CN104522648B - 一种四联益生菌制剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种四联益生菌制剂及应用，属于保健食品/药品技术领域。本发明所提供的四联益生菌制剂含有动物双歧杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌和蜡样芽胞杆菌，四种益生菌分别占到产品重量的3.0％‑8.0％、3.0％‑8.0％、0.5％‑2.0％和0.1％‑0.5％，其他组分为辅料。本发明所提供的四联益生菌制剂具有活菌数高，并且便于室温下储藏的特点。本发明提供的四联益生菌制剂每克含有动物双歧杆菌活菌数和干酪乳杆菌菌数在1ⅹ108CFU以上，粪肠球菌活菌数在1ⅹ107CFU以上，蜡样芽胞杆菌活菌数在1ⅹ106CFU以上。室温下储藏24个月后动物动物双歧杆菌活菌数可达3.8×108CFU/g，干酪乳杆菌的活菌数可达7.8×108CFU/g，粪肠球菌的活菌数可达2.2×107CFU/g，蜡样芽胞杆菌的活菌数可达1.0×106CFU/g。
Description
技术领域
本发明涉及一种四联益生菌制剂及应用，属于保健食品/药品技术领域。
技术背景
益生菌是指能够改善宿主肠道菌群生态平衡，提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。益生菌是获得微生物，当摄入足够数量时，对宿主起有益健康作用。因此，益生菌在工业、农业、医药、食品和饲料等与人类生活密切相关的重要领域中应用价值很高。近年来，国内外研制出多种益生菌活菌制剂，其基本指导思想就是用人或动物的正常生理菌群的菌株，经过筛选和培养，通过各种途径，制成各种剂型的活菌制剂，然后再以投入方式使其回到原来环境，从而发挥其自然的生理作用。我国对益生菌用于保健食品和药品的研究起步较晚，20世纪90年代才开始将双歧杆菌用于各种保健食品中。目前市场上出现的益生菌保健产品剂型大致分为三类，即胶囊剂，如美常安、聚克、整肠生、贝飞达、丽珠肠乐等；颗粒剂和散剂，如妈咪爱、培菲康、常乐康等；片剂，如促菌生、金双歧、思连康、乳酸菌素等。
双歧杆菌和乳杆菌是人们研究最多的两种益生菌。双歧杆菌是健康人体肠道内定植数量占优势的一类菌群。人们已对双歧杆菌对人体肠道菌群的调节功效进行了大量研究。研究表明，高水平的适宜双歧杆菌在肠道通常可以阻止病原体的致病作用，从而可以纠正肠道菌群失调引起的腹泻。乳杆菌同样也被广泛地用于调节人体肠道菌群、改善肠道功能的研究。尽管人们已经广泛的研究了益生菌，但是在应用方面，大多数都是通过单株、双珠或者最多三株益生菌联用，例如整肠生为单一的地衣芽孢杆菌单一菌剂；妈咪爱为屎肠球菌和枯草杆菌二联菌制剂；培菲康为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、肠球菌三联菌制剂；很少有超过四种种，产品的使用范围比较狭窄，不能适应更广泛的人群的不同肠道特征，大大限制了益生菌的应用。另外，双歧杆菌和一些菌株都是专性厌氧菌，它们在肠道内定植需要一个缺氧环境，而人体肠道是一个微需氧环境，所以上述的一些杆菌在肠道内定植有困难，因此菌种在肠道内存活性不好，停留时间短，容易排出，使得制剂的疗效受到影响。再者利用双歧杆菌等制备的微生态制剂的疗效主要依靠制品中功能菌的存在，因为双歧杆菌是专性厌氧菌，对空气和温度十分敏感，菌种在生产、运输和保存过程中容易失活。为了使产品中的活菌数保持一定的活菌数，国内外的研究者在微生物高密度培养、优化冻干保护剂、微胶囊技术、多层包埋技术以及在产品中添加抗氧化因子等方面做了大量的研究。但从目前市场上销售的微生态制剂产品来看，大多数含有双歧杆菌的产品都没有解决常温保存的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种四联益生菌制剂，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种四联益生菌制剂，该制剂中菌粉占产品的重量百分比为：
动物双歧杆菌菌粉3.0％-8.0％，
干酪乳杆菌菌粉3.0％-8.0％，
粪肠球菌菌粉0.5％-2.0％，
蜡样芽孢杆菌菌粉0.1％-0.5％，
其他组分为辅料；
