CN110295199A - 一种抑制黄曲霉的复合发酵物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抑制黄曲霉的复合发酵物及其制备方法和应用，涉及微生物技术领域，本发明所述抑制黄曲霉的复合发酵物，为植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌中的两种或三种的复合发酵上清液。如本发明具体实施例记载的黄曲霉抑菌试验所示，乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌的发酵上清液的浓缩物均对黄曲霉的生长有抑制作用，乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌复合发酵的复合发酵上清液的浓缩物也对黄曲霉的生长有抑制作用。本发明提供的复合发酵物为乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌中两种或三种的复合发酵产物，对人和环境安全。因而本发明提供了一种安全有效的黄曲霉抑制剂。

Description

一种抑制黄曲霉的复合发酵物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种抑制黄曲霉的复合发酵物及其制备方法和应用。
背景技术
黄曲霉是一类生命力极其顽强的腐败微生物，在动物饲料中生长会对人和动物产生伤害，同时黄曲霉是在饲料储存、贮藏过程中引起饲料腐败霉化的主要污染源之一。
国内外对如何抑制黄曲霉生长进行了大量研究，如热处理、红外线处理等物理方法，添加乳酸、苯甲酸等添加剂的化学方法等，但随着实际应用，这些传统方法尚未证明是经济有效可行的。研究和开发绿色饲料添加剂产品，已经成为世界性的研究课题。
目前国内外研究表明，部分菌种对黄曲霉的生长和毒素的形成有一定的抑制作用；但是尚没有成熟的、效率高的抑制黄曲霉的菌种应用。
发明内容
本发明为了克服现有缺乏一种有效抑制黄曲霉的制剂的缺陷，提供了一种抑制黄曲霉的复合发酵物及其制备方法和应用，植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌各自复合发酵上清液的浓缩物及其复合发酵的上清液浓缩物均具有黄曲霉抑制作用，是一种安全有效的黄曲霉抑制剂。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种抑制黄曲霉的复合发酵物，为植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌中的两种或三种的复合发酵上清液。
优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌ACCC11016；所述乳酸片球菌为乳酸片球菌CGMCC1.4；所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌ACCC10229。
优选的，所述复合发酵物的pH值为4.2～5.6，活菌数为6.4～10.71lg cfu·g-1。
本发明还提供了上述技术方案所述复合发酵物的制备方法，包括以下步骤：
将含有植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌中的两种或三种的菌种接种于发酵培养基，32～37℃下发酵20～30h，固液分离，得到所述抑制黄曲霉的复合发酵物。
优选的，分别取植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌的菌悬液，按照OD600值之比依次为0～2：0～2：0～2进行混合，得到菌种；
其中，植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌的菌悬液OD600值之比中，至多有一个为0。
优选的，所述植物乳杆菌的菌悬液OD600值为0.4～3.6，所述乳酸片球菌的菌悬液OD600值为0.5～5.0，所述凝结芽孢杆菌的菌悬液OD600值为0.3～4.8。
优选的，菌种的接种量为发酵培养基体积的8～15％。
优选的，所述发酵培养基选自MRS培养基。
优选的，所述发酵时还伴随搅拌，所述搅拌的速率为100～160rpm。
本发明还提供了前述技术方案所述复合发酵物在抑制黄曲霉中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种抑制黄曲霉的复合发酵物，为植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌中的两种或三种的复合发酵上清液。如本发明具体实施例记载的黄曲霉抑菌试验所示，乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌的发酵上清液的浓缩物均对黄曲霉的生长有抑制作用，乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌复合发酵的复合发酵上清液的浓缩物也对黄曲霉的生长有抑制作用。而且本发明提供的复合发酵物为乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌中两种或三种的复合发酵产物，对人和环境安全。因而本发明提供了一种安全有效的黄曲霉抑制剂。
附图说明
图1为植物乳杆菌的生长曲线；
图2为乳酸片球菌的生长曲线；
图3为凝结芽孢杆菌的生长曲线；
图4为植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌混合培养的生长曲线；
图5为不同浓度黄曲霉孢子生长对比图(48h)；
图6为菌种发酵后上清浓缩液抑菌效果图。
具体实施方式
