CN104498401B - 一种动物双歧杆菌及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种动物双歧杆菌及其组合物，属于微生物应用技术领域。本发明所提供的动物双歧杆菌的保藏号为CGMCC No.4521，于2010年12月29日，保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明所提供的动物双歧杆菌与干酪乳杆菌、粪链球菌和蜡样芽胞杆菌具有协同生长作用，并且对对喹诺酮类、氨基糖苷类和单环β‑内酰胺类抗生素具有耐受性，适用于食品、药品和/或保健品中。

Description

一种动物双歧杆菌及其组合物
技术领域
本发明涉及一种动物双歧杆菌及其组合物，属于微生物应用技术领域。
技术背景
动物双歧杆菌是人类最早发现的生理性细菌，是人体肠道内典型的有益菌。动物双歧杆菌是定植于人体肠道内的益生菌，它的存在可有效降低人体内系统的pH，改变肠道内菌群，优化肠道微生态，抑制和杀灭病原菌，从而增强人体免疫力，提高机体抗病能力，同时，动物双歧杆菌在肠道内还可合成多种维生素。此外，动物双歧杆菌还具有润肠通便，降低胆固醇和甘油三酯，抑制癌细胞，抗衰老等作用。因此，人体内动物双歧杆菌的数量和质量已成为衡量人体肠道健康的重要标准之一。
动物双歧杆菌是一类专性厌氧菌，对氧的环境及营养要求较高。当菌体耐酸，耐胆盐能力不足是进不到肠道，就会失去它的作用。因此，要发挥益生作用，菌体首先应能耐受人体肠道的消化过程，能够抵御胃酸和胆汁对其的杀灭作用。目前报道能够耐受人体胃酸和胆盐的动物双歧杆菌的获取方法主要有三种，分为为从自然界中筛选，从自然发酵食品中筛选以及对现有菌种进行驯化。但是，现有动物双歧杆菌菌株之间差异较大，往往无法在具备耐酸耐胆盐的功能下，能够长时间在室温下存活，同时具备抑菌并与乳酸菌复配等多种优点。
双歧杆菌等微生态制品具有保健以及预防和治疗疾病的作用，主要依赖制品的功能活菌的存在，而如何提高发酵生产的活菌数，以及保持产品的存活稳定性，对于制品的作用效果来说是一个非常关键的问题。由于双歧杆菌是专性厌氧菌，对空气和温度十分敏感，因此在实际应用中也出现一些问题。菌种在生产、运输和保藏过程中，容易失活。为了使产品的活菌数保持在一定的水平，国内外的研究人员做了大量关于基因改造、微胶囊技术、菌体包埋技术等方面的研究，但从目前来看，产品常常被要求在低温下保存，绝大多数含双歧杆菌的产品都没有解决常温保存的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种动物双歧杆菌，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种动物双歧杆菌，该动物双歧杆菌对喹诺酮类、氨基糖苷类和单环β-内酰胺类抗生素具有耐受性。
所述动物双歧杆菌的保藏号为CGMCC No.4521，分类命名为Bifidobacteriumanimalis，于2010年12月29日，保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星。
所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素和卡那霉素。
所述单环β-内酰胺类抗生素为氨曲南。
本发明的另一目的在于提供一种含有所述动物双歧杆菌的组合物，该组合物含有动物双歧杆菌和载体。
所述载体由脱脂乳、海藻糖、麦芽糖糊精、L-谷氨酸钠和低聚异麦芽糖组成。
所述载体组成如下：10％脱脂乳、4％海藻糖、4％麦芽糖糊精、4％L-谷氨酸钠和4％低聚异麦芽糖。
所述组合物含有动物双歧杆菌的活菌数在1ⅹ105CFU/g-1ⅹ1011CFU/g。
所述组合物剂型为粉剂，片剂，胶囊或颗粒剂。
本发明有益效果如下：