其中，所述动物动物双歧杆菌菌种保藏号为CGMCC No.4521，保藏地点为中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2010年12月29日；
所述干酪乳杆菌菌种保藏号为CGMCC No.4520，保藏地点为中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2010年12月29日；
所述粪肠球菌菌种保藏号为CGMCC0460.3，保藏地点为中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日；
所述蜡样芽孢杆菌菌种保藏号为CGMCC0460.4，保藏地点为中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日。
其中，粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌已公开。
所述动物双歧杆菌，对喹诺酮类、氨基糖苷类和单环β-内酰胺类抗生素具有耐受性；所述干酪乳杆菌对糖肽类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素及磺胺具有耐受性。
所述辅料为填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂和/或营养强化剂。
所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素、三硅酸镁和/或氢氧化铝。
所述矫味剂为乳糖和蔗糖；所述崩解剂为淀粉；所述粘合剂为蔗糖；所述抗酸剂为三硅酸镁和氢氧化铝；所述润滑剂为滑石粉；所述营养强化剂包括维生素、矿物质、益生元和/或膳食纤维。
所述辅料占产品的重量百分比为：
淀粉8％-30％，
乳糖5％-20％，
微晶纤维素10％-50％，
蔗糖10％-30％，
三硅酸镁5％-15％，
氢氧化铝1％-5％，
滑石粉5％-20％。
所述菌剂的剂型为片剂、散剂或胶囊。
一种所述菌剂的制备方法，步骤如下：
1)原辅料预处理；分别将原辅料过50-200目筛；
2)混合制备；将蔗糖粉与淀粉共同过50目筛后加入批混机，再将剩余辅料依次加入批混机内，最后加入混合菌粉，四种冻干菌粉与辅料在混匀机中混合50分钟结束后放料；
3)成型：将步骤2)混合后的样品进行成型处理，包装后获得成品。
所述菌剂每克菌剂含有动物双歧杆菌活菌数和干酪乳杆菌菌数在1ⅹ108CFU以上，粪肠球菌活菌数在1ⅹ107CFU以上，蜡样芽胞杆菌活菌数在1ⅹ106CFU以上。
所述菌剂在食品工业、制药工业中应用。
本发明有益效果：
1.本发明制备的益生菌制剂富含四种益生菌和多种益生元，能够促进益生菌在人体内的增殖，调节人体肠道菌群，有益于人体健康。本发明制备的四联益生菌活菌制剂能够促进益生菌在人体内的增殖，调节人体肠道菌群，有益于人体健康。
2.本发明制备的四联益生菌制剂的活菌数高，每片剂中动物动物双歧杆菌菌粉活菌数可达4.5×108CFU/g，干酪乳杆菌菌粉活菌数可达4.3×108CFU/g，粪肠球菌菌粉活菌数可达4.1×107CFU/g，蜡样芽孢杆菌菌粉活菌数可达1.0×106CFU/g，，并且益生菌的存货时间长，室温下储藏24个月后四种菌的活菌数依然保持稳定，动物动物双歧杆菌活菌数为3.8×108CFU/g，干酪乳杆菌的活菌数为7.8×108CFU/g，粪肠球菌的活菌数为2.2×107CFU/g，蜡样芽胞杆菌的活菌数1.0×106CFU/g。本发明制备的四联活菌制剂解决了常温不耐储藏的问题，与市售益生菌产品相比本发明制备的产品在室温下贮藏稳定性更好。
3.本发明制备的四联益生菌制剂的加工工艺简单，对生产设备的要求低，可操控性强，适于规模化生产。
附图说明
图1为实施例5所制备的制剂中各菌在贮藏过程中活菌数变化。
图2为实施例5四联益生菌制剂中动物双歧杆菌在4℃和25℃条件下储藏24个月的活菌数变化。
图3为实施例5四联益生菌制剂中干酪乳杆菌在4℃和25℃条件下储藏24个月的活菌数变化。
图4为实施例5四联益生菌制剂中粪肠球菌在4℃和25℃条件下储藏24个月的活菌数变化。
