CN109055276A - 一种液态混菌菌剂制备方法 - Google Patents

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钟成
田亚东
韩琳洁
贾士儒
谢燕燕
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
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    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms

Abstract

本发明公开了一种液态混菌菌剂制备方法，属于益生菌制剂技术领域，所述益生菌制剂由液态发酵制备，液态菌剂培养方法为：将凝结芽孢杆菌，乳酸片球菌，及植物乳杆菌，35℃，100rpm/min，湿度45～65％，恒温恒速培养24h制备成种子液，随后按照10％的接种量接种至同一培养基中混合培养24h，即得到液态混菌菌剂。该菌剂作为饲料的添加剂。本发明利用混菌发酵，对菌种的生长、增殖等方面具有互相促进作用，同时可节约生产成本，降低发酵能耗。

Description

一种液态混菌菌剂制备方法
技术领域
本发明属于益生菌制剂技术领域，涉及一种液态混菌菌剂制备方法，该菌剂作为一种饲料添加剂。
背景技术
乳酸菌是动物消化道内的有益微生物，代谢产生抑菌物质，具有抗菌谱广、不易产生耐药性等优点，而且乳酸菌兼具营养保健的功能，是备受关注的新型饲料添加剂。乳酸菌安全且多具益生功能，其代谢所产生的抑菌物质具有广谱高效的特点，筛选出产抑菌物质的乳酸菌共培养组合，能够提高效率，简化工艺，因而不断被研究关注。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)又称乳酸芽孢杆菌，是一类能形成芽孢的产乳酸细菌。凝结芽孢杆菌除了具备普通乳酸菌所具有的维持肠道微生态平衡，刺激免疫，提高机体健康水平，提高人和动物消化功能等作用外，同时由于能形成芽孢还具有普通乳酸菌所不具备的环境抗逆性强、抗胃酸、抗干燥、耐高温高压、易贮存等独特的生物特性。这就使得它作为益生素在众多应用领域中得到重视，特别是在饲料领域中的应用。1992年，美国食品与药物管理局(FDA)和美国饲料控制官员协会批准了42种饲用微生物饲料添加剂名单，其中有5种芽孢杆菌，凝结芽孢菌被放在了第一位。我国对饲用凝结芽孢杆菌的研究相对起步较晚，目前还处于初级阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种液态混菌菌剂制备方法，所得菌剂可提高发酵产品的活菌数，提高饲料原料蛋白质的降解率及氨基态氮的含量。此制备方法生产成本低，操作简单，进一步提高经济效益。
为实现上述目的，本发明采用了一下技术方案：
一种液态混菌菌剂制备方法，包括以下步骤：
(a)制备菌种种子液：
分别将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、乳酸片球菌(Lactococcuslactococcus)、及植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，制备成种子液。培养基为：MRS肉汤培养基。培养条件为：温度35℃，湿度45～65％，转速100rpm/min，，恒温恒速培养24h制备成种子液。
(b)液态混菌菌剂的制备：
接种凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌和植物乳杆菌，至同一培养基中混合培养18～27h，即得到液态混菌菌剂。培养温度为30～38℃，湿度45～65％，转速100-160rpm/min，接种量为2.0～14％(v/w)。
其中，上述步骤中的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、乳酸片球菌(Lactococcus lactococcus)、及植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)菌液的接种量相等，均为液体培养基重量的2.0～14％(v/w)，培养条件为：30～38℃，湿度45～65％，转速100-160rpm/min，恒温发酵18～27h；所述步骤中液体发酵培养基由以下组分组成：蛋白胨8～14g/L，牛肉粉8～14g/L，酵母粉3～8g/L，葡萄糖16～26g/L，磷酸氢二钾1～3g/L，柠檬酸氢二铵1～3g/L，乙酸钠3～8g/L，硫酸镁0.3～0.8g/L，硫酸锰0.1～0.4g/L，吐温3～7ml，蒸馏水定容到1L，按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至5.5～6.2。所述液态发酵培养基118℃，高压高温灭菌15分钟，灭菌后接种发酵。
用上述方法获得的液态混菌菌剂作为饲料的添加剂的用途也属于本发明的保护范围。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(一)本发明所采用的是两种乳酸菌和一种芽孢杆菌混合发酵，无论是活菌还是代谢产物都更加丰富；
(二)本发明的液态混菌发酵菌剂在储存过程中活性稳定，抗杂菌能力强，提高了产品质量。
(三)本发明中的乳酸菌和凝结芽孢杆菌的生长会产生乳酸、乙醇、醋酸等酸性物质，酸性物质的有利于改善饲料的适口性，提高采食率。
具体实施方式
通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明关键在于比较单独菌株进行发酵，两种菌共培养发酵，以及三种菌混合发酵的活菌数，所以，具体的实施方式主要区别是发酵培养条件。具体方式实施如下：
实验材料
植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、乳酸片球菌(Lactococcuslactococcus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，天津市畜牧兽医研究所提供。
实施案例1
(a)制备菌种种子液：
分别将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、乳酸片球菌(Lactococcuslactococcus)、及植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，制备成种子液。培养基为：MRS肉汤培养基。培养条件为：温度35℃，湿度45～65％，转速100rpm/min，恒温恒速培养24h制备成种子液。
(b)液态混菌菌剂的制备：
接种凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌和植物乳杆菌，至同一培养基中混合培养18h，即得到液态混菌菌剂。培养温度为30℃，湿度45～65％，转速100rpm/min，接种量为2.0％(v/w)。
所述步骤中液态发酵培养基由以下组分组成：蛋白胨12g/L，牛肉粉12g/L，酵母粉6g/L，葡萄糖24g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温5ml，蒸馏水定容到1L；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至5.9。所述液态发酵培养基118℃，高压高温灭菌15分钟，灭菌后接种发酵。
实施案例2
(a)制备菌种种子液：
分别将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、乳酸片球菌(Lactococcuslactococcus)、及植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，制备成种子液。培养基为：MRS肉汤培养基。培养条件为：温度35℃，湿度45～65％，转速100rpm/min，恒温恒速培养24h制备成种子液。
(b)液态混菌菌剂的制备：
接种凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌和植物乳杆菌，至同一培养基中混合培养22h，即得到液态混菌菌剂。培养温度为35℃，湿度45～65％，转速135rpm/min，接种量为8.0％(v/w)。
所述步骤中液态发酵培养基由以下组分组成：蛋白胨12g/L，牛肉粉12g/L，酵母粉6g/L，葡萄糖24g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温5ml，蒸馏水定容到1L；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至5.9。所述液态发酵培养基118℃，高压高温灭菌15分钟，灭菌后接种发酵。
实施案例3
(a)制备菌种种子液：
分别将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、乳酸片球菌(Lactococcuslactococcus)、及植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，制备成种子液。培养基为：MRS肉汤培养基。培养条件为：温度35℃，湿度45～65％，转速100rpm/min，恒温恒速培养24h制备成种子液。
(b)液态混菌菌剂的制备：
接种凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌和植物乳杆菌，至同一培养基中混合培养27h，即得到液态混菌菌剂。培养温度为38℃，湿度45～65％，转速160rpm/min，接种量为14.0％(v/w)。