1.本发明根据人体肠胃的生理条件，从健康儿童的肠道内筛选出一种动物双歧杆菌，经鉴定为动物双歧杆菌动物双歧杆菌乳酸亚种。本发明所提供的动物双歧杆菌可以在人体内定植，发挥益生作用。对酶活化剂的利用性很好，更增强机体免疫力；该菌具有促进B细胞分裂、活化吞噬细胞的免疫激活作用；对肠道内的有害菌群有较好的抑制作用，从而起到调节肠道微生物菌群的作用。
2.本发明所提供的动物双歧杆菌，与其他益生菌具有良好的协同生长作用，复配效果较好。尤其是与干酪乳杆菌、粪链球菌和蜡样芽胞杆菌，适用于制备多联益生菌制剂。所制备的益生菌制剂的活菌数高，可达1ⅹ1011CFU/g。
3.本发明所提供的动物双歧杆菌对对喹诺酮类、氨基糖苷类和单环β-内酰胺类抗生素具有耐受性。
附图说明
图1为实施例2中动物双歧杆菌的显微镜图；
(放大倍数为100倍)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所述方法，未经特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所述试剂和仪器，未经特殊说明，均为本领域中常规试剂和仪器可从商业渠道获取。
实施例1菌株的获得
动物双歧杆菌，为分离自杭州市江干区健康人体肠道，筛选出适合人体的菌株，动物双歧杆菌已于2010年12月29日，在中国科学院微生物研究所普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.4521。
动物双歧杆菌采自杭州市江干区20名2-6岁的健康儿童，男女各10名，均无胃肠病史，采样前两周内均未服用任何抗菌类药物。采样时用无菌玻璃棒挑取自然排出的新鲜粪便4-10g，置于无菌平皿中，迅速放入厌氧罐中，带回实验室分离。
实施例2菌株的鉴定和培养
2.1采用稀释涂布的方法，分别对采集的菌株样品进行分离纯化。纯化培养后观察菌落形态，取新鲜培养物，接种糖发酵试管，鉴定菌株的生化反应特性。同时取待测菌株的新鲜培养物，采用法国梅里埃公司的API 20A生化鉴定条，参照梅里埃公司的生化判定数据库对待测菌株进行API生化鉴定。同时将提取分离纯化号菌株的16S rRNA，并测定序列，并将测序结果与NCBI的GeneBank已有的序列进行比对。分离纯化好的菌种于2-8℃下保存。
经过鉴定，待测菌株的菌落特征为淡黄色，圆形，边缘整齐，稍隆起，湿润。菌株形态为：革兰氏阳性，无芽孢、无荚膜、短杆菌，一端稍膨大或呈Y或V型弯相菌等多形态，栅栏状排列或不规则单一排列。菌株的生化反应特性见表1。
表1 待测菌株的生化反应特性
待测菌株的API生化反应特性见表2。
表2 待测菌株的API生化反应特性
编号 有效成分 反应/酶 结果
IND L-色氨酸 吲哚产生 -
URE 尿素 脲酶 -
GLU D-葡萄糖 产酸(葡糖糖) +
MAN D-甘露醇 产酸(甘露糖) -
LAC D-乳糖(牛源) 产酸(乳糖) +
SAC D-蔗糖 产酸(蔗糖) +
MAL D-麦芽糖 产酸(麦芽糖) +
SAL 水杨酸 产酸(水杨苷) +
XYL D-木糖 产酸(木糖) +
ARA L-阿拉伯糖 产酸(阿拉伯糖) +
GEL 明胶(牛源) 水解(蛋白酶)(凝胶) -
ESC 七叶灵柠檬酸铁 水解(β-葡萄糖苷酶)(七叶灵) +
GLY 甘油 产酸(甘油) -
CEL D-纤维二糖 产酸(纤维二糖) -
MNE D-甘露糖 产酸(甘露糖) -
MLZ D-松三糖 产酸(松三糖) -
RAF D-棉籽糖 产酸(棉籽糖) +
SOR D-山梨醇 产酸(山梨醇) -
RHA L-鼠李糖 产酸(鼠李糖) -
TRE D-海藻糖 产酸(海藻糖) -
CAT 触酶 -
SPOR 芽孢 -
GRAM 革兰染色 +
COCC 形态学 -
待测菌株的16SrRNA的序列与GeneBank序列进行比对后，结果显示，其与对照菌株中-动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BB-12株同源性为99.8％。
2.2动物双歧杆菌的培养
培养动物双歧杆菌所用的TPY培养基和发酵培养基的配方如下：