图5为实施例5四联益生菌制剂中蜡样芽孢杆菌在4℃和25℃条件下储藏24个月的活菌数变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所述方法，未经特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所述试剂和仪器，未经特殊说明，均为本领域中常规试剂和仪器可从商业渠道获取。
实施例1菌株的分离筛选、鉴定和培养
1.菌种的采集
动物双歧杆菌和粪肠球菌，均分离自杭州市江干区健康人体肠道。动物双歧杆菌菌种保藏号为CGMCC No.4521，保藏地点为中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2010年12月29日；粪肠球菌菌种保藏号为CGMCC0460.3，保藏地点为中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日；干酪乳杆菌菌种保藏号为CGMCCNo.4520，保藏地点为中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2010年12月29日；蜡样芽孢杆菌菌种保藏号为CGMCC0460.4，保藏地点为中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日。
动物双歧杆菌、干酪乳杆菌均采自杭州市江干区20名2-6岁的健康儿童，男女各10名，均无胃肠病史，采样前两周内均为服用任何抗菌类药物。采样时用无菌玻璃棒挑取自然排出的新鲜粪便4-10g，置于无菌平皿中，迅速放入厌氧罐中，带回实验室分离。动物双歧杆菌和干酪乳杆菌均在2010年3月采集。另外，粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌菌种信息已公开。
2.分离鉴定
将采集的菌株样品通过生理生化鉴定方法和16S rRNA基因扩增、克隆和测序方法，
最后得到的四株菌分别为动物动物双歧杆菌，干酪乳杆菌，粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌。将分离纯化好的菌种于2-8℃下保存。
3.菌株的培养
3.1动物双歧杆菌的培养
培养动物双歧杆菌所使用的培养基为TPY培养基。所述培养基各成分的含量(g/500ml)的组分为：酪蛋白胨5g、大豆蛋白胨10g、葡萄糖2.5g、酵母浸膏1.5g、磷酸氢二钾1g、氯化镁0.25g、硫酸锌0.125g、氯化钙0.075g、D-泛酸钙0.00075g、三氯化铁0.025g、吐温-800.5g、维生素B10.0075g、维生素B20.0075g、维生素B60.0075g、牛肉膏1g、硫代乙醇酸钠0.025g、L-半胱氨酸0.025g，纯化水定容至500ml。用20％氢氧化钠溶液或18％乙酸溶液调节pH至7.2。
3.2干酪乳杆菌的培养
培养干酪乳杆菌所使用的培养基为MRS培养基。所述培养基各成分的含量(g/500ml)的组分为：酪蛋白胨5g、牛肉膏5g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖10g、磷酸氢二钾2.5g、柠檬酸三铵1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.025g、吐温800.5mL、纯化水定容至500ml。用18％乙酸溶液和20％氢氧化钠溶液调节pH至5.8。
3.3粪肠球菌的培养
培养粪肠球菌所使用的培养基为EC培养基。所述培养基各成分的含量(g/500ml)的组分为：蛋白胨5g、酵母浸膏2.5g、牛肉膏2.5g、葡萄糖2.5g、NaCl 2.5g、吐温-800.5g，纯化水定容至500ml。用10％氢氧化钠溶液和9％乙酸溶液调节pH至7.4。
3.4蜡样芽胞杆菌的培养
培养粪肠球菌所使用的培养基为T4培养基。所述培养基各成分的含量(g/500ml)的组分为：蛋白胨4g，牛肉膏2.5g，氯化钠2.5g，纯化水定容至500ml。用10％氢氧化钠溶液9％乙酸溶液调节pH至7.4。
实施例2菌粉的制备
将4株菌经过活化并放大培养后，分别将发酵完的各菌种的发酵培养液进行离心，转速为10000转/分钟，去除清澈的上清液后，获得菌泥。将菌泥中加入事先灭好的保护剂用强力搅拌机混合均匀，然后将菌泥在-40℃—-20℃的冰箱中预冻过夜，再进行冷冻干燥。冷冻干燥的温度为-60℃，真空度为10-30Pa，真空冷冻的时间为12-24h。冷冻后取出冻干菌体粉碎后过40目筛，真空包装后于-80℃下保存备用。
