CN103497988B - 一种安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用植物来源的多种微生物混合发酵生产安全、高生物量的乳酸菌产品的方法，属于生物工程领域。本发明所述乳酸菌产品的发酵生产方法中发酵菌种由干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母组成的混合菌种。本发明中将混合菌种依次经一次扩大培养、二次扩大培养后以10%－15%的接种量应用于乳酸菌产品的大规模生产，其合理利用了微生物之间的共生作用，发酵中采用的发酵菌种可控性更强，且最终获得的产品的生物量更高，因此获得的乳酸菌产品应用于动物养殖时，产品更加安全高效，适合在农业生产中广泛应用。

Description

一种安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种生物产品的发酵方法，具体涉及一种安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法。

背景技术

微生物在农业上的作用已逐渐被人们所认识。农业上用的微生物产品根据产品表现形式可分为发酵液和冻干粉，用于动物和水产养殖，起到改善动物肠道环境 ，促进消化吸收，提高免疫能力，促进快速生长，减少药物使用，避免兽药残留等作用；用于农业种植，其优点为成本低，应用效果好，不污染环境，使用后不仅增产而且提高或改善农产品品质，减少化肥用量。研究表明，以双歧杆菌为例，益生菌能起到防病抗病的保健作用与机体摄取的量有直接关系，这就对以防病抗病为目的的益生菌产品的生物含量有了一定的要求，在机体摄取同样产品数量时，生物含量越高的产品，所能起到的防病抗病等保健效果越明显。

乳酸菌是一类能够发酵碳水化合物（主要指葡萄糖）产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的总称。它们广泛分布于自然界，人类对乳酸菌种类及作用的认识是从 19世纪末开始的。

随着人们对乳酸菌的认识，乳酸菌在工业中也有着越来越广泛的应用。如在饲料工业，由于乳酸菌生长繁殖可抑制腐败微生物的生长，并可提高饲料的营养，增加饲料的风味，增进禽畜的食欲而被广泛应用于发酵饲料。在医药工业中，乳酸菌能够抑制肠道致病菌，乳酸菌制成的活菌制剂可治疗肠道功能紊乱，维持肠道菌群平衡，治疗泌尿生殖系统感染，降低胆固醇，控制内毒素，延缓机体衰老，抗肿瘤，并且能够提供某些维生素和氨基酸，同时通过发酵产酸促进钙、磷、铁等矿物质的吸收和利用等。

传统的农用微生物菌剂、生物有机肥多采用自然发酵获得，这种发酵过程随环境条件、季节变换、菌种来源等条件的不同，发酵初始菌种在组成上有所不同，不同生物之间存在拮抗作用，在发酵过程中有益的菌种很难达到一个相当高的水平，影响产品有效生物含量，进而影响产品的作用效果；并且发酵过程缺少控制，容易兹生杂菌产生毒害物质，严重影响产品的使用效果并且产生潜在的安全隐患。因此如何提高乳酸菌产品的安全性和生物量仍然是横亘在现代农业科学家面前的一个亟需解决的难题。

采用已鉴定的两种以上分离纯化的微生物作为菌种，对同种培养基进行发酵，也有人将此称为限定混合发酵。混合发酵能获得一些独特产品，而纯种发酵很难做到。利用它们的互利关系，使混合菌种取长补短，发挥各自优势，生产出成本低、质量优的产品或多种产品。混合的多种菌株，增加了发酵中许多基因的功能。通过不同代谢能力的组合，完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用，可以代替某些基因重组工程菌株，进行复杂的多种代谢反应，或促进生长代谢、提高生产效率。