TPY培养基：
用20％氢氧化钠溶液或18％乙酸溶液调节pH至7.2。
将分离纯化得到的动物双歧杆菌以2％的接种量接种到TPY培养基中，于36-38℃下，厌氧培养14-16h。
将经过检验合格的动物双歧杆菌种子液，接种于发酵罐中的发酵培养基中，于36-38℃下，厌氧培养16-20h。培养过程中取样镜检，测定pH值，培养结束后取样做纯菌检查(图1)。实施例3菌株的耐胃酸耐胆盐实验
3.1胆盐耐受实验
培养菌株所用的改良TPY培养液的组成为：
将分离纯化获得的菌株用灭菌的改良的TPY培养基液37℃严格厌氧培养15h。将活化菌株培养液以10％接种量接入含有不同胆盐浓度的无菌改良TPY液体培养基中(胆盐浓度为1％、2％3％、4％、5％、6％、7％)，同时以不含有胆盐的改良TPY培养液为对照。在37℃厌氧培养0、6、12、18、24h后取样测定活菌数。
3.2酸耐受性实验
将分离得到的菌株用无菌改良的TPY培养液37℃严格厌氧培养15h。将活化菌株培养液以10％接种量接入不同pH的无菌改良TPY培养液中(pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0)，同时以pH7.0的培养液为对照。37℃厌氧培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min，取样测定活菌。
3.3实验结果
待测菌株对不同浓度的胆盐的耐受性见表3。
表3 菌株对不同浓度的胆盐的耐受性
从表3中可以看出，培养24h后，动物双歧杆菌活菌数随胆盐的浓度增加而降低，在常规体内盐浓度4％下，存活率为41.7％，随着盐浓度的增高，活菌数虽有下降，但在7g/100ml的高盐浓度下，存活率为26.4％，菌数仍然可以达到1010cfu/mL以上，说明动物双歧杆菌可有效耐受生物体高盐环境。由此说明，动物双歧杆菌耐高渗环境能力较强，可在人体内良好的生存。待测菌株对酸的耐受性见表4。
表4 待测菌株对酸的耐受性
从表4中可以看出，动物双歧杆菌耐受pH 2.0和pH 1.0条件较差，处理1h后，活菌数明显下降，在pH 3.0条件下处理1h-2h，存活率分别为80.56％、61.11％和44.44％，对pH3.0具有较强的耐受能力，可见，该菌株具备耐受胃中酸性环境的能力。
实施例4菌株对抗生素药物的敏感性
本实施例采用琼脂扩散纸片法，检测纯化后的菌株对抗生素药物的敏感性。用于检测的标准药敏纸片包括10类20种抗生素：青霉素类(氨苄西林、青霉素)、头孢菌素类(头孢哌酮、头孢唑啉、头孢呋新钠)、全诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星)、氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素)、单环β-内酰胺类(氨曲南)、四环素类(四环素、米诺环素)、糖肽类(万古霉素、替考拉宁)、碳青霉烯类(美洛培南)及其他类(氯霉素)。上述纸片均购自北京天坛药物生物技术开发公司，纸片直径6mm，质量符合WHO标准规定。
取新制备的2个麦氏单位的检测菌株悬液0.5ml加入TPY平皿表面，无菌条件下通风吹干表面液体后，贴放标准药物纸片，培养24-48h后测量并记录抑菌圈直径。参照金黄色葡萄球菌ATCC 25923(Stahpy lococcus aureus ATCC 25923)判断标准。检测结果如表5所示。
表5 待测菌株对抗生素药物的敏感性
注：R＝耐药；I＝中介；S＝敏感；-＝无抑菌圈；*＝参照肠球菌判定标准。
从表5可知，待测菌株对青霉素类(氨苄西林、青霉素G)、头孢菌素类(头孢哌酮、头孢呋辛钠)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素)、糖肽类(万古霉素、替考拉宁)、碳青霉烯类(美洛培南)抗生素和氯霉素敏感；四环素类(米诺环素、四环素)；对喹诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星)、氨基糖苷类(卡那霉素)抗抗生素耐药。