实施例3
本实施例提供了一种四联益生菌胶囊的制备方法，步骤如下：
1)原料预处理：按产品重量百分比，分别取动物双歧杆菌菌粉3％，干酪乳杆菌菌粉3％，粪肠球菌粉菌粉1％，蜡样芽孢杆菌菌粉0.1％，维生素C 4％，乳糖9.20％，微晶纤维素35.75％，蔗糖14.50％，三硅酸镁4.25％，氢氧化铝2.25％，滑石粉10.50％，其余使用淀粉填充。
2)混合制备；将蔗糖粉与淀粉共同过50目筛后加入批混机，再将剩余辅料依次加入批混机内，最后加入混合菌粉。四种冻干菌粉与辅料在混匀机中混合50分钟结束后放料。
3)成型：利用胶囊填充机将步骤2)混合后的样品装进胶囊，包装后获得成品。
实施例4
本实施例提供了一种四联益生菌片剂的制备方法，步骤如下：
1)原料预处理：按产品重量百分比，分别取动物双歧杆菌菌粉6％，干酪乳杆菌菌粉6％，粪肠球菌菌粉2％，蜡样芽孢杆菌菌粉0.2％，维生素C 6％，乳糖8％，微晶纤维素30.5％，蔗糖12.5％，三硅酸镁2.25％，氢氧化铝1.75％，滑石粉8％，其余使用淀粉填充。
2)混合制备：将蔗糖粉与淀粉共同过50目筛后加入批混机，再将剩余辅料依次加入批混机内，最后加入混合菌粉。四种冻干菌粉与辅料在混匀机中混合50分钟结束后放料。
3)胶囊制备：利用压片机将步骤2)将混合均匀的样品进行压片处理，真空包装后获得成品。
实施例5
(1)菌粉的制备：将4株菌经过活化并放大培养后，分别将发酵完的各菌种的发酵培养液进行离心，转速为10000转/分钟，去除清澈的上清液后，获得菌泥。将菌泥中加入事先灭好的保护剂用强力搅拌机混合均匀，然后将菌泥在-40℃—-20℃的冰箱中预冻过夜，再进行冷冻干燥。冷冻干燥的温度为-60℃，真空度为10-30Pa，真空冷冻的时间为12-24h。冷冻后取出冻干菌体粉碎后过40目筛，真空包装后于-80℃下保存备用。
(2)菌粉和辅料混合：按产品重量百分比，分别取动物双歧杆菌菌粉8％，干酪乳杆菌菌粉8％，粪肠球菌菌粉1.5％，蜡样芽孢杆菌菌粉0.5％，维生素C 7％，乳糖6％，微晶纤维素25.5％，蔗糖10.5％，三硅酸镁2.75％，氢氧化铝2.25％，滑石粉9％，其余使用淀粉填充。在混合过程中将蔗糖粉与淀粉共同过50目筛后加入批混机，再将剩余辅料依次加入批混机内，最后加入混合菌粉。四种冻干菌粉与辅料在混匀机中混合50分钟结束后放料。
(3)压片：利用压片机将步骤2)混合后的样品进行压片处理，包装后获得成品。
实施例6
1.初制后活菌数的测定
无菌秤取3.0g实施例3-5所制备的益生菌制剂样品，加入27.0mL的PBS缓冲液，充分摇匀后，做10倍系列稀释，每个实施例取10个样品。取最终稀释度的菌液100μL滴入选择性琼脂培养基平皿上(动物动物双歧杆菌用TPY培养基，干酪乳杆菌用MRS培养基，粪肠球菌用EC培养基，蜡样芽孢杆菌用T4培养基)，每个样品做3个平皿，以玻璃棒涂布均匀。EC与T4平皿倒置放入培养箱中，需氧培养1天；TPY与MRS平皿分别正置放入厌氧罐中TPY厌氧培养3天，MRS厌氧培养2天。培养后观察每个平皿菌落的生长情况，并计数。当平皿菌落数小于10或大于300时，调整最终稀释度，重新测定。根据3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数：
检测结果如表1所示(初制后实施例中各菌的活菌数)，从图1中可知，利用本发明所制备的四联益生菌制剂，初制菌剂动物动物双歧杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌的总活菌数分别为4.5×108cfu/ml，4.3×108cfu/ml，4.1×107cfu/ml，2.6×106cfu/ml。制剂中的活菌数较高，对日后开发新的四联活菌制剂具有指导意义。
表1 初制后实施例5制剂中活菌数(cfu/ml)
| 菌株 | 活菌数(cfu/ml) |
| 动物双歧杆菌 | 4.5×108 |
| 干酪乳杆菌 | 4.3×108 |
| 粪肠球菌 | 4.1×107 |
| 蜡样芽胞杆菌 | 2.6×106 |
2.贮藏后制剂活菌数的测定
将实施例5所制备的活菌制剂，分别在-4℃和25℃下密封贮藏24个月。贮藏后利用上述方法测定贮藏样品中的总活菌数和各个益生菌的活菌数。
