CN102660473B - 一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，其步骤为：①一级种子培养；②二级种子培养；③连续发酵；④制剂；要求每克酪酸菌制剂成品中酪酸菌活菌数不少于1.0×10⁹个；本发明方法是采用多罐串联连续发酵的方式培养酪酸菌，即以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度放出培养液，从而使发酵罐内的发酵液体积维持恒定，使酪酸菌在稳定状态下生长，可有效延长分批培养中的对数期，提高酪酸菌芽孢体的转化率至95%以上，有效提高发酵产率；同时还可降低劳动强度，提高设备利用率，省时省力，降低总的生产成本。

Description

一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法

 ㈠技术领域：本发明属于微生物发酵技术领域，具体是一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法。

㈡现有技术：酪酸菌即丁酸梭菌( Clostridium butyrium ) 是归属于梭菌属的革兰阳性厌氧芽胞杆菌,存在于土壤、动物和人体的肠道中,同双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及粪链球菌一样,是调节人体及动物体肠道微生态平衡的有益菌。酪酸菌最显著的生物特性是能与双歧杆菌、乳酸菌等肠道有益菌共生,并促进其发育,特别是它能产生促进双歧杆菌发育的因子。与双歧杆菌、乳酸菌等肠道有益菌不同的是，由于酪酸菌具有芽袍，因而对外界环境有较强的抵抗力，把它加热至90℃10分钟、100℃ 5分钟不会失活，在PH 1. 0-5. 0的环境中仍能存活，在PH 4. 0-9. 8的环境中能适合其发育生长，其固体活菌制剂在室温、干燥情况下保存具有良好的稳定性，保存2年以上，未见活菌显著减少。

酪酸菌制剂是目前国内微生态领域开发的又一新产品。酪酸菌是一种厌氧的芽胞杆菌,由于它具有芽胞,因而具有高活性、高稳定性,同时它又是对常用抗生素具有耐受性的肠道正常菌群,可纠正肠道内的菌群紊乱,调节肠道微生态平衡,是一种集乳酸菌和芽胞杆菌优点于一身的活菌制剂,在临床和实际应用方面有其独到之处。随着酪酸菌新生物制品四类新药的研制成功,酪酸菌的一些生物特性和药理作用,受到国内研究者的普遍关注。将酪酸菌的培养液分离、鉴别,发现它含有葡萄糖、麦芽糖等6 种糖,丁酸、乳酸和醋酸等有机酸,蛋白质分解酶等经透析仍不会减弱效力的蛋白质。其中以低聚糖具有最强的双歧杆菌增殖促进作用,是促进双歧杆菌发育的因子。酪酸菌培养液中小分子的有机酸可抑制常见致病菌的生长、定植。国内的许多研究报告已证实酪酸菌对大肠埃希菌、沙门菌等常见肠道致病菌具有拮抗作用。

酪酸菌及其制剂主要应用于以下几个方面

1、作为药物使用

能够治疗肠菌群紊乱、腹泻、肠炎，预防肠癌。另外酪酸菌也可作为肠炎、肝病、化放疗造成的免疫力下降、菌群失调的良好辅助治疗药物。

2、作为兽药使用

酪酸菌可用以治疗动物肠道感染和肠功能异常。酪酸菌可增加动物肠内酪酸、醋酸等短链脂肪酸生成量,可促进排便,可抑制肠道腐败产物氨和胺类的产生;可抑制霍乱弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、出血性大肠杆菌以及引起伪膜性肠炎的魏氏梭菌的繁殖。

3、用作饲料添加剂

酪酸菌能单独作为饲料添加剂使用,也能与乳酸菌、芽孢菌、双歧杆菌等益生菌复配使用,能增强该类产品的功效。在提高动物免疫力、抗病力及降低猪的料肉比方面都有显著效果目前。

酪酸菌微生态制剂的生产主要是利用其活的芽孢体，获得大量的酪酸菌芽孢体或活菌体并保持它们的活性是酪酸菌制剂生产的关键，芽孢数目越多越好。酪酸菌的生产方法都是采用分批液态深层发酵法培养酪酸菌菌体和芽孢，然后分离菌体及芽孢，并将其做成制剂。目前酪酸菌制剂比较流行的生产方法是采用各自取得的酪酸菌生产菌种，使用三级种子培养的方法，发酵培养酪酸菌活菌体，采用管式离心机分离菌体，采用冻干机冷冻干燥的方法制备酪酸菌活菌制剂。

