CN114317366B - 菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及菌株及其应用。该菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，保藏编号为CGMCC No.23526。该菌株可以菊粉和/或低聚果糖为唯一碳源，并获得优于以葡萄糖为唯一碳源的生长能，比鼠李糖乳杆菌GG有更强的益生元利用能力；有良好的耐酸耐胆盐能力；对致病菌具有良好的抑制作用；同时对氨苄西林、青霉素、克拉霉素和四环素敏感，具有良好的益生功能和安全性。

Description

菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及特别涉及菌株及其应用。

背景技术

乳酸菌是一类能够利用碳水化合物代谢产生大量乳酸的细菌的统称，与人类生活密切相关，研究表明其具有缓解乳糖不耐受、降低胆固醇水平、调节肠胃道菌群平衡、增强机体免疫力等功效，在工业乳酸生产、食品发酵及保健食品等领域得到了广泛应用。母乳来源乳酸菌更容易适应婴幼儿肠道环境，且有较好的安全性。

益生元通常是在小肠中不易消化的寡糖类物质，常见益生元包括低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖及菊粉等。由于动物胃肠道内水解益生元的酶系统比较缺乏，因此大部分益生元物质可以顺利通过胃和小肠并且被结肠内的有益菌(双歧杆菌和乳酸杆菌等)分解利用，而有害菌利用率极低或不能利用，从而选择性促进有益菌的大量生长繁殖。

合生元由益生菌和益生元组成，二者相辅相成，共同发挥作用，对肠道的微生态具有调节作用，可以预防和治疗疾病。经常食用益生菌和益生元能够调节肠道菌群、促进食物的消化和加快代谢物排泄、降低肠道的发病率和缩短感染持续时间，调节过敏性反应，增强机体免疫功能，预防治疗疾病等。

目前国家允许使用到婴幼儿食品的菌株主要来自国外，尚无来自中国母乳的菌株。本发明筛选到一株中国母乳源、对于低聚果糖和/或菊粉具有高利用能力的益生菌。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了菌株及其应用，该菌株具有益生元利用能力、有良好的耐酸耐胆盐能力、对致病菌具有良好的抑制作用、同时对一些常用抗生素敏感，具有良好的益生功能和安全性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，保藏编号为CGMCCNo.23526。

本发明还提供了上述菌株以菊粉和/或低聚果糖为唯一碳源制备产品中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，上述菊粉和/或低聚果糖的总浓度介于1％～6％。

在本发明的一些具体实施方案中，上述菊粉和/或低聚果糖的总浓度为1％、2％、3％、4％、5％或6％。

本发明还提供了上述菌株的发酵方法，以菊粉和/或低聚果糖为唯一碳源培养所述菌株。

在本发明的一些具体实施方案中，上述发酵方法的pH为6.5，上述发酵方法的温度为37℃。

本发明还提供了上述菌株在制备微生物制剂或发酵制品中的应用。

本发明还提供了微生物制剂，包括上述菌株以及可接受的辅料或助剂。

在本发明的一些具体实施方案中，上述辅料或助剂包括营养强化剂、甜味调节剂、酸度调节剂和/或等渗调节剂。

在本发明的一些具体实施方案中，上述营养强化剂包括低聚糖、果糖、乳糖、葡萄糖、麦麸和/或奶粉。

在本发明的一些具体实施方案中，上述微生物制剂还包括其他任意微生物。

在本发明的一些具体实施方案中，上述微生物制剂还包括酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌和/或放线菌等。

本发明还提供了上述微生物制剂在制备发酵制品中的应用。

本发明还提供了发酵制品，包括取发酵菌培养，收集发酵产物；

所述发酵菌包括本发明的菌株或上述微生物菌剂。

在本发明的一些具体实施方案中，上述发酵制品包括发酵乳、乳饮料、发酵果蔬饮料、合生元制剂或含益生元的食品中的一种或多种。

本发明获得的菌株具有如下效果：

1、耐胆盐试验结果表明本发明的菌株经胆盐处理后存活率达18.36±0.95％，具有耐胆盐能力。

2、耐酸试验结果表明本发明的菌株经胃酸处理后存活率达86.29±0.65％，具有耐酸能力。

3、抑菌试验结果表明，本发明的菌株对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌均具有明显的抑制效果，抑菌圈直径均大于15mm。

4、药敏试验结果表明，本发明的菌株对利福平、氨苄西林、头孢唑林(先锋)、头孢唑林、克拉霉素、青霉素、氯霉素和四环素敏感，抗生素敏感性显著优于鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)，具有良好的安全性。