图2到图5为在储藏24个月期间不同储藏温度条件下益生菌制剂中各菌的活菌数变化。所示，从图中可以看出，4℃和25℃下储藏温度下利用本发明方法制备的益生菌制剂在贮藏的前24个月期间活菌数动物双歧杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌在储藏24个月后活菌数分别为3.8×108cfu/ml，7.8×107cfu/ml，2.2×107cfu/ml，1.0×106cfu/ml，各活菌数下降不明显，由此说明，利用本发明制备的四联活菌制剂具有常温储藏的稳定性。目前市售益生菌制剂一般储藏在2-8℃的低温环境，而且在储藏24个期间，活菌数明显下降从而影响产品的品质和治疗保健效果。本发明所提供的益生菌制剂中益生菌的储藏稳定性明显高于传统方法制备的益生菌制剂中益生菌的储藏稳定性。尤其是在25℃下，在贮藏24个月后，利用本发明所制备的益生菌制剂中各菌的活菌数与4℃条件下储藏24和月各菌的活菌数无明显差异。由此说明本发明所提供的四联益生菌制剂的制备方法解决了常温不耐储藏的缺点，与市售益生菌产品相比本发明制备的产品在室温下贮藏稳定性更好。
实施例7菌株对抗生素药物的敏感性
本实施例采用琼脂扩散纸片法，检测纯化后的动物双歧杆菌和干酪乳杆菌对抗生素药物的敏感性。用于检测的标准药敏纸片包括10类20种抗生素：青霉素类(氨苄西林、青霉素)、头孢菌素类(头孢哌酮、头孢唑啉、头孢呋新钠)、全诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星)、氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素)、单环β-内酰胺类(氨曲南)、四环素类(四环素、米诺环素)、糖肽类(万古霉素、替考拉宁)、碳青霉烯类(美洛培南)及其他类(氯霉素)。上述纸片均购自北京天坛药物生物技术开发公司，纸片直径6mm，质量符合WHO标准规定。
取新制备的2个麦氏单位的检测菌株悬液0.5ml加入TPY平皿表面，无菌条件下通风吹干表面液体后，贴放标准药物纸片，培养24-48h后测量并记录抑菌圈直径。参照金黄色葡萄球菌ATCC 25923(Stahpylococcus aureus ATCC 25923)判断标准。
检测结果如表2和3所示。
表2 动物双歧杆菌对抗生素药物的敏感性
注：R＝耐药；I＝中介；S＝敏感；-＝无抑菌圈；*＝参照肠球菌判定标准。
从表2可知，动物双歧杆菌对青霉素类(氨苄西林、青霉素G)、头孢菌素类(头孢哌酮、头孢呋辛钠)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素)、糖肽类(万古霉素、替考拉宁)、碳青霉烯类(美洛培南)抗生素和氯霉素敏感；四环素类(米诺环素、四环素)；对喹诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星)、氨基糖苷类(卡那霉素)抗抗生素耐药。
表3 干酪乳杆菌对抗生素药物的敏感性
注：R＝耐药；I＝中介；S＝敏感；-＝无抑菌圈；*＝参照肠球菌判定标准。
从表3可知，待测菌株对头孢菌素类(头孢哌酮、头孢呋辛钠)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素)、四环素类(四环素、米诺环素)及氯霉素抗生素敏感；对喹诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星)、氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素)中度敏感；对糖肽类(万古霉素、替考拉宁)、单环β内酰胺类(氨曲南)、碳青霉烯类(美洛培南)抗生素和磺胺耐药。
实施例8
1.四联益生菌的制备
按照实施例4所述方法制备四联益生菌片，不同的是，调整其中四种益生菌菌粉所在的重量百分比，分别为：动物双歧杆菌菌粉，6.5％；干酪乳杆菌菌粉，5.5％；粪肠球菌菌粉，
1.0％；蜡样芽孢杆菌菌粉，0.2％。制备好菌粉后，再将菌粉制成总菌体浓度分别为105、106和107CFU/mL的菌悬液，备用。
2.人外周血单个核细胞免疫分析