目前国内外有关酪酸菌的文献及专利很多，下述专利:US5.292 523(1994)、 US4.892 731(1990)、7P63-146825(1986)、JP6I-6625(1984)、JP06-166825(1994)、JPO5-227898(1993)、 CN1144873C、CN1184308C CN 100523171 C、CN1403567 A 、CN1463934A 、CN1385402A 、CN 101965910 A 、CN 101032527 A涉及丁酸梭菌活菌剂的制备和用途，酪酸菌的培养方法均采用间歇式分批发酵法，都没有涉及采用连续发酵法来制备酪酸菌活菌制剂的方法。分批发酵的缺点是：人力、物力、动力消耗较大；生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中菌体数量或代谢产物的 g 数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。

㈢ 发明内容：本发明的目的就是要提供一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法；本发明方法采用连续发酵法，使总发酵周期缩短，降低了染菌机会，减少了发酵风险和设备损失，节约成本，同时菌体生长的稳定期较长，菌体数量大，芽孢转化率高，有效提高了发酵产率。

本发明的一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，由下述步骤组成：

①一级种子培养：将配制好的酪酸菌一级种子培养基，分别置于三角瓶A和三角瓶B中，于121℃下蒸汽灭菌30分钟，降温冷却至35℃；再取酪酸菌试管斜面菌种，分别接种于上述已灭菌好的三角瓶A和B中，其中三角瓶B比三角瓶A接种时间延迟10-14h;将三角瓶A和B于34-37℃厌氧培养12-16h；即得一级种子A和一级种子B;

②二级种子培养：将配制好的酪酸菌二级种子培养基分别置于种子罐A和种子罐B中，于121℃蒸汽实罐灭菌30分钟，降温冷却至35℃；再将步骤①培养好的一级种子A和一级种子B，以5%-10%的接种量分别接种于种子罐A和种子罐B中，其中种子罐B比种子罐A接种时间延迟10-14h，以上种子在34-37℃厌氧培养12-16h，即得二级种子A和二级种子B;培养过程中间歇搅拌；上述各级种子培养完毕均应检查其生长状态及纯粹试验；

③ 连续发酵

a.将配制好的酪酸菌发酵培养基，补料培养基分别置于发酵罐A和发酵罐B及补料罐C、补料罐D中，于121℃蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35℃；

b.先将步骤②中培养得到的二级种子A以5%-10%的接种量接种于发酵罐A中，控制罐压0.02MPa-0.04MPa，在34-37℃厌氧培养20-26h，发酵过程中间歇搅拌；

c.发酵罐A接种培养10-14h后，将步骤②中培养得到的二级种子B以5%-10%的接种量接种于发酵罐B中，控制罐压0.02MPa-0.04 MPa,在34-37℃厌氧培养10-12h,发酵过程中间歇搅拌；

d.发酵罐B培养完毕后，将其培养液通过灭菌好的管道压入发酵罐A中，使发酵罐A装料系数达到80%为止，再将补料罐C中的培养基通过灭菌好的管道压入发酵罐B中，使发酵罐B装料系数达到80%为止；

e.当发酵罐A发酵培养20-26h后，将发酵罐A中的培养液以0.084v/h的速度连续放料到离心机中离心，收集菌体；同时将发酵罐B中的培养液以0.084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐A中，再将补料罐C中的培养基以0.084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐B中，维持发酵罐B的体积，保持物料的平衡;补料罐D可随时接替补料罐C，补料罐C和D交替使用，向发酵罐B中补充培养基以满足发酵罐B的体积要求，以形成补料罐C或D→发酵罐B→发酵罐A的多罐串联连续发酵的方式，持续培养酪酸菌菌体；所述的v为发酵罐A的实际装料体积；

f.从发酵罐A开始放料至放料完毕，维持时间为140-360h；最后的结束顺序是先放完补料罐中的培养基至发酵罐B中，再放完发酵罐B中的培养液至发酵罐A中，最后放完发酵罐A中的培养液至离心机中；

④ 制剂：收集菌体，得湿菌泥，按湿菌泥重量的5%添加保护剂，再按湿泥重量2-5倍比例加入玉米淀粉，混合制粒，置沸腾床内，以氮气为气源进行沸腾干燥，干燥后颗粒经粉碎，过60目筛，得菌粉；再与菌粉重量2-10倍的玉米淀粉混合，即得本发明的酪酸菌制剂成品；要求每克成品中酪酸菌活菌数不少于1.0×10⁹个；