酵母菌及其菌体本身都有很高的利用价值，酵母菌体含有丰富的蛋白质，且氨基酸比例接近联合国粮农组织(FAO)推荐的较为理想的氨基酸组成值。酵母菌被广泛应用于食品工业、饲料工业及生物制药业。在生物制药业，由于酵母菌体中水溶性维生素和麦角甾醇(维生素 D 的前体物质)含量丰富，因此用紫外线照射酵母菌可以制成维生素 D 强化酵母片剂，供病弱缺钙者服用，同时酵母制剂可调节人体消化系统的微生态环境，促进消化吸收。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法，它采用现代生物工程技术，通过将已经分离纯化获得益生菌株合理配伍成为混合发酵菌种，并利用生物共生作用进行协同发酵，最终生产得到高生物含量的安全的益生菌液。

为解决技术背景所存在的问题，本发明以生物量为评价指标进行共生菌株的筛选。申请人从多种产乳酸杆菌以及现有的益生菌种进行混合培养，发现其中3个纯菌株，分别是干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、粉状毕赤酵母（Pichia farinose），进行混合培养时，令人惊奇的是，三种菌株之间存在显著的共生作用。将其混合培养时可以大幅度升高发酵液中的生物量。其中所述的三种菌株均为常规菌株，可以通过现有的菌株保藏机构获得。

本发明采用以下技术方案：一种安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法，其主要包括如下步骤：

1）发酵菌种的制备：从菌种斜面分别刮取干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母，并使用生活饮用水将其配制成菌悬液，测定各菌悬液中菌种重量，然后按干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母菌种重量为2:2:1混合后制成菌悬液即得到混合发酵原菌种；

2）扩大培养：将混合发酵原菌种按10%－15%的接种量接种于一级培养液中进行摇床发酵，控制发酵温度为35－37℃，摇床发酵36－48h后得到一级发酵液；将一级发酵液按照10%－15%的接种量接种于二次扩大培养液中，控制发酵温度为30－32℃，发酵48－60h后得到二级发酵液； 

3）乳酸菌产品的大规模生产：将二级发酵液按照10%－15%的接种量接种于发酵培养基中，控制发酵温度为30－32℃，发酵60－72h后得到本发明所述乳酸菌产品；

其中：所述步骤2）摇床发酵中摇床转速优选为40－60r/min，所述菌悬液接种于一级培养液时总菌落数不低于1.5×10⁸cfu/mL。菌落的数目可以通过分光光度计或显微镜计数方式计算得到，优选为通过分光光度计测定一定波长下吸光值的方法。

本发明上述发酵生产方法中，所述的一级扩大培养液、二级扩大培养液以及发酵培养基的配方相同，其配方为每1000mL中含有糖蜜80g，食盐2g。

本发明上述发酵生产方法中，原菌种经过摇瓶和菌种桶先后两次扩大培养，得到发酵菌种，按10%－15%接种用于大生产，菌种桶装量3000L，按此比例放大可得20000L－30000L成品。

本发明还请求保护按照上述制备方法制备得到的乳酸菌产品。

本发明提供一种上述乳酸菌产品的应用，即所述乳酸菌产品在饲料工业中的应用。现有技术中，乳酸菌产品已经广泛应用于饲料工业，本发明制备方法所获得乳酸菌产品应用于饲料工业中时，不仅生产成本大大降低，而且质量安全可控，可以使动物机体的免疫力大大提升，其应用于饲料工业是更有优势。

本发明还提供另一种所述乳酸菌产品的应用，即所述乳酸菌产品在医药工业中的应用。基于本发明产品的安全可控特性，所述的乳酸菌产品同样可以被开发为医药产品。

本发明与现有技术相比，具有以下技术优势：

1）传统的乳酸菌制品为自然发酵，发酵过程中菌种组成随环境条件、季节变换、菌种来源等条件变化而发生较大变化，并且发酵过程缺少控制，容易兹生杂菌产生毒害物质，严重影响产品的使用效果并且产生潜在的安全隐患。本发明通过有效菌种的合理配伍制得发酵菌种，属限定混合发酵类型，终产品成分稳定，质量可控性强，产品更加安全。

2）本发明通过将三种纯培养的菌种合理配伍后进行限定混合发酵，发现三种菌种在发酵过程中体现出了明显的共生关系，使得最终产品的生物量大大提高，与三种菌种分别单独发酵提高3－4倍，使得产品更加高效，应用于动物饲养时大大降低了饲养成本。