将制备完成的人外周血单个核细胞(PBMC)计数病调整浓度后，取96孔盘，每孔加入200μL的PBMC，细胞浓度为1ⅹ106个/mL，再加入40μL的四联益生菌制剂的菌悬液，其中总菌体的浓度为105、106和107CFU/mL，混匀后在37℃，5％CO2中培养24小时后取其上清液放入-80℃冰箱中，待酶联免疫分析。
同时，按照同样方法设置对照组。对照组为四种单独菌粉制备的益生菌制剂以及一种市售双歧杆菌四联益生菌商品。
3.分析结果
四联益生菌和各个单菌种的PBMC免疫测定结果如表4所示。
表4 人外周血单个核细胞免疫分析结果
从表4可以看出，不同菌种刺激PBMC对分泌细胞激素IF-12、IFN-γ和IF-4的效果不同。其中，四联益生菌制剂的效果明显好于单独益生菌制剂。而在四联益生菌制剂中，本发明所提供的四联益生菌制剂在相同菌悬液浓度下，IF-12、IFN-γ和IF-4的分泌量明显好于市售的四联益生菌制剂。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种四联益生菌制剂，其特征在于，菌粉占产品的重量百分比为：
动物双歧杆菌菌粉3.0％-8.0％，
干酪乳杆菌菌粉3.0％-8.0％，
粪肠球菌菌粉0.5％-2.0％，
蜡样芽孢杆菌菌粉0.1％-0.5％，
其他组分为辅料；
其中，所述动物双歧杆菌菌种保藏号为CGMCC No.4521，保藏地点为位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2010年12月29日；
所述干酪乳杆菌菌种保藏号为CGMCC No.4520，保藏地点为位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2010年12月29日；
所述粪肠球菌菌种保藏号为CGMCC0460.3，保藏地点为位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日；
所述蜡样芽孢杆菌菌种保藏号为CGMCC0460.4，保藏地点为位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日 ；
所述动物双歧杆菌，对喹诺酮类、氨基糖苷类和单环β-内酰胺类抗生素具有耐受性；所述干酪乳杆菌对糖肽类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素及磺胺具有耐受性。
2.权利要求1所述菌剂，其特征在于，所述辅料为填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂和/或营养强化剂。
3.权利要求2所述菌剂，其特征在于，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素、三硅酸镁和/或氢氧化铝。
4.权利要求2所述菌剂，其特征在于，所述矫味剂为乳糖和蔗糖；所述崩解剂为淀粉；所述粘合剂为蔗糖；所述抗酸剂为三硅酸镁和氢氧化铝；所述润滑剂为滑石粉；所述营养强化剂包括维生素、矿物质、益生元和/或膳食纤维。
5.权利要求2所述菌剂，其特征在于，所述辅料占产品的重量百分比为：
淀粉8％-30％，
乳糖5％-20％，
微晶纤维素10％-50％，
蔗糖10％-30％，
三硅酸镁5％-15％，
氢氧化铝1％-5％，
滑石粉5％-20％。
6.权利要求1所述菌剂，其特征在于，剂型为片剂、散剂或胶囊。
7.权利要求1所述菌剂，其特征在于，每克菌剂含有动物双歧杆菌活菌数和干酪乳杆菌菌数在1ⅹ108CFU以上，粪肠球菌活菌数在1ⅹ107CFU以上，蜡样芽胞杆菌活菌数在1ⅹ106CFU以上
8.一种权利要求1所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)原辅料预处理；分别将原辅料过50-200目筛；
2)混合制备；将蔗糖粉与淀粉共同过50目筛后加入批混机，再将剩余辅料依次加入批混机内，最后加入混合菌粉，四种冻干菌粉与辅料在混匀机中混合50分钟结束后放料；
3)成型：将步骤2)混合后的样品进行成型处理，包装后获得成品。
9.权利要求1-7任一所述菌剂，其特征在于，在食品工业、制药工业中应用。
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