上述步骤中使用的酪酸菌种子培养基、发酵培养基及补料培养基、保护剂的组成分别如下：

    一级种子培养基：葡萄糖2.0%~2.5%、牛肉膏0. 5% ~1.5%、 蛋白胨1.0% ~2.5%、磷酸氢二钾0.02% ~0.05%、氯化钠0.05% ~0.2%、硫酸镁0. 02% ~0.2%、水93%~96.9%，培养基的PH 6. 0~7. 5;

二级种子培养基:硫酸铵0.4%~0.8% 、葡萄糖2.5%~3.0%、酵母浸膏0. 5% ~1.8%、蛋白胨0.5% ~1.5%、碳酸钙0. 1%~0. 3%、磷酸氢二钾0.02% ~0.15%、氯化钠0. 05%~0. 15%、硫酸镁0. 02% ~0.05%、水92.45%~95.7%，培养基的PH 6. 0~7. 5;

发酵培养基及补料培养基:硫酸铵1.5%~2. 0%、 葡萄糖4.0%~5. 0%、豆粉水解液6.0%~8. 0%、酵母粉0.5% ~1.0%、磷酸氢二钾0.02% ~0.15%、硫酸锰0.002% ~0.005%、硫酸镁0. 02%~0.15%、、碳酸钙0. 4%~0. 6%、水81. 45%~90.4%，培养基的PH 6. 0~7. 5 ；

保护剂:海藻糖60%、蔗糖38%、维生素C2%;

上述一级、二级种子培养基、发酵培养基及补料培养基，保护剂中的原料用量均为重量百分比；配制时保证所用原料的重量百分比之和为100%。

本发明方法是以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，使得酪酸菌在稳定状态下生长，稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期。在稳定的状态下，酪酸菌所处的环境条件，如营养物浓度、产物浓度、ｐＨ值等都能保持恒定，酪酸菌的菌体的浓度及其比生长速率也可维持不变，还可以根据需要来调节生长速度，提高酪酸菌芽孢体的转化率，控制芽孢体转化率在95%以上。这样可充分利用原料，延长菌体生长的稳定期，得到更多的芽孢体。采取连续发酵的方式可以减少设备的投入数量，能够更有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度；减少设备清洗。准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时；由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长；容易对过程进行优化，有效地提高发酵产率。在目前发酵设备的制作工艺水平和自动控制水平越来越高的条件下，已经能够克服连续发酵法带来的染菌问题，提高产品的生产效率，降低总的生产成本。

本发明与现有技术相比，具有以下特点：

1.本发明采用多罐串联连续发酵的方式，比单罐连续发酵在芽孢率上有较大提高，在发酵罐B培养过程中使酪酸菌处在对数生长期，菌体大量繁殖，在发酵罐A培养过程中酪酸菌处于稳定期，便于芽孢的产生。从发酵罐A放出的培养液中菌落数大于1.0×10⁹个/ml，芽孢率在95%以上，整个生产过程持续稳定；

2.本发明方法不受菌种来源限制，本方法中所涉及的丁酸梭菌菌种保藏编号为:CGMCC1.336，可从中国普通微生物保藏中心(CGMCC)获得；

3.本发明采用连续发酵法来制备酪酸菌，比常用的三级种子培养，分批发酵法生产酪酸菌，减少了种子培养的环节，缩短了总发酵周期，降低了染菌机会，减少了发酵风险和设备投资，以5m³发酵系统为例，现有方法每天放罐两个罐批，每月总发酵体积240m³，至少需要配备两台50L一级种子罐、两台500L二级种子罐、两台5m³发酵罐，至少需要配备4台150型离心机。每月至少需要进60批次的三角瓶种子、60批次的一级种子罐、60批次的二级种子罐、60批次的发酵罐，而采用本发明的连续发酵法来制备酪酸菌，5m³发酵系统达到相同的发酵吨位，则需要配备两台500L一级种子罐，两台5m³发酵罐，两台10m³补料罐，2台105型离心机。每月只需要进2批次的三角瓶种子、2批次的一级种子罐、2批次的发酵罐罐,28批次的补料罐，大大降低移种环节带来的染菌机会，并且能够减少大量的人力和设备投入，这在劳动力成本不断提升的今天，能够节约很大的成本；