3）限定混合发酵时可以取长补短，发挥各自优势，能获得一些纯种发酵很难得到的质量更优的独特产品。该产品运用过程中既有利于降低货物运输、养殖生产成本，又可以显著改善动物的摄食量和机体免疫能力。

具体实施方式

本发明以生物量为评价指标进行共生菌株的筛选。申请人从多种产乳酸杆菌以及现有的益生菌种进行混合培养，发现其中3个纯菌株，分别是干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母，进行混合培养时，令人惊奇的是，三种菌株之间存在显著的共生作用。将其混合培养时可以大幅度升高发酵液中的生物量。下面将通过具体实施例进一步表述以这3个菌株为发酵菌种的安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法。但本领域技术人员应知晓，所述实施例不以任何方式限定本发明。

实施例1本发明所述安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法

本发明所述的一种安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法，具体包括以下步骤：

1、从菌种斜面分别刮取干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母，并使用生活饮用水将其配制成菌悬液，测定各菌悬液中菌种重量，然后按干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母菌种重量比为1:1:1比例混合制得菌悬液即得到混合发酵原菌种；

2、将混合发酵菌种按10%－15%的接种量接种于一级培养液中进行摇床发酵，控制发酵温度为35－37℃，摇床发酵36－48h后得到一级种子液；将一级发酵液按照10%－15%的接种量接种于二次扩大培养液中，控制发酵温度为30－32℃，发酵48－60h后得到二级发酵液；其中一次扩大培养中一次扩大培养营养液配方为：糖蜜80kg、食盐2kg，加适量水溶解后定容至1000L。一次扩大培养中种子的生产能力根据实验室条件可适当调节其发酵量，然后进行菌种桶发酵实现二次扩大培养，二次扩大培养的营养液配方与一次扩大培养相同，发酵条件为自溢式半封闭条件培养。接种量控制在10%－15%，根据菌种桶的装量，可得3000L二级发酵液。

将二级发酵液按照10%－15%的接种量接种于发酵培养基中，控制发酵温度为30－32℃，发酵60－72h后得到本发明所述乳酸菌产品；其中将上述菌种桶中的二级发酵液直接用于大规模生产时按10%－15%接种发酵培养，经过一个发酵周期可得20000L-30000L本发明所述的乳酸菌产品。上述发酵培养基的配方与二次扩大培养液相同。

实施例 2本发明所述安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法

本发明所述的一种安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法，具体包括以下步骤：

1、从菌种斜面分别刮取干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母，并使用生活饮用水将其配制成菌悬液，测定各菌悬液中菌种重量，然后按干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母菌种重量比为2:1:1比例混合制得菌悬液即得到混合发酵原菌种；

2、将混合发酵菌种按10%－15%的接种量接种于一次扩大培养液中，控制发酵温度为35－37℃，发酵36－48h后得到一级发酵液；将一级发酵液按照10%－15%的接种量接种于二次扩大培养液中，控制发酵温度为30－32℃，发酵48－60h后得到二级发酵液；其中一次扩大培养中一次扩大培养营养液配方为：糖蜜80kg、食盐2kg，加适量水溶解后定容至1000L。一次扩大培养中种子的生产能力根据实验室条件可适当调节其发酵量，然后进行菌种桶发酵实现二次扩大培养，二次扩大培养的营养液配方与一次扩大培养相同，发酵条件为自溢式半封闭条件培养。接种量控制在10%－15%，根据菌种桶的装量，可得3000L二级发酵液。

将二级发酵液按照10%－15%的接种量接种于发酵培养基中，控制发酵温度为30－32℃，发酵60－72h后得到本发明所述乳酸菌产品；其中将上述菌种桶中的二级发酵液直接用于大规模生产时按10%－15%接种发酵培养，经过一个发酵周期可得20000L-30000L本发明所述的乳酸菌产品。所述发酵培养基的配方与二次扩大培养液相同。

