MSJK0025和CECT5716对人工肠液的耐受性结果
| 处理方式 | MSJK0025活菌对数比率(％) | CECT5716活菌对数比率(％) |
| 37℃消化0h | 100.00 | 100.00 |
| 37℃消化2h | 99.58 | 99.79 |
| 37℃消化4h | 98.75 | 99.79 |
| 37℃消化6h | 98.85 | 99.58 |
从表9可知，随着消化时间的延长，菌株MSJK0025和CECT5716活菌对数比率均略有降低，但降低幅度很小，且差异不大，消化6h后活菌对数比率均在99％左右。数据说明，菌株MSJK0025在人工肠液中的存活能力较强，且与菌株CECT5716较为接近。
3、结论
西班牙Biosearch Life公司的“发酵粘液乳杆菌CECT5716(来自母乳)”是知名的商业化菌株。试验数据显示，菌株MSJK0025的耐酸、耐胆盐、耐胃液、耐肠液能力与CECT5716总体差异不大。
实施例6：发酵粘液乳杆菌MSJK0025在斑马鱼肠道的定植检测
1、肠道定植MTC(最大检测浓度)测定
随机选取受精后5天的野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品(浓度见表10)，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL。28℃处理24h后，测定样品对正常斑马鱼肠道定植的MTC，结果如表10所示。
表10：发酵粘液乳杆菌MSJK0025肠道定植浓度实验结果(n＝30)
从表10可知，在测试条件下，发酵粘液乳杆菌MSJK0025肠道定植实验的MTC为2.50×109CFU/mL。
2、肠道定植时间测定
使用DIO绿色荧光标记发酵粘液乳杆菌MSJK0025和发酵粘液乳杆菌CECT5716，随机选取受精5天的野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予发酵粘液乳杆菌MSJK0025 2.50×109CFU/mL和发酵粘液乳杆菌CECT5716 2.50×109CFU/mL，每孔容量为3mL。平行设置4次生物学重复。28℃处理24h，移除益生菌，28℃继续处理0、6、24和48h后，每个实验组分别随机选择10尾斑马鱼置于荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片(如图7所示)，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼肠道荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品肠道定植情况，结果如表11和图8所示。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
表11：发酵粘液乳杆菌MSJK025在斑马鱼肠道中的定植实验结果(n＝10)
注：与发酵粘液乳杆菌MSJK0025 0h比较，***p<0.001；与发酵粘液乳杆菌MSJK0025 48h比较，#p<0.05；与发酵粘液乳杆菌CECT5716 0h比较，$p<0.05，$$$p<0.001从表11和图8可知，在测试条件下，发酵粘液乳杆菌MSJK0025和发酵粘液乳杆菌CECT5716均能在斑马鱼肠道定植，有效定植时间分别为24h和6h。两种菌在0、6和24h时斑马鱼肠道荧光强度均没有差异，在48h时存在显著差异。
实施例7：发酵粘液乳杆菌MSJK0025的抑菌实验
将发酵粘液乳杆菌MSJK0025于MRS液体培养基培养约17h。分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、植物乳植杆菌、长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌为指示菌，活化后制备菌液，将指示菌菌液均匀涂布于营养琼脂平板；在平板表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压，使其与培养基紧密接触；吸取200μL发酵粘液乳杆菌MSJK0025菌液加入牛津杯中，37℃静置培养24h后，测量抑菌圈直径，结果如表12和图9所示。
表12：发酵粘液乳杆菌MSJK0025的抑菌实验结果
| 指示菌 | 抑菌圈直径平均值(mm) |
| 大肠杆菌 | 30.92 |
| 金黄色葡萄球菌 | 16.22 |
| 鼠伤寒沙门氏菌 | 12.64 |
| 白色念珠菌 | 11.42 |
| 植物乳植杆菌 | - |
| 长双歧杆菌 | - |
| 嗜酸乳杆菌 | - |
从表12可知，发酵粘液乳杆菌MSJK0025对肠道内的致病菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和白色念珠菌均有抑制作用，其抑制效果排序：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞鼠伤寒沙门氏菌＞白色念珠菌；而对肠道内的益生菌：植物乳植杆菌、长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌均无抑制作用。
实施例8：发酵粘液乳杆菌MSJK0025对肠道菌群调节作用
取30只健康生长的小鼠，随机分成两组，一组为实验组(15只)，每天灌喂发酵粘液乳杆菌MSJK0025的培养液1.5mL，培养液中发酵粘液乳杆菌MSJK0025活菌数≥1×109CFU/mL，连续5d；另一组为对照组，每天灌喂空白MRS培养液1.5mL，连续5d。分别取各组小鼠的粪便检测小鼠肠道微生物变化情况，检测结果以lg10n/mL表示，结果如表13所示。其中，统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
表13：发酵粘液乳杆菌MSJK0025对肠道菌群调节作用：
| 肠道细菌 | 对照组 | 实验组 |
| 乳杆菌 | 8.47±0.53 | 9.38±0.48** |
| 双歧杆菌 | 9.26±0.32 | 10.21±0.37** |
| 大肠杆菌 | 7.48±0.36 | 7.41±0.29 |
| 产气荚膜梭菌 | 6.14±0.41 | 6.01±0.52 |
注：与对照组比较，**P＜0.05
从表13可知，与对照组相比，灌喂发酵粘液乳杆菌MSJK0025可以使小鼠肠道内的乳杆菌和双歧杆菌的含量明显增加，而大肠杆菌和产气荚膜梭菌则有一定程度的含量降低。表明，发酵粘液乳杆菌MSJK0025对肠道菌群具有调节作用。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请做出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (9)
1.可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025，其特征在于，所述母乳源发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）MSJK0025保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26426。
2. 根据权利要求1所述的母乳源发酵粘液乳杆菌，其特征在于，所述母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，且在GeneBank中的登录号为OP861710.1。
3.根据权利要求1或2所述的母乳源发酵粘液乳杆菌，其特征在于，所述母乳源发酵粘液乳杆菌的全基因组序列在GeneBank中的登录号为CP121468.1。
4.一种如权利要求1-3中任意一项所述的母乳源发酵粘液乳杆菌MSJK0025在制备抑制肠道致病菌的益生菌组合物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肠道致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和白色念珠菌中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述益生菌组合物为口服制剂。
7.一种益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物中包括如权利要求1-3中任意一项所述的母乳源发酵粘液乳杆菌。
8.一种用于调节肠道菌群平衡的药物，其特征在于，所述药物中包括如权利要求1-3中任意一项所述的母乳源发酵粘液乳杆菌。
9.一种用于调节肠道菌群平衡的食品，其特征在于，所述食品中包括如权利要求1-3中任意一项所述的母乳源发酵粘液乳杆菌。
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