4.本技术由于采用连续放料的方式，可以减少菌体分离环节管式离心机的数量；

5.本发明以氮气为气源进行沸腾干燥（氮气经除湿循环使用），保证了酪酸菌的活菌数目。

㈣具体实施方式： 

以下实施例均以体积为5m³发酵罐为例说明

实施例1

本实施例中的酪酸菌一级种子培养基的原料组成是:葡萄糖2.0%、牛肉膏0. 5%、 蛋白胨1.0%、磷酸氢二钾0.02%、氯化钠0.05%、硫酸镁0. 02%、水96.41%，培养基的PH 6.9。

酪酸菌二级种子培养基的原料组成是: 硫酸铵0.4% 、葡萄糖2.5%、酵母浸膏0. 5%、蛋白胨0.5%、碳酸钙0. 1%、磷酸氢二钾0.02%、氯化钠0. 05%、硫酸镁0. 02%、水95.91%，培养基的PH 6. 5。

酪酸菌发酵培养基及补料培养基的原料组成是:硫酸铵1.5%、 葡萄糖4.0%、豆粉水解液6.0%、酵母粉0.5%、磷酸氢二钾0.02%、硫酸锰0.002%、硫酸镁0. 02%、、碳酸钙0. 4%、水87.55%，培养基的PH 6.5 。

保护剂的原料组成是:海藻糖60%、蔗糖38%、维生素C 2%。

酪酸菌冷冻管菌种为丁酸梭菌菌种，保藏编号为:CGMCC1.336，可从中国普通微生物物保藏中心(CGMCC)获得。

本发明方法的工艺步骤如下:

1、一级种子培养: 分别取5L三角瓶A和三角瓶B瓶各4瓶，每瓶装入已配制好的酪酸菌一级种子培养基4L，分别于121℃蒸汽灭菌30分钟，降温冷却至35℃。取酪酸菌试管斜面菌种，接种于灭菌好的三角瓶A和三角瓶B瓶中，三角瓶B接种时间比三角瓶A延迟10h，在36℃厌氧培养12h，得一级种子A和一级种子B。

  2、二级种子培养: 分别在500L种子罐A和种子罐B中加入已制好的酪酸菌二级种子培养基，A、B罐装料系数均为60%，于121℃蒸汽实罐灭菌30分钟，降温冷却至35℃。分别将步骤1中培养好的一级种子A和一级种子B，以5%的接种量接种于种子罐A和B中，在35℃厌氧培养12h，培养过程中间歇式开搅拌;各级种子培养完毕均应检查其生长状态及纯粹试验，得二级种子A和二级种子B。

3、连续发酵

(1)分别将已灭菌好的发酵培养基置于5m³发酵罐A和发酵罐B中，发酵罐装料系数为60%，于121℃蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35℃。补料罐为C、D均为10m³，补料罐装料系数为70%，将补料罐中的补料培养基于121℃蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35℃备用。

(2)先将步骤2中培养得到的二级种子A以5%的接种量接种于发酵罐A中，控制罐压0. 02MPa~0. 04MPa，在36 ℃厌氧培养20h，发酵过程中间歇式开搅拌。

(3)发酵罐A接种培养10h后，将步骤2中培养得到的二级种子B以5%的接种量接种于发酵罐B中，控制罐压0. 02MPa~0. 04MPa，在36 ℃厌氧培养10h，发酵过程中间歇式开搅拌。

(4)发酵罐B培养完毕后，将其培养液通过灭菌好的管道压入发酵罐A中，使得发酵罐A装料系数达到80%时停止，再将补料罐C中的培养基通过灭菌好的管道压入发酵罐B中，使得发酵罐B装料系数达到80%时停止。

(5) 当发酵罐A中发酵培养20h后，将发酵罐A中的培养液以0.084V/h的速度，即0.336m³/h的速度连续放料到离心机收集菌体。同时以相同的速度将发酵罐B中的培养液通过灭菌的管道压入到发酵罐A中，再将补料罐C中的培养基以同样的速度通过灭菌的管道压入到发酵罐B中，维持发酵罐A的体积，保持物料的平衡，补料罐D可随时接替补料罐C，补料罐C和D交替使用，向发酵罐B中补充培养基以满足发酵罐B的体积要求。这样就形成了补料罐C或D→发酵罐B→发酵罐A的多罐串联连续发酵的方式，持续培养酪酸菌菌体。