实施例3-实施例4本发明所述安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法

实施例3所述安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法与实施例1相同，区别在于干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母菌种重量比为2:2:1。实施例4所述安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法与实施例2相同，区别在于干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母菌种重量比为2:1:2。

实施例5 本发明所述安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法的生物量测定

分别测定实施例1-4中获得乳酸菌产品的生物量。同时设置参比实施例1-4。参比实施例中不含有粉红毕赤酵母，其余两种菌种的用量配比与对应的实施例相同。其中参比实施例1制备方法与实施例1相同，参比实施例2、3、4制备方法分别与实施例2、3、4相同。

            表 1 实施例1-实施例4中混合发酵中重要参数控制

由表1可以看出：当乳酸菌产品发酵菌种中添加粉红毕赤酵母后进行限定混合发酵时，乳酸菌产品的最终生物量大大提高，提高幅度时为不含有粉红毕赤酵母的3-4倍。而当发酵菌种中干酪乳杆菌、植物乳杆菌和粉状毕赤酵母菌种重量比为2:2:1时，乳酸菌产品的生物量最高，为7.8×10⁸ cfu/mL。

本发明属于限定混合发酵工艺，发酵菌种其菌种是可控的，终产品的安全性是可控的；本发明合理利用微生物共生作用，终产品生物量较之改进前发酵菌种生产的产品提高3－4倍，达到自然发酵产品不能达到的高含量，终产品效果更加明显，所以此发明所得最终产品在产品安全高效方面优于传统发酵产品。

Claims (2)

1.一种安全高效乳酸菌产品的发酵生产方法， 其特征在于， 所述的乳酸菌产品发酵生产方法中发酵菌种是由干酪乳杆菌、 植物乳杆菌和粉状毕赤酵母组成；

所述的乳酸菌产品的发酵生产方法， 其特征在于， 所述的生产方法包括如下步骤 ：

1） 发酵菌种的制备 ： 从菌种斜面分别刮取干酪乳杆菌、 植物乳杆菌和粉状毕赤酵母， 并使用生活饮用水将其配制成菌悬液， 测定各菌悬液中菌种重量， 然后按干酪乳杆菌、 植物乳杆菌和粉状毕赤酵母菌种重量比为2：2：1，混合后制成菌悬液即得到混合发酵原菌种 ；

2） 扩大培养：将混合发酵原菌种按 10%－15% 的接种量接种于一次扩大培养液中， 控制发酵温度为 35－37℃， 发酵 36－48h 后得到一级发酵液 ； 将一级发酵液按照 10%－15%的接种量接种于二次扩大培养液中， 控制发酵温度为30－32℃， 发酵48－60h后得到二级发酵液 ；

3） 乳酸菌产品的大规模生产 ： 将二级发酵液按照 10%－15% 的接种量接种于发酵培养基中， 控制发酵温度为 30－32℃， 发酵 60－72h 后即可得到本发明所述乳酸菌产品；

所述的乳酸菌产品的发酵生产方法， 其特征在于， 菌落的数目可以通过分光光度计或显微镜计数方式测定得到；

所述的乳酸菌产品的发酵生产方法， 其特征在于， 所述菌悬液接种于零级培养液时总菌落数不低于 1.5×10⁸ cfu/mL；

所述的乳酸菌产品的发酵生产方法， 其特征在于， 所述的一次扩大培养液、 二次扩大培养液以及发酵培养基的配方相同， 其配方为每 1000mL 中含有糖蜜 80g， 食盐 2g。

2.如权利要求 1 所述的乳酸菌产品的发酵生产方法， 其特征在于， 所述步骤 2） 中摇床转速为 40－60r/min。

3. 权利要求 1-2 任一所述的发酵生产方法获得的乳酸菌产品。

4. 权利要求 1-2任一所述的发酵生产方法获得的乳酸菌产品在农业生产中的应用。

5. 权利要求 1-2任一所述的发酵生产方法获得的乳酸菌产品在医药工业中的应用。