5、本发明的菌株在以菊粉或低聚果糖作为唯一碳源培养基生长情况优于其它培养基，培养达到稳定期时，以菊粉、低聚果糖为碳源的发酵液OD₆₀₀值均大于普通的MRS培养基，OD₆₀₀值最高可达到1.453，说明本发明的菌株对菊粉、低聚果糖的利用能力较好。

生物保藏说明

生物材料：AUH2102，分类命名：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，于2021年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC NO.23526。

本发明中所述AUH2102即为上述保藏编号为CGMCC NO.23526的菌株。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示副干酪乳杆菌AUH2102在不同益生元中的生长曲线图；

图2示鼠李糖乳杆菌GG在不同益生元中的生长曲线图；

图3示副干酪乳杆菌AUH2102的划线平板菌落形态；

图4示副干酪乳杆菌AUH2102的光学显微镜图。

具体实施方式

本发明公开了一种菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的目的在于提供一株具有益生元利用能力的适用于合生元食品制备或发酵食品的母乳来源副干酪乳杆菌。

本发明以低聚半乳糖、低聚果糖、2’-岩藻糖基乳糖、菊粉、低聚木糖、水苏糖等益生元为唯一碳源，以母乳来源的乳酸菌为筛选对象，筛选出一株可以高效利用益生元的菌株。该菌株对低聚果糖和菊粉的利用效果最好，经鉴定为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌AUH2102。

本发明还提供上述副干酪乳杆菌AUH2102的培养方法，具体步骤如下：将副干酪乳杆菌AUH2102接种至以益生元为碳源的改良MRS液体培养基中，培养pH为6.5，培养温度为37℃。

本发明中，所述的改良MRS液体培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢三铵2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，吐温80 1.0ml/L，低聚糖20.0g/L，pH 6.5。

进一步地，本发明提供上述副干酪乳杆菌AUH2102在制备益生菌制品中的应用。

本发明中，所述的益生菌制品为食品医药领域常规的益生菌制品，包括但不限于合生元微生态制剂、发酵乳、乳饮料、活菌制剂、发酵果蔬饮料等。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的副干酪乳杆菌AUH2102来源于中国健康母亲的乳汁，以低聚果糖或菊粉为唯一碳源时，能获得比以葡萄糖为唯一碳源更好的生长能力；利用低聚糖的能力显著优于目前广泛应用的鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)。此外，副干酪乳杆菌AUH2102在人工胃液和胆盐耐受试验中表现出良好的耐酸耐胆盐能力，证明其拥有在肠道中存活并发挥作用的潜力。副干酪乳杆菌AUH2102以应用在合生元产品的开发中。

本发明所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：菌株筛选、鉴定与评估

1、母乳来源乳酸菌的筛选

母乳样品采集自湖南地区的健康妇女。采样前志愿者使用无菌水清洗单侧乳头及周围皮肤，用无菌手套丢弃第一滴母乳，收集30mL左右母乳置于含有5mL,体积分数为30％甘油的无菌离心管中，做好标记，放入装有干冰的泡沫箱中，立即送至实验室进行分离，随后样品及时保存于-80℃超低温冰箱中。将采集到的母乳样品和婴儿粪便样品做梯度稀释，选取合适的稀释梯度分别倾注于MRS固体培养基、M17固体培养基和双层倾注于改良MRS固体培养基中，分别进行常规培养和厌氧培养，在37℃和42℃条件下培养24-48h至长出单菌落，挑选具有乳酸菌形态的单菌落，多次划线接种于MRS固体培养基、M17固体培养基和改良MRS固体培养基中进行复筛，培养48h，长出单菌落经革兰氏染色后在显微镜下进行形态学观察，挑选具有乳杆菌、球菌和典型双歧杆菌形态的菌株。

2、菌株的鉴定

对菌株进行形态学观察、生理生化测试。测定菌株的16S rDNA基因序列，将菌株的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比较并分析结果，从分子生物学水平上确定该菌的种属。

利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，将提取的菌株基因组DNA作为16S rDNA-PCR的模板进行扩增(引物序列为27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，即：SEQID NO.1；1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT，即：SEQ ID NO.2)。电泳检测扩增产物后，送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果见序列表SEQ ID NO.3，将测序结果通过BLAST程序与GenBank基因库进行在线比对。