(6)从发酵罐A开始放料至放料完毕，维持时间为140h；最后的结束顺序是先放完补料罐中的培养基至发酵罐B中，再放完发酵罐B中的培养液至发酵罐A中，最后放完发酵罐A中的培养液至离心机中。

4、菌体收集:采用高速管式离心机连续收集菌体，转速16000r/min，获得湿菌泥; 菌泥放置在4℃冰柜中储存，到一定量后拿出制粒。

5、添加保护剂：将菌泥称重，按湿菌泥重量的5%添加保护剂。

6、混合制粒: 将事先在125℃干燥4h的玉米淀粉，按照湿菌泥重量的2倍比例加入，进行混合制粒。

7、沸腾干燥：将步骤6所制作的菌粒放入沸腾床，以氮气为气源进行沸腾干燥（氮气经除湿循环使用），氮气先经过10℃的表冷除湿，然后加温到72℃。

8、粉筛：将步骤7干燥好的菌粒粉碎并过60目筛网。

9、配料: 将步骤8制成的菌粉和事先在125℃干燥4h的玉米淀粉按重量比1:4的比例进行配料混合，即得本发明的酪酸菌制剂成品。

    10、成品检验:此次制得的菌粉每克成品含酪酸菌活菌数为2.8×10⁹个。

11、真空包装出厂: 将制成的菌粉进行真空包装，包装后经抽样进行全检，合格后出厂。

实施例2

本实施例中的酪酸菌一级种子培养基的原料组成是:葡萄糖2.2%、牛肉膏1.0%、 蛋白胨1.8%、磷酸氢二钾0.04%、氯化钠0.1%、硫酸镁0.1%、水94.76%，培养基的PH 6.9。

酪酸菌二级种子培养基的原料组成是: 硫酸铵0.6% 、葡萄糖2.8%、酵母浸膏1.0%、蛋白胨1.0%、碳酸钙0.2%、磷酸氢二钾0.1%、氯化钠0.1%、硫酸镁0.03%、水94.17%，培养基的PH 6.7。

酪酸菌发酵培养基及补料培养基的原料组成是:硫酸铵1.7%、 葡萄糖4.5%、豆粉水解液7.0%、酵母粉0.8%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸锰0.003%、硫酸镁0.08%、、碳酸钙0.5%、水85.31%，培养基的PH 6.0-7.5。

保护剂的原料组成是:海藻糖50%、蔗糖48%、维生素C 2%。

酪酸菌冷冻管菌种为丁酸梭菌菌种，保藏编号为:CGMCC1.336，可从中国普通微生物物保藏中心(CGMCC)获得。

本发明方法的工艺步骤如下:

1、一级种子培养: 分别取5L三角瓶A和三角瓶B瓶各6瓶，每瓶装入已配制好的酪酸菌一级种子培养基4L，分别于121℃蒸汽灭菌30分钟，降温冷却至35℃。取酪酸菌试管斜面菌种，接种于灭菌好的三角瓶A和三角瓶B瓶中，三角瓶B接种时间比三角瓶A延迟11h，在36℃厌氧培养14h，得一级种子A和一级种子B。

  2、二级种子培养: 分别在500L种子罐A和种子罐B中加入已制好的酪酸菌二级种子培养基，A、B罐装料系数均为60%，于121℃蒸汽实罐灭菌30分钟，降温冷却至35℃。分别将步骤1中培养好的一级种子A和一级种子B，以8%的接种量接种于种子罐A和B中，在35℃厌氧培养14h，培养过程中间歇式开搅拌;各级种子培养完毕均应检查其生长状态及纯粹试验，得二级种子A和二级种子B。

3、连续发酵

(1)分别将已灭菌好的发酵培养基置于5m³发酵罐A和发酵罐B中，发酵罐装料系数为60%，于121℃蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35℃。补料罐为C、D均为10m³，补料罐装料系数为70%，将补料罐中的补料培养基于121℃蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35℃备用。

(2)先将步骤2中培养得到的二级种子A以8%的接种量接种于发酵罐A中，控制罐压0. 02MPa-0. 04MPa，在36 ℃厌氧培养23h，发酵过程中间歇式开搅拌。

(3)发酵罐A接种培养11h后，将步骤2中培养得到的二级种子B以8%的接种量接种于发酵罐B中，控制罐压0. 02MPa-0. 04MPa，在36 ℃厌氧培养12h，发酵过程中间歇式开搅拌。