本发明提供了一种抑制黄曲霉的复合发酵物，为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)和凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)中的两种或三种的复合发酵上清液的浓缩物。在本发明中，所述复合发酵物可以是植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌中两种以上复合发酵的复合发酵上清液的混合物，如本发明具体实施方式所示，植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌单独或复合发酵的产物均可有效抑制黄曲霉。
在本发明中，所述植物乳杆菌优选为植物乳杆菌ACCC11016，购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心。在本发明中，所述乳酸片球菌优选为CGMCC1.4，购自于购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。在本发明中，所述凝结芽孢杆菌优选为凝结芽孢杆菌ACCC10229，购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
在本发明中，所述复合发酵物的pH值优选为4.2～5.6，更优选为4.25～4.4。在本发明中，所述复合发酵物的活菌数优选为6.4～10.71lg cfu·g-1，更优选为10.33～10.70lg cfu·g-1。
本发明还提供了一种上述技术方案所述抑制黄曲霉的复合发酵物的制备方法，包括以下步骤：
将含有植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌中的两种或三种的菌种接种于发酵培养基，32～37℃下发酵20～30h，固液分离，得到复合发酵上清液；将复合发酵上清液浓缩8～15倍，得到所述抑制黄曲霉的复合发酵物。
在本发明中，所述分别取植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌的菌悬液，按照OD600值之比依次为0～2：0～2：0～2进行混合，得到菌种；其中，植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌的菌悬液OD600值之比中，至多有一个为0。更优选的，所述植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌的菌悬液OD600值之比优选为0.5～2：0.5～2：0.5～2，更优选为1:1:1。本发明对所述植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌各自的菌悬液制备方法无特殊限定。本发明优选的，所述植物乳杆菌的菌悬液OD600值为0.4～3.6，所述乳酸片球菌的菌悬液OD600值为0.5～5.0，所述凝结芽孢杆菌的菌悬液OD600值为0.3～4.8。
在本发明中，所述菌种的接种量优选为发酵培养基体积的8～15％，更优选为10％。在本发明中，所述发酵培养基包括但不限于MRS培养基。
在本发明中，所述发酵的时间优选为24h；所述发酵的温度优选为35℃；所述发酵时优选的还伴随搅拌，搅拌速率优选为100～160rpm，更优选为120rpm。
本发明对所述固液分离方式无特殊限定，采用本领域已知的方法即可，例如离心或过滤。本发明对所述复合发酵上清液的浓缩方式无特殊限定，采用本领域已知的浓缩方法即可，例如旋转蒸发。在本发明中，所述浓缩的倍数优选为10倍。
本发明提供了前述技术方案所述复合发酵物在抑制黄曲霉中的应用。具体的，本发明可以将前述技术方案所述的复合发酵物制成各种本领域已知的剂型，包括但不限于悬浮剂、乳油剂、溶液剂、泡腾剂、粉剂等。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1材料与方法
试验材料
试验菌株：植物乳杆菌lactobacillus plantarum ACCC11016购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心；乳酸片球菌Pediococcus acidilactici CGMCC 1.4购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans ACCC10229购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心；黄曲霉菌Aspergillus flavus CICC NO.2219购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
培养基：MRS培养基(Modified MRS Medium Base，MRS)购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；马铃薯葡萄糖(PDA)固体培养基：马铃薯200g，琼脂8g，溶于1L去离子水，121℃灭菌20min，参考张国华所描述的配方配制(张国华.不同地区传统面食发酵剂中菌群结构及优势菌种代谢的研究[D].浙江大学，2014.)。
试验仪器：LRH-250A生化培养箱，由韶关市泰宏医疗器械有限公司生产；HNTC-2027恒温培养振荡器，由天津欧诺仪器股份有限公司生产；SBA-40E生物传感分析仪，由山东省科学院生物研究所生产；UV-6100紫外可见分光光度计，由上海美谱达仪器有限公司生产；常规试剂及仪器由本实验室提供。
1.2试验方法
1.2.1菌种的活化
用无菌接种环从冻存管中取出植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌，分别于MRS固体斜面上划线，置35℃培养箱中培养至出现菌落，如此活化2次后挑取单菌落接于MRS液体培养基中35℃，120rpm培养过夜，备用。