实施例5动物双歧杆菌菌粉的制备
5.1动物双歧杆菌菌种活化
在无菌条件下，将动物双歧杆菌工作种子批中的一支，加入少许无菌水溶解，镜检确认符合该菌特征，用接种环蘸取少量菌液，在斜面上划“之”字，37±1℃厌氧培养48小时，镜检合格的斜面装入厌氧罐厌氧后移至冰箱中2～8℃保存。
改良的TPY培养基成分：酪蛋白胨5g、大豆蛋白胨10g、葡萄糖2.5g、酵母浸膏1.5g、磷酸氢二钾1g、氯化镁0.25g、硫酸锌0.125g、氯化钙0.075g、D-泛酸钙0.00075g、三氯化铁0.025g、吐温-800.5g、维生素B10.0075g、维生素B20.0075g、维生素B60.0075g、牛肉膏1g、硫代乙醇酸钠0.025g、L-半胱氨酸0.025g，纯化水定容至500ml。
5.2动物双歧杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
将工作种子(斜面)启开溶解、涂片染色、镜检合格接种至一级种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃厌氧培养14～16h。
2)种子罐种子的制作
将一级种子液接种至种子罐种子培养基中，按5％的接种量接种至种子罐中，培养条件及培养时间：37±1℃培养14～16h。在培养过程中用N2保压，罐压维持在0.04-0.06Mpa，每小时搅拌15分钟。培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，pH值控制在6.2-6.8范围内。转入发酵罐前取样镜检，合格后方可转入发酵罐内。
3)发酵
接种：用蒸汽对接种管道灭菌30分钟，当温度降至36-38℃时，准备接种。接种前对种子液、发酵培养基进行涂片、染色、镜检。检查管道连接严密后，利用压差法将种子液接入发酵罐中。
培养：动物双歧杆菌培养，在36-38℃的条件下培养16～20h，培养过程中用N2保压,罐压维持0.04—0.06Mpa,每小时搅拌15分钟，在培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，视情况进行pH调节，培养过程中pH值控制范围6.2—6.8,并检测其生长情况及纯菌检查。
5.3动物双歧杆菌活菌制剂的制备
1)离心收集
菌体培养完成以后通过离心收集菌体，将发酵液通过离心管道进入离心机，在低温条件10000rpm离心15min。离心结束后将菌泥称量后转入混合预冻容器。
2)添加冻干保护剂
冻干保护剂成分为：脱脂乳10％(w/v)、海藻糖4％(w/v)、麦芽糖糊精4％(w/v)、L-谷氨酸钠4％(w/v)、低聚异麦芽糖4％(w/v)。保护剂按上述比例添加混合121℃，30min高压灭菌，4℃保存备用。
将离心得到的菌泥与上述保护剂按一定的比例进行添加，搅拌均匀得到菌体悬浮液。
3)菌体冷冻干燥
将菌悬液放入不锈钢方盘中，分装大盘中。分装后放入低温冰柜中预冻至充分冻结(显示温度-40～-80℃表明冻实)或放入冻干机内充分冻结。干燥箱制冷到-30℃以下，制品入箱，当制品充分冻结后停止干箱制冷，转向冷凝器制冷，温度达到-40℃以下时，开始真空干燥，当箱内真空度在30-10Pa以下时对干箱进行加热，温度控制在37—40℃，在接近此温度时应再持续2小时以上，当温度不再变化时证明制品已干燥，此时可以停机收粉。
4)粉碎包装
菌粉经装有80目筛网的粉碎机粉碎，然后过60目筛，最后用手顺时针搅拌2分钟，再逆时针搅拌2分钟，使其混合均匀，取样检验，动物双歧杆菌经冻干和粉碎后菌粉张的活菌数达到1.0×1011cfu/ml。将菌粉装入菌粉内包装袋内，称量并贴标签，抽真空保存。
实施例6动物双歧杆菌片的制备
6.1动物双歧杆菌菌种活化
在局部100级的条件下，将婴儿动物双歧杆菌工作种子批中的一支，加入少许无菌水溶解，镜检确认符合该菌特征，用接种环蘸取少量菌液，在斜面上划“之”字，37±1℃厌氧培养48小时，镜检合格的斜面装入厌氧罐厌氧后移至冰箱中2～8℃保存。