(4)发酵罐B培养完毕后，将其培养液通过灭菌好的管道压入发酵罐A中，使得发酵罐A装料系数达到80%时停止，再将补料罐C中的培养基通过灭菌好的管道压入发酵罐B中，使得发酵罐B装料系数达到80%时停止。

(5) 当发酵罐A中发酵培养23h后，将发酵罐A中的培养液以0.084V/h的速度，即0.336m³/h的速度连续放料到离心机收集菌体。同时以相同的速度将发酵罐B中的培养液通过灭菌的管道压入到发酵罐A中，再将补料罐C中的培养基以同样的速度通过灭菌的管道压入到发酵罐B中，维持发酵罐A的体积，保持物料的平衡，补料罐D可随时接替补料罐C，补料罐C和D交替使用，向发酵罐B中补充培养发酵罐基以满足发酵罐B的体积要求。这样就形成了补料罐C或D→发酵罐B→发酵罐A的多罐串联连续发酵的方式，持续培养酪酸菌菌体。

(6)从发酵罐A开始放料至放料完毕，维持时间为240h；最后的结束顺序是先放完补料罐中的培养基至发酵罐B中，再放完发酵罐B中的培养液至发酵罐A中，最后放完发酵罐A中的培养液至离心机中。

4、菌体收集:采用高速管式离心机连续收集菌体，转速>16000r/min，获得湿菌泥; 菌泥放置在4℃冰柜中储存，到一定量后拿出制粒。

5、添加保护剂：将菌泥称重，按湿菌泥重量的5%添加保护剂。

6、混合制粒: 将事先在125℃干燥4h的玉米淀粉，按照湿菌泥重量的3倍比例加入，进行混合制粒。

7、沸腾干燥：将步骤6所制作的菌粒放入沸腾床，以氮气为气源进行沸腾干燥（氮气经除湿循环使用），氮气先经过10℃的表冷除湿，然后加温到74℃。

8、粉筛：将步骤7干燥好的菌粒粉碎并过60目筛网。

9、配料: 将步骤8制成的菌粉和事先在125℃干燥4h的玉米淀粉按重量比1:5的比例进行配料混合，即得本发明的酪酸菌活菌制剂的成品。

    10、成品检验:此次制得的菌粉每克成品含酪酸菌活菌数为1.8×10⁹个。

11、真空包装出厂: 将制成的菌粉进行真空包装，包装后经抽样进行全检，合格后出厂。

实施例3

本实施例中的酪酸菌一级种子培养基的的原料组成是:葡萄糖2.5%、牛肉膏1.5%、 蛋白胨2.5%、磷酸氢二钾0.05%、氯化钠0.2%、硫酸镁0.2%、水93.05%，培养基的PH 6.8。

酪酸菌二级种子培养基的原料组成是: 硫酸铵0.8% 、葡萄糖3.0%、酵母浸膏1.8%、蛋白胨1.5%、碳酸钙0.3%、磷酸氢二钾0.15%、氯化钠0.15%、硫酸镁0.05%、水92.25%，培养基的PH 6.5。

酪酸菌发酵培养基及补料培养基的原料组成是:硫酸铵2.0%、 葡萄糖5.0%、豆粉水解液8.0%、酵母粉1.0%、磷酸氢二钾0.15%、硫酸锰0.005%、硫酸镁0.15%、、碳酸钙0.6%、水83.09%，培养基的PH6.4。

保护剂的原料组成是:海藻糖50%、蔗糖48%、维生素C 2%。

酪酸菌冷冻管菌种为丁酸梭菌菌种，保藏编号为:CGMCC1.336，可从中国普通微生物物保藏中心(CGMCC)获得。

本发明方法的工艺步骤如下:

1、一级种子培养: 分别取5L三角瓶A和三角瓶B瓶各8瓶，每瓶装入已配制好的酪酸菌一级种子培养基4L，分别于121℃蒸汽灭菌30分钟，降温冷却至35℃。取酪酸菌试管斜面菌种，接种于灭菌好的三角瓶A和三角瓶B瓶中，三角瓶B接种时间比三角瓶A延迟10h，在36℃厌氧培养16h，得一级种子A和一级种子B。