分离到的50个菌株中，鉴定出乳杆菌24株(表1)。

3、耐酸耐胆盐试验

菌株对人工胃液胆盐的耐受能力测试：取1.0mL的菌悬液接种至9.0mL的人工胃液或胆盐培养基中混合，37℃厌氧培养3h，分别在0h和3h采用平板计数法测定活菌数，计算菌株存活率(％)，同时做平行实验。

模拟胃液配制方法：将0.5g NaCl和0.3g胃蛋白酶溶解于去离子水中，用1.0mol/L的盐酸调节pH至2.5，加去离子水定容至100mL，使用0.22μm滤器过滤除菌，放置4℃冰箱冷藏备用。

胆盐培养基配制方法：称取一定量的胆盐于MRS液体培养基中，使胆盐浓度(w/v)调为0.1％，pH调节至6.5±0.2，121℃灭菌15min，冷却备用。

母乳来源乳酸菌耐胆盐能力较弱，仅有副干酪乳杆菌AUH2102和副干酪乳杆菌M60有较好的胆盐耐受能力(表1)；并选取同种菌株M48、M60和M64进行后续测试。M48、M64经人工胃液处理后存活率大于100％，说明对pH2.5的环境有较好的耐受能力(表2)。

表1菌株经胆盐处理后存活率

表2菌株经人工胃液处理后活菌数及其存活率

4、抑菌试验

选取蜡样芽胞杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等6种致病菌作为指示菌，采用牛津杯法测定菌株对致病菌的抑制作用。在平板底部倾倒薄层水琼脂。将致病菌置于LB液体培养基中37℃培养24h，取0.1mL的致病菌菌液(10⁹CFU/mL)涂布于30mL LB固体培养基表面。在水平放置的平板中均匀地放置灭菌的牛津杯，吸取0.2mL待测菌菌悬液(4×10⁸CFU/mL)于牛津杯中。将平板放置3-4℃冰箱中扩散24h，然后在37℃中培养24h，测量抑菌圈大小，每个菌株重复三次。

实验结果如表3所示。益生菌黏附机体肠道后，可以通过分泌有机酸、多糖类、抗菌肽类等物质来抑制微生物。菌株对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌均具有明显的抑制效果，抑菌圈直径均大于15mm。

表3菌株对致病菌抑制能力测定结果

注：+：抑菌圈直径<5mm；++：抑菌圈直径介于5mm和10mm之间；+++：抑菌圈直径介于10mm和15mm之间；++++：抑菌圈直径>15mm。

5、药敏试验

本研究对实验菌株进行药敏性试验。用无菌棉签将实验菌均匀涂布于MRS固体培养基表面，用无菌镊子取药敏纸片贴于培养基表面。培养48h后取出，测量抑菌圈直径。药敏纸片包括利福平、氨苄西林、万古霉素、复方新诺明、环丙沙星、头孢唑林(先锋)、头孢唑林、克拉霉素、青霉素、氯霉素、链霉素、四环素，同时做平行试验。

实验结果如表4所示。菌株AUH2102同时对利福平、氨苄西林、头孢唑林(先锋)、头孢唑林、克拉霉素、青霉素、氯霉素和四环素敏感，抗生素敏感性显著优于LGG，具有良好的安全性(表4)。

表4抑菌圈直径判断标准及药敏试验结果

注：S：敏感；I：中介；R：耐药；LGG为Lactobacillus rhamnosus GG。

6、生长曲线的测定

配制分别以2％(w/v)的低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、菊粉(Inulin)、低聚木糖(XOS)、水苏糖(Stachyose)代替MRS培养基配方中的葡萄糖，制成改良MRS培养基，以普通MRS液体培养基和不添加碳源的培养基为阳性对照和阴性对照，取菌种母液以3％的接菌量分别接种于培养基中，保证初始浓度一致，混合均匀。将接入菌中的液体培养基震荡均匀，取200μL加于生长曲线仪的测试小孔中，每种培养基做三个平行，每1h记录小孔的生长情况，直至48h停止。以培养时间为横坐标，吸光度(OD₆₀₀值)为纵坐标，绘制生长曲线。

实验结果如图1、表5所示。以未加碳源的培养基作对照，副干酪乳杆菌AUH2102在以菊粉或低聚果糖作为唯一碳源培养基生长情况优于其它培养基，培养达到稳定期时，以菊粉、低聚果糖为碳源的发酵液OD₆₀₀值均大于普通的MRS培养基，OD₆₀₀值最高可达到1.453，说明菌株对菊粉、低聚果糖的利用能力较好。而鼠李糖乳杆菌GG在普通的MRS培养基中生长情况较好，在以低聚半乳糖为碳源的培养基中能够达到葡萄糖的一半，几乎不利用低聚果糖和菊粉(图2、表6)。