改良的TPY培养基成分：酪蛋白胨5g、大豆蛋白胨10g、葡萄糖2.5g、酵母浸膏1.5g、磷酸氢二钾1g、氯化镁0.25g、硫酸锌0.125g、氯化钙0.075g、D-泛酸钙0.00075g、三氯化铁0.025g、吐温-800.5g、维生素B10.0075g、维生素B20.0075g、维生素B60.0075g、牛肉膏1g、硫代乙醇酸钠0.025g、L-半胱氨酸0.025g，纯化水定容至500ml。
6.2动物双歧杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
将工作种子(斜面)启开溶解、涂片染色、镜检合格接种至一级种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃厌氧培养14～16h。
2)种子罐种子的制作
将一级种子液接种至种子罐种子培养基中，接种量14L/140L，培养条件及培养时间：37±1℃培养14～16h。在培养过程中用N2保压，罐压维持在0.04-0.06Mpa，每小时搅拌15分钟。培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，PH值控制在6.2-6.8范围内。转入发酵罐前取样镜检，合格后方可转入发酵罐内。
3)发酵
接种：用蒸汽对接种管道灭菌30分钟，当温度降至36-38℃时，准备接种。接种前对种子液、发酵培养基进行涂片、染色、镜检。检查管道连接严密后，利用压差法将种子液接入发酵罐中。
培养：婴儿动物双歧杆菌培养，36-38℃16～20h，培养过程中用N2保压,罐压维持0.04—0.06Mpa,每小时搅拌15分钟，在培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，视情况进行PH调节，培养过程中PH值控制范围6.2—6.8,并检测其生长情况及纯菌检查。
6.3动物双歧杆菌活菌制剂的制备
1)离心收集
菌体培养完成以后通过离心收集菌体，将发酵液通过离心管道进入离心机，在低温条件10000rpm离心15min。离心结束后将菌泥称量后转入混合预冻容器。
2)添加冻干保护剂
冻干保护剂成分为：脱脂乳10％(w/v)、海藻糖4％(w/v)、麦芽糖糊精4％(w/v)、L-谷氨酸钠4％(w/v)、低聚异麦芽糖4％(w/v)。保护剂按上述比例添加混合121℃，30min高压灭菌，4℃保存备用。
将离心得到的菌泥与上述保护剂按一定的比例进行添加，搅拌均匀得到菌体悬浮液。
3)菌体冷冻干燥
将菌悬液放入不锈钢方盘中，分装大盘中。分装后放入低温冰柜中预冻至充分冻结(显示温度-40～-80℃表明冻实)或放入冻干机内充分冻结。干燥箱制冷到-30℃以下，制品入箱，当制品充分冻结后停止干箱制冷，转向冷凝器制冷，温度达到-40℃以下时，开始真空干燥，当箱内真空度在30-10Pa以下时对干箱进行加热，温度控制在37—40℃，在接近此温度时应再持续2小时以上，当温度不再变化时证明制品已干燥，此时可以停机收粉。
4)粉碎包装
菌粉经装有80目筛网的粉碎机粉碎，然后过60目筛，最后用手顺时针搅拌2分钟，再逆时针搅拌2分钟，使其混合均匀，取样检验，动物双歧杆菌经冻干和粉碎后菌粉张的活菌数达到1.0×1011cfu/ml。将菌粉装入菌粉内包装袋内，称量并贴标签，抽真保存。
6.4动物双歧杆菌活菌片剂制备
将制备的菌粉转入高速压片机中进行压片。在压片过程中须先调节填充量，再调节压力，使压出的素片重量差异、脆碎度、崩解度、外观等符合质量标准要求。压片过程中，每隔10分钟称一次平均片重，重量差异限度在±5％的范围内。
实施例7动物双歧杆菌胶囊的制备
7.1动物双歧杆菌菌种活化
在无菌条件下，将婴儿动物双歧杆菌工作种子批中的一支，加入少许无菌水溶解，镜检确认符合该菌特征，用接种环蘸取少量菌液，在斜面上划“之”字，37±1℃厌氧培养48小时，镜检合格的斜面装入厌氧罐厌氧后移至冰箱中2～8℃保存。