  2、二级种子培养: 分别在500L种子罐A和种子罐B中加入已配制好的酪酸菌二级种子培养基，A、B罐装料系数均为60%，于121℃蒸汽实罐灭菌30分钟，降温冷却至35℃。分别将步骤1中培养好的一级种子A和一级种子B，以10%的接种量接种于种子罐A和B中，在35℃厌氧培养16h，培养过程中间歇式开搅拌;各级种子培养完毕均应检查其生长状态及纯粹试验，得二级种子A和二级种子B。

3、连续发酵

(1)分别将已灭菌好的发酵培养基置于5m³发酵罐A和发酵罐B中，发酵罐装料系数为60%，于121℃蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35℃,补料罐C、D均为10m³，补料罐装料系数为70%，将补料罐中的补料培养基于121℃蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35℃备用。

(2)先将步骤2中培养得到的二级种子A以10%的接种量接种于发酵罐A中，控制罐压0. 02MPa-0. 04MPa，在36 ℃厌氧培养26h，发酵过程中间歇式开搅拌。

(3)发酵罐A接种培养10h后，将步骤2中培养得到的二级种子B以10%的接种量接种于发酵罐B中，控制罐压0. 02MPa-0. 04MPa，在36 ℃厌氧培养16h，发酵过程中间歇式开搅拌。

(4)发酵罐B培养完毕后，将其培养液通过灭菌好的管道压入发酵罐A中，使得发酵罐A装料系数达到80%时停止，再将补料罐C中的培养基通过灭菌好的管道压入发酵罐B中，使得发酵罐B装料系数达到80%时停止。

(5) 当发酵罐A中发酵培养26h后，将发酵罐A中的培养液以0.084V/h的速度，即0.336m³/h的速度连续放料到离心机收集菌体。同时以相同的速度将发酵罐B中的培养液通过灭菌的管道压入到发酵罐A中，再将补料罐C中的培养基以同样的速度通过灭菌的管道压入到发酵罐B中，维持发酵罐A的体积，保持物料的平衡，补料罐D可随时接替补料罐C，补料罐C和D交替使用，向发酵罐B中补充培养基以满足发酵罐B的体积要求。这样就形成了补料罐C或D→发酵罐B→发酵罐A的多罐串联连续发酵的方式，持续培养酪酸菌菌体。

(6)从发酵罐A开始放料至放料完毕，维持时间为360h；最后的结束顺序是先放完补料罐中的培养基至发酵罐B中，再放完发酵罐B中的培养液至发酵罐A中，最后放完发酵罐A中的培养液至离心机中。

4、菌体收集:采用高速管式离心机连续收集菌体，转速>16000r/min，获得湿菌泥; 菌泥放置在4℃冰柜中储存，到一定量后拿出制粒。

5、添加保护剂：将菌泥称重，按湿菌泥重量的5%添加保护剂。

6、混合制粒: 将事先在125℃干燥4h的玉米淀粉，按照湿菌泥重量的4倍比例加入，进行混合制粒。

7、沸腾干燥：将步骤6所制作的菌粒放入沸腾床，以氮气为气源进行沸腾干燥（氮气经除湿循环使用），氮气先经过10℃的表冷除湿，然后加温到75℃。

8、粉筛：将步骤7干燥好的菌粒粉碎并过60目筛网。

9、配料: 将步骤8制成的菌粉和事先在125℃干燥4h的玉米淀粉按重量比1:6的比例进行配料混合，即得本发明的酪酸菌活菌制剂的成品。

    10、成品检验:此次制得的菌粉每克成品含酪酸菌活菌数为1.3×10⁹个。

11、真空包装出厂: 将步骤8制成的菌粉进行真空包装，包装后经抽样进行全检，合格后出厂。

上述实施例中的一级、二级种子培养基、发酵培养基及补料培养基，保护剂中的原料用量均为重量百分比。

Claims (1)

1.一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，其特征在于由下述步骤组成：

①一级种子培养：将配制好的酪酸菌一级种子培养基，分别置于三角瓶A和三角瓶B中，于121℃下蒸汽灭菌30分钟，降温冷却至35℃；再取酪酸菌试管斜面菌种，分别接种于上述已灭菌好的三角瓶A和B中，其中三角瓶B比三角瓶A接种时间延迟10-14h;将三角瓶A和B于34-37℃厌氧培养12-16h；即得一级种子A和一级种子B;