1.2.2生长曲线、pH值以及发酵液葡萄糖残留量(RG)的测定
分别将活化好的植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌以OD600nm值1:1:1比例的混合菌按10％(v:v)接种量接于MRS液体培养基中，35℃，120rpm培养24h，培养期间定时取样测定菌液的OD600nm吸光度、pH值和RG值，绘制各菌株生长曲线、pH变化曲线和RG变化曲线，以观察各菌种单独培养及混合培养的生长变化，每组试验3个重复。
1.2.3菌种的平板计数
将上述活化后的混合培养的菌液用0.85％(w:v)的无菌PBS缓冲液分别稀释至10-7、10-8、10-9、10-10后进行涂布，35℃培养过夜，进行菌落计数，每组试验3个重复。
1.2.4抑菌试验
1.2.4.1黄曲霉孢子悬液的制备及指示菌浓度的确定
将黄曲霉接种在PDA平面培养基上，在30℃培养箱内培养4d后，加入一定量的无菌PBS缓冲液刮取斜面上的孢子，将黄曲霉菌孢子洗下，收集到离心管中，用无菌的PBS缓冲液洗涤3次后，再用无菌纱布过滤3次除去黄曲霉菌孢子的菌丝，进行血球计数板计数。将孢子悬液浓度调整为103孢子/ml、104孢子/ml、105孢子/ml、106孢子/ml、107孢子/ml，涂布到PDA平板上30℃培养。
1.2.4.2发酵上清浓缩液的制备
将上述活化后的混合培养的菌种接种到MRS液体培养基中35℃、120rpm培养24h后测定pH值，在4℃、10000rpm下离心15min，取上清液，用酸度计测量其pH值，然后将上清液旋蒸浓缩10倍，待用。
1.2.4.3抑菌活性的测定
抑菌实验采用琼脂扩散法进行测定，取指示菌孢子悬液100μl(每个平板约含106个孢子)与经融化后保持在45℃左右的PDA半固体培养基混匀后倒入平板上，凝固后用内径8mm打孔器打孔，将100μl植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌混合培养的上清浓缩液注入孔中，于4℃水平放置预扩散24h后30℃培养12h测量其抑菌圈直径，每组试验3个重复。
1.3数据处理与分析
数据分析和图表制作分别由IBM SPSS statistic 20.0和Microsoft Excel 2010完成，数据均以“平均值±标准差”表示。
在抑菌试验中发现乳酸片球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌混合培养的上清浓缩液对黄曲霉的生长有抑制作用；乳酸片球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌混合培养的上清浓缩液的抑菌直径为15.173±0.032mm。
实验结果数据：
2结果
2.1菌种的生长曲线
图1中，从植物乳杆菌的生长曲线图可以看出，在2h左右的迟缓期后开始进入对数生长期，在22h时达到最大OD600nm值3.482±0.003；起始pH为5.40在2h后迅速下降，在22h时达到最低值4.16±0.021；从发酵液葡萄糖残留量的变化曲线可以看出，以每2h接近1.0g/L的下降趋势下降，22h时RG值最低，为7.58±0.144，与起始发酵液RG值相比下降了8.25g/L，OD600nm值、pH值及RG值三者变化曲线一致。
从乳酸片球菌的生长曲线图(图2)可以看出，在2h左右的迟缓期后开始进入对数生长期，在20h时达到最大OD600nm值4.686±0.006；其pH值从起始5.37经过22h下降到最低值4.21；与植物乳杆菌不同的是，乳酸片球菌发酵液的RG值要更低，24h时为4.42±0.144(P<0.05)；与植物乳杆菌相比，乳酸片球菌的OD600nm值更高(P<0.05)。
与以上两种菌株不同的是，如图3所示，凝结芽孢杆菌在6h左右才开始进入对数生长期，而且对数期较短，20h左右其OD600nm值达到最大值4.094±0.010，其值介于植物乳杆菌与乳酸片球菌之间(P<0.01)；其pH值在12h时达到最低值4.26±0.025，从12h～24h之间，其pH值变化不大，接近平稳；其发酵液的RG值在22h时最低7.00±0.250，介于植物乳杆菌与乳酸片球菌之间(P<0.05)。
如图4所示，三种菌以OD600nm值1:1:1接种的混合培养液，在2h左右进入对数生长期，2h～8h之间OD600nm值变化较快，8h～20h之间有段缓慢的增长期，20h达到最大值3.741±0.003；同样其发酵液的pH值变化也有两段变化，变化趋势与OD600nm值一致，在22h时达到最低为4.24±0.006；其发酵液RG值在24h时最低7.67±0.289，6h～8h和14h～18h两段时间，RG值有两个明显变化(P<0.05)。
2.2菌种的活菌计数
表1菌种发酵活菌测定结果(lg cfu·g-1)
同列数据肩标大写字母不同表示差异显著(P<0.05)，含有相同大写字母表示差异不显著(P>0.05)
同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，含有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)
由表1同行数据可知，植物乳杆菌培养液在4h～24h之间活菌数差异显著(P<0.05)，4h～16h处于对数生长期，16h～24h处于衰退期；乳酸片球菌培养液4h～16h处于对数生长期，活菌数差异显著(P<0.05)，16h～24h处于稳定期，活菌数差异不显著(P>0.05)；凝结芽孢杆菌培养液在4h～24h之间活菌数差异显著(P<0.05)，4h～10h处于对数生长期，10h～24h处于衰退期；混合培养液在4h～24h之间活菌数差异显著(P<0.05)，4h～16h处于对数生长期，16h～24h处于衰退期，以上三种菌及其混合培养液的活菌数变化曲线与OD600nm值变化曲线趋势一致。