改良的TPY培养基成分：酪蛋白胨5g、大豆蛋白胨10g、葡萄糖2.5g、酵母浸膏1.5g、磷酸氢二钾1g、氯化镁0.25g、硫酸锌0.125g、氯化钙0.075g、D-泛酸钙0.00075g、三氯化铁0.025g、吐温-800.5g、维生素B10.0075g、维生素B20.0075g、维生素B60.0075g、牛肉膏1g、硫代乙醇酸钠0.025g、L-半胱氨酸0.025g，纯化水定容至500ml。
7.2动物双歧杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
将工作种子(斜面)启开溶解、涂片染色、镜检合格接种至一级种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃厌氧培养14～16h。
2)种子罐种子的制作
将一级种子液接种至种子罐种子培养基中，接种量14L/140L，培养条件及培养时间：37±1℃培养14～16h。在培养过程中用N2保压，罐压维持在0.04-0.06Mpa，每小时搅拌15分钟。培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，PH值控制在6.2-6.8范围内。转入发酵罐前取样镜检，合格后方可转入发酵罐内。
3)发酵
接种：用蒸汽对接种管道灭菌30分钟，当温度降至36-38℃时，准备接种。接种前对种子液、发酵培养基进行涂片、染色、镜检。检查管道连接严密后，利用压差法将种子液接入发酵罐中。
培养：婴儿动物双歧杆菌培养，36-38℃16～20h，培养过程中用N2保压,罐压维持0.04—0.06Mpa,每小时搅拌15分钟，在培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，视情况进行PH调节，培养过程中PH值控制范围6.2—6.8,并检测其生长情况及纯菌检查。
7.3动物双歧杆菌活菌制剂的制备
1)离心收集
菌体培养完成以后通过离心收集菌体，将发酵液通过离心管道进入离心机，在低温条件10000rpm离心15min。离心结束后将菌泥称量后转入混合预冻容器。
2)添加冻干保护剂
冻干保护剂成分为：脱脂乳10％(w/v)、海藻糖4％(w/v)、麦芽糖糊精4％(w/v)、L-谷氨酸钠4％(w/v)、低聚异麦芽糖4％(w/v)。保护剂按上述比例添加混合121℃，30min高压灭菌，4℃保存备用。
将离心得到的菌泥与上述保护剂按一定的比例进行添加，搅拌均匀得到菌体悬浮液。
3)菌体冷冻干燥
将菌悬液放入不锈钢方盘中，分装大盘中。分装后放入低温冰柜中预冻至充分冻结(显示温度-40～-80℃表明冻实)或放入冻干机内充分冻结。干燥箱制冷到-30℃以下，制品入箱，当制品充分冻结后停止干箱制冷，转向冷凝器制冷，温度达到-40℃以下时，开始真空干燥，当箱内真空度在30-10Pa以下时对干箱进行加热，温度控制在37—40℃，在接近此温度时应再持续2小时以上，当温度不再变化时证明制品已干燥，此时可以停机收粉。
4)粉碎包装
菌粉经装有80目筛网的粉碎机粉碎，然后过60目筛，最后用手顺时针搅拌2分钟，再逆时针搅拌2分钟，使其混合均匀，取样检验，动物双歧杆菌经冻干和粉碎后菌粉张的活菌数达到1.0×1011cfu/ml。将菌粉装入菌粉内包装袋内，称量并贴标签，抽真空保存。
7.4动物双歧杆菌胶囊的制备
将冷冻干燥的菌粉按照规格，机械分装粉末，制备胶囊。
实施例8
8.1动物双歧杆菌菌种活化
在局部100级的条件下，将婴儿动物双歧杆菌工作种子批中的一支，加入1ml无菌水溶解，镜检确认符合该菌特征，用接种环蘸取少量菌液，在斜面上划“之”字，37±1℃厌氧培养48小时，镜检合格的斜面装入厌氧罐厌氧后移至冰箱中2～8℃保存。