②二级种子培养：将配制好的酪酸菌二级种子培养基分别置于种子罐A和种子罐B中，于121℃蒸汽实罐灭菌30分钟，降温冷却至35℃；再将步骤①培养好的一级种子A和一级种子B，以5%-10%的接种量分别接种于种子罐A和种子罐B中，其中种子罐B比种子罐A接种时间延迟10-14h，以上种子在34-37℃厌氧培养12-16h，即得二级种子A和二级种子B;培养过程中间歇搅拌；上述各级种子培养完毕均应检查其生长状态及纯粹试验；

③连续发酵：

a.将配制好的酪酸菌发酵培养基，补料培养基分别置于发酵罐A和发酵罐B及补料罐C、补料罐D中，于121℃蒸汽实罐灭菌20分钟，降温冷却至35℃；

b.先将步骤②中培养得到的二级种子A以5%-10%的接种量接种于发酵罐A中，控制罐压0.02MPa-0.04MPa，在34-37℃厌氧培养20-26h，发酵过程中间歇搅拌；

c.发酵罐A接种培养10-14h后，将步骤②中培养得到的二级种子B以5%-10%的接种量接种于发酵罐B中，控制罐压0.02MPa-0.04 MPa,在34-37℃厌氧培养10-12h,发酵过程中间歇搅拌；

d.发酵罐B培养完毕后，将其培养液通过灭菌好的管道压入发酵罐A中，使发酵罐A装料系数达到80%为止，再将补料罐C中的培养基通过灭菌好的管道压入发酵罐B中，使发酵罐B装料系数达到80%为止；

e.当发酵罐A发酵培养20-26h后，将发酵罐A中的培养液以0.084v/h的速度连续放料到离心机中离心，收集菌体；同时将发酵罐B中的培养液以0.084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐A中，再将补料罐C中的培养基以0.084v/h的速度通过灭菌管道压入到发酵罐B中，维持发酵罐B的体积，保持物料的平衡;补料罐D可随时接替补料罐C，补料罐C和D交替使用，向发酵罐B中补充培养基以满足发酵罐B的体积要求，以形成补料罐C或D→发酵罐B→发酵罐A的多罐串联连续发酵的方式，持续培养酪酸菌菌体；所述的v为发酵罐A的实际装料体积；

f.从发酵罐A开始放料至放料完毕，维持时间为140-360h；最后的结束顺序是先放完补料罐中的培养基至发酵罐B中，再放完发酵罐B中的培养液至发酵罐A中，最后放完发酵罐A中的培养液至离心机中；

④制剂：收集菌体，得湿菌泥，按湿菌泥重量的5%添加保护剂，再按湿泥重量2-5倍比例加入玉米淀粉，混合制粒，置沸腾床内，以氮气为气源进行沸腾干燥，干燥后颗粒经粉碎，过60目筛，得菌粉；再与菌粉重量2-10倍的玉米淀粉混合，即得本发明的酪酸菌制剂成品；要求每克成品中酪酸菌活菌数不少于1.0×10⁹个；

上述步骤中使用的酪酸菌种子培养基、发酵培养基及补料培养基、保护剂的组成分别如下：

    一级种子培养基：葡萄糖2.0%~2.5%、牛肉膏0. 5% ~1.5%、 蛋白胨1.0% ~2.5%、磷酸氢二钾0.02% ~0.05%、氯化钠0.05% ~0.2%、硫酸镁0. 02% ~0.2%、水93%~96.9%，培养基的PH 6. 0~7. 5；

二级种子培养基:硫酸铵0.4%~0.8% 、葡萄糖2.5%~3.0%、酵母浸膏0. 5% ~1.8%、蛋白胨0.5% ~1.5%、碳酸钙0. 1%~0. 3%、磷酸氢二钾0.02% ~0.15%、氯化钠0. 05%~0. 15%、硫酸镁0. 02% ~0.05%、水92.45%~95.7%，培养基的PH 6. 0~7. 5；

发酵培养基及补料培养基:硫酸铵1.5%~2. 0%、 葡萄糖4.0%~5. 0%、豆粉水解液6.0%~8. 0%、酵母粉0.5% ~1.0%、磷酸氢二钾0.02% ~0.15%、硫酸锰0.002% ~0.005%、硫酸镁0. 02%~0.15%、、碳酸钙0. 4%~0. 6%、水81. 45%~90.4%，培养基的PH 6. 0~7. 5；

保护剂：海藻糖60%、蔗糖38%、维生素C2%；

上述一级、二级种子培养基、发酵培养基及补料培养基，保护剂中的原料用量均为重量百分比；配制时保证所用原料的重量百分比之和为100%。