Claims (6)

1.一种液态混菌菌剂制备方法，包括以下步骤：
(a)制备菌种种子液：
分别将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、乳酸片球菌(Lactococcuslactococcus)、及植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，制备成种子液。培养基为：MRS肉汤培养基。培养条件为：温度35℃，湿度45～65％，转速100rpm/min，恒温恒速培养24h制备成种子液。
(b)液态混菌菌剂的制备：
接种凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌和植物乳杆菌，至同一培养基中混合培养18～27h，即得到液态混菌菌剂。培养温度为30～38℃，湿度45～65％，转速100-160rpm/min，接种量为2.0～14％(v/w)。
2.根据权利要求1所述的一种液态混菌菌剂制备方法，其特征在于：
上述步骤(b)中的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、乳酸片球菌(Lactococcuslactococcus)、及植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)菌液的接种量相等，均为液体培养基重量的2.0～14％(v/w)，培养条件为：30～38℃，湿度45～65％，转速100-160rpm/min，恒温发酵18～27h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(b)中液体发酵培养基由以下组分组成：蛋白胨8～14g/L，牛肉粉8～14g/L，酵母粉3～8g/L，葡萄糖16～26g/L，磷酸氢二钾1～3g/L，柠檬酸氢二铵1～3g/L，乙酸钠3～8g/L，硫酸镁0.3～0.8g/L，硫酸锰0.1～0.4g/L，吐温3～7ml，蒸馏水定容到1L，按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至5.5～6.2。
4.根据权利要求2所述的一种液态混菌菌剂制备方法，其特征在于：
所述步骤中凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、乳酸片球菌(Lactococcuslactococcus)、及植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的接种量均为液态发酵培养基重量的10％，培养条件为，35℃，100rpm/min，湿度45～65％，恒温恒速发酵24h。
5.根据权利要求3所述的一种液态混菌菌剂制备方法，其特征在于：
所述步骤中液态发酵培养基由以下组分组成：蛋白胨12g/L，牛肉粉12g/L，酵母粉6g/L，葡萄糖24g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温5ml，蒸馏水定容到1L；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至5.9。
6.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌液态混菌发酵菌剂主要用于饲料的添加剂。
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