由表1同列数据可见，只有三组数据12h乳酸片球菌与混合培养液、16h乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌培养液、24h植物乳杆菌与凝结芽孢杆菌培养液的活菌数无显著性差异(P>0.05)，同一时间其他不同菌种之间的培养液活菌数之间均是显著性差异(P<0.05)。在三种菌及其混合培养24h过程中，植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌及其混合培养液分别在16h、16h、12h、16h左右活菌数达到最大值。
2.3指示菌黄曲霉孢子悬液浓度的确定
图5为不同浓度的黄曲霉孢子悬液生长48h后的对比图，孢子悬液浓度为103孢子/ml和104孢子/ml的平板，黄曲霉生长时间需5～7d，实验周期过长。孢子悬液浓度为107孢子/ml的平板，因孢子浓度过高，黄曲霉菌丝生长及孢子萌发过快，不易观察抑菌实验结果，在105孢子/ml和106孢子/ml中进行选择，从生长状况及易于观察方面考虑，故均以106孢子/ml浓度的菌悬液进行抑菌实验。
2.4菌种发酵上清浓缩液的抑菌直径
图6是三种菌及其混合培养的上清浓缩液的抑制黄曲霉效果图。从表2可以看出，以浓度为106孢子/ml黄曲霉为指示菌的六组数据，其中植物乳杆菌和乳酸片球菌的抑菌直径最大(P<0.05)。
菌种发酵后上清浓缩液抑菌圈直径的测定结果如表2所示：
表2菌种发酵后上清浓缩液抑菌圈直径的测定结果
注：同行数据肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同则表示差异不显著(P>0.05)。
3讨论
本发明结合植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌单独培养及混合培养液的生长曲线、pH值、RG值、活菌计数及对黄曲霉的抑菌直径，混合培养液的OD600nm值、pH值、RG值及活菌数最大值在发酵过程中均介于三种菌之间，其24h发酵后上清浓缩液的抑菌直径介于三者之间，且混合培养的对数生长期明显变长，推测三种菌在混合培养过程中菌种生长可能会有先后顺序，其原因有待进一步研究。
本发明试验结果，本发明提供的植物乳杆菌、乳酸片球菌、凝结芽孢杆菌单独或复合发酵的发酵上清液的浓缩液能抑制黄曲霉的生长。
4结论
在抑菌试验中发现乳酸片球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌及其混合培养的上清浓缩液均对黄曲霉的生长有抑制作用；乳酸片球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌及其三者混合培养的上清浓缩液的抑菌直径分别为15.860±0.050mm、15.737±0.155mm、14.287±0.096mm和15.173±0.032mm；其中植物乳杆菌和乳酸片球菌的抑菌直径最大(P﹤0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抑制黄曲霉的复合发酵物，其特征在于，为植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌中的两种或三种的复合发酵上清液的浓缩物。
2.根据权利要求1所述的复合发酵物，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌ACCC11016；所述乳酸片球菌为乳酸片球菌CGMCC1.4；所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌ACCC10229。
3.根据权利要求1或2所述的复合发酵物，其特征在于，所述复合发酵物的pH值为4.2～5.6，活菌数为6.4～10.71lg cfu·g-1g。
4.权利要求1～3任意一项所述复合发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含有植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌中的两种或三种的菌种接种于发酵培养基，32～37℃下发酵20～30h，固液分离，得到复合发酵上清液；将复合发酵上清液浓缩8～15倍，得到所述抑制黄曲霉的复合发酵物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，分别取植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌的菌悬液，按照OD600值之比依次为0～2：0～2：0～2进行混合，得到菌种；
其中，植物乳杆菌、乳酸片球菌和凝结芽孢杆菌的菌悬液OD600值之比中，至多有一个为0。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌的菌悬液OD600值为0.4～3.6，所述乳酸片球菌的菌悬液OD600值为0.5～5.0，所述凝结芽孢杆菌的菌悬液OD600值为0.3～4.8。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，菌种的接种量为发酵培养基体积的8～15％。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基选自MRS培养基。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵时还伴随搅拌，所述搅拌的速率为100～160rpm。
10.权利要求1～3任意一项所述复合发酵物在抑制黄曲霉中的应用。
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