表5副干酪乳杆菌AUH2102生长情况

注：SD为标准差。

表6鼠李糖乳杆菌GG生长情况

注：SD为标准差。

综合考虑耐酸、耐胆盐、低聚糖利用能力以及抗生素耐受性，发现副干酪乳杆菌AUH2102能在肠道中保持更好活性，对且对菊粉和低聚果糖有良好的代谢能力，可以用于合生元产品的开发。

菌株AUH2102的形态学特征：在涂布平板上呈成白色、光滑的圆形菌落(图3)，在液体培养基中集中于底部；该菌株细胞呈短杆状(图4)。生理生化特征：革兰氏阴性，氧化酶阴性，过氧化氢酶阴性，不运动，最适生长温度为37℃。菌株AUH2102的比对结果为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

实施例2：副干酪乳杆菌AUH2102在合生元制剂中的应用

将副干酪乳杆菌AUH2102进行大规模培养，将培养物进行冷冻干燥，添加低聚果糖和菊粉。低聚果糖和菊粉两者的添加量之和介于建议冲调体积的2％～6％(w/v)。

实施例3：副干酪乳杆菌AUH2102在乳饮料中的应用

将4～7％的蔗糖溶于沸水中，待其冷却至60～70℃加入12％的脱脂乳粉溶解均匀后均质，95～105℃灭菌10min，接种2％的副干酪乳杆菌AUH2102(4×10⁸CFU/mL)，在32～37℃培养。

实施例4：副干酪乳杆菌AUH2102在活菌制剂中的应用

将副干酪乳杆菌AUH2102进行大规模培养，将培养物添加辅料和保护剂，-50摄氏度保持30min，然后1h内升温至-25摄氏度，保持10h，然后升温至25摄氏度，保持12h进行冷冻干燥(真空度全程为1.3Pa)。

实施例5：副干酪乳杆菌AUH2102在发酵果蔬饮料中的应用

将果蔬与水1:1～5混合，打浆，95～105℃灭菌10min，冷却至32～37℃，接种2％的副干酪乳杆菌AUH2102(4×10⁸CFU/mL)，发酵12～48小时；离心，得发酵果蔬汁，添加稳定剂，均质，制成新型发酵果蔬饮料。

实施例6：副干酪乳杆菌AUH2102在发酵乳中的应用

将4～7％的蔗糖溶于沸水中，待其冷却至60～70℃加入12％的脱脂乳粉溶解均匀后均质，95～105℃灭菌10min，接种商业直投式发酵剂(含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，按说明书使用)和2％的副干酪乳杆菌AUH2102(4×10⁸CFU/mL)，在30～37℃培养至凝乳；转移至4℃进行后熟。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 澳优乳业（中国）有限公司

<120> 菌株及其应用

<130> MP21026515

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggggcaacc ttgcgcgtgc tatgcatgca agtcgaacga gtgtctcgtt gatgatcggt 60

gcttgcaccg agattcaaca tggaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 120

tgcccttaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcatag atccaagaac 180

cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta 240

ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca aggcgatgat acgtagccga actgagaggt 300

tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360

atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg 420

ggtcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac 480

ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540

gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600

gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaagcg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660

gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720

ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac 780

aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt tggagggttt 840

ccgcccttca gtgccgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cgaccgcaag 900

gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960

gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatctttt gatcacctga gagatcaggt 1020

ttccccttcg ggggcaaaat gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatgact agttgccagc atttagttgg 1140

gcactctagt aagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200

atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaga 1260

ccgcgaggtc aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg 1320

cctacacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc 1380

cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccga agccggtggc 1440

gtaacccttt agggag 1456

Claims (7)

1.副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.23526。

2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）以菊粉和/或低聚果糖为唯一碳源制备产品中的应用。

3.如权利要求1所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）的发酵方法，其特征在于，以菊粉和/或低聚果糖为唯一碳源培养所述菌株。

4.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）在制备微生物制剂或发酵制品中的应用。

5.微生物制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）以及可接受的辅料或助剂。

6.如权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，还包括其他任意微生物。

7.如权利要求5或6所述的微生物制剂在制备发酵制品中的应用。

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