改良的TPY培养基成分：酪蛋白胨5g、大豆蛋白胨10g、葡萄糖2.5g、酵母浸膏1.5g、磷酸氢二钾1g、氯化镁0.25g、硫酸锌0.125g、氯化钙0.075g、D-泛酸钙0.00075g、三氯化铁0.025g、吐温-800.5g、维生素B10.0075g、维生素B20.0075g、维生素B60.0075g、牛肉膏1g、硫代乙醇酸钠0.025g、L-半胱氨酸0.025g，纯化水定容至500ml。
8.2动物双歧杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
将工作种子(斜面)启开溶解、涂片染色、镜检合格接种至200ml一级种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃厌氧培养14～16h。
2)种子罐种子的制作
将培养好的一级种子液按5％接种至装有4L种子培养基种子罐中。培养条件及培养时间：37±1℃培养14～16h。在培养过程中用N2保压，罐压维持在0.04-0.06Mpa，每小时搅拌15分钟。培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，PH值控制在6.2-6.8范围内。转入发酵罐前取样镜检，合格后方可转入发酵罐内。
3)发酵
接种：用蒸汽对接种管道灭菌30分钟，当温度降至36-38℃时，准备接种。接种前对种子液、发酵培养基进行涂片、染色、镜检。检查管道连接严密后，利用压差法将种子液接入发酵罐中。
培养：将4L婴儿动物双歧杆菌培养液按5％的比例接种至装有80L发酵液的发酵罐中，在36-38℃条件下培养16～20h，培养过程中用N2保压,罐压维持0.04—0.06Mpa,每小时搅拌15分钟，在培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，视情况进行PH调节，培养过程中PH值控制范围6.2—6.8,并检测其生长情况及纯菌检查。
8.3动物双歧杆菌活菌制剂的制备
1)离心收集
菌体培养完成以后通过离心收集菌体，将发酵液通过离心管道进入离心机，在4℃条件10000rpm离心15min；为去除菌体中的培养基成分，将得到的菌泥用无菌水洗涤两遍将洗涤后的菌泥称量后转入混合预冻容器。
2)添加冻干保护剂
冻干保护剂成分为：脱脂乳10％(w/v)、海藻糖4％(w/v)、麦芽糖糊精4％(w/v)、L-谷氨酸钠4％(w/v)、低聚异麦芽糖4％(w/v)。保护剂按上述比例添加混合121℃，30min高压灭菌，4℃保存备用。
将离心得到的菌泥与上述保护剂按1:4的比例进行添加，搅拌均匀得到菌体悬浮液。
3)菌体冷冻干燥
将菌悬液放入不锈钢方盘中，分装15-20个大盘中，每盘装量450±50ml。分装后放入低温冰柜中预冻至充分冻结(显示温度-40～-80℃表明冻实)或放入冻干机内充分冻结。干燥箱制冷到-30℃以下，制品入箱，当制品充分冻结后停止干箱制冷，转向冷凝器制冷，温度达到-40℃以下时，开始真空干燥，当箱内真空度在30-10Pa以下时对干箱进行加热，温度控制在37—40℃，在接近此温度时应再持续2小时以上，当温度不再变化时证明制品已干燥，此时可以停机收粉。
4)粉碎包装
菌粉经装有80目筛网的粉碎机粉碎，然后过60目筛，最后用手顺时针搅拌2分钟，再逆时针搅拌2分钟，使其混合均匀，取样送质检处检验。将菌粉装入菌粉内包装袋内，称量并贴标签，抽真空封口，寄库保存。
8.4动物双歧杆菌组合物的制备
将制备的双歧杆菌冻干菌粉与干酪乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌按一定的比例混合并添加一定辅料制备富含双歧杆菌的四联活菌制剂，所制备的富含动物双歧杆菌组合物中动物双歧杆菌的活菌数达到1010cfu/ml，干酪乳杆菌活菌数大于109cfu/ml，蜡样芽孢杆菌和粪肠球菌的活菌数大于106cfu/ml。
8.5双歧杆菌活菌制剂的稳定性检测
将制备的富含动物双歧杆菌的活菌制剂置于4℃和25℃条件下，每隔30天对制剂中的活菌数进行测定。同时测定利用本发明制备的动物双歧杆菌菌粉以及市售双歧杆菌菌粉在4℃和24℃下单独储藏24个月活菌数变化。表6，表7为4℃和25℃条件下组合制剂中各菌粉在24个月储存期间活菌数的变化情况。
表6 实施案例8组合制剂中四种菌粉分别在4℃条件下储存24个月活菌数的变化
表7 实施案例8组合制剂中四种菌粉分别在25℃条件下储存24个月活菌数的变化
表8 实施案例8动物双歧杆菌菌粉和市售双歧杆菌菌粉分别在25℃条件下储存24个月活菌数的变化
结果表明，将动物双歧杆菌和干酪乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌按一定的比例混合并添加一定辅料制备四联活菌制剂各菌的活力在储藏24个月期间稳定性较好，动物双歧杆菌的活菌数在109cfu/ml以上，干酪乳杆菌的活菌数在108cfu/ml以上，蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌的活菌数在105cfu/ml以上。同时将实施案例8制备的动物双歧杆菌菌粉与市售双歧杆菌菌粉进行了比较(表8)，结果表明利用本发明制备的动物双歧杆菌菌粉在4℃和25℃条件下储藏24个月期间，虽然菌种活力有一定程度的下降，但在第24个月时4℃和25℃条件下储藏的干酪乳杆菌活菌数分别为8.24Log cfu/ml和8.16Log cfu/ml(活菌数＞108cfu/ml)；而市售动物双歧杆菌菌粉在第24个月时4℃和25℃条件下储藏的的菌体活菌数已经下降到106cfu/ml以下。由此说明利用本发明方法制备的组合活菌制剂中动物双歧杆菌在24个月的储藏期间活菌数具有较好的稳定性；使得双歧杆菌日后在开发的新产品中更有利于生理功能的发挥。同时本发明制备的动物双歧杆菌菌粉在常温下保存稳定性好，解决了双歧杆菌在常温条件下保存稳定性差的技术问题，。用这种方法制备的富含动物双歧杆菌菌粉和干酪乳杆菌菌粉/蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌组合制剂在24个月储藏期间活菌数下降不明显，使得干酪乳杆菌的有效期远比常规方法长。说明在动物双歧杆菌与干酪乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌制备的组合制剂中，四种菌具有一定的协同作用，更有利于动物双歧杆菌的稳定性。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种动物双歧杆菌，其特征在于，对喹诺酮类、氨基糖苷类和单环β-内酰胺类抗生素具有耐受性；所述动物双歧杆菌的保藏号为CGMCC No.4521，于2010年12月29日，保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.权利要求1所述动物双歧杆菌，其特征在于，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星。
3.权利要求1所述动物双歧杆菌，其特征在于，所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素和卡那霉素。
4.权利要求1所述动物双歧杆菌，其特征在于，所述单环β-内酰胺类抗生素为氨曲南。
5.一种含有权利要求1所述动物双歧杆菌的组合物，其特征在于，含有动物双歧杆菌和载体。
6.权利要求5所述组合物，其特征在于，所述载体由脱脂乳、海藻糖、麦芽糖糊精、L-谷氨酸钠和低聚异麦芽糖组成。
7.权利要求5所述组合物，其特征在于，所述载体组成如下：10％脱脂乳、4％海藻糖、4％麦芽糖糊精、4％L-谷氨酸钠和4％低聚异麦芽糖。
8.权利要求5所述组合物，其特征在于，含有动物双歧杆菌的活菌数在1ⅹ105CFU/g-1ⅹ1011CFU/g。
9.权利要求5所述组合物，其特征在于，剂型为粉剂，片剂，胶囊或颗粒剂。
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