CN107325995A

CN107325995A - 一种唾液链球菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN107325995A
Application number: CN201710795508.9A
Authority: CN
Inventors: 吴正钧; 于亚男; 韩瑨; 冯华峰
Original assignee: Bright Dairy and Food Co Ltd
Current assignee: Bright Dairy and Food Co Ltd
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2017-11-07

Abstract

本发明提供了一种唾液链球菌菌株，其保藏编号为CGMCC NO.13308。本发明还提供了唾液链球菌CGMCC NO.13308在制备变形链球菌生长抑制剂及变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用。本发明首次披露了一种新的唾液链球菌CGMCC NO.13308，唾液链球菌CGMCC NO.13308的菌体具有抑制变形链球菌生长的功能，且其M17发酵上清液可显著降低变形链球菌生物膜的形成量。本发明拓宽了唾液链球菌在龋齿防治方面的应用前景及可产业化资源。

Description

一种唾液链球菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种唾液链球菌菌株及其在制备变形链球菌生长和生物膜形成抑制剂中的应用。

背景技术

龋齿，俗称虫牙、蛀牙，是一种细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。如不及时治疗，病变继续发展，形成龋洞，终至牙冠完全破坏消失，其发展的最终结果是牙齿丧失。龋齿特点是发病率高，分布广。该病是口腔主要的常见病，也是人类最普遍的疾病之一，世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。

引发龋齿的因素众多，如细菌、口腔环境(食物、唾液)、宿主等，其中，细菌是龋齿发生必要条件，一般认为致龋菌有两种类型，一种是产酸菌属，其中主要为变形链球菌(Streptococcus mutans，简称S.mutans)、放线菌属和乳杆菌，可使碳水化合物分解产酸，导致牙齿无机质脱矿；另一种是革兰阳性球菌，可破坏有机质，经过长期作用可使牙齿形成龋洞。上述致龋菌中，变形链球菌被国内外学者公认为是引发龋齿的最主要和最重要的病原菌。因此，通过抑制或杀灭变形链球菌的方法来控制口腔中主要致龋菌的数量，进而预防和治疗龋齿是行之有效的手段。目前控制的药物较少，氨硝酸银是为数不多的其中之一，氨硝酸银是一种防腐杀菌性药物，具有防腐、收敛、杀菌及腐蚀作用，但该药物可使牙齿染色，故不适用于前牙治疗。

而另一方面，由于变形链球菌所产生的生物膜(不溶性多糖)可促进致龋菌在牙齿表面的吸附与积累，继而形成牙菌斑恶化龋齿的程度，因此，减少其生物膜的产量也可达到防治龋齿的目的，相对于控制变形链球菌数量的研究而言，以减少生物膜产量来防治龋齿的研究相对较少。

目前靶向性地直接抑制变形链球菌菌体增殖或生物膜产量的方法不多，临床上大多采用氨硝酸银等化合物，其时效性短、副作用强，而采用具有同样效果的微生物则不然，首先微生物可定植于牙齿表面长期发挥抑制菌体生长或生物膜形成的作用，其次，采用公认无害的乳酸菌类微生物则不必担心副作用的风险，虽然目前已有部分乳酸菌被报道有抑制菌体生长或其生物膜形成的效果，但相关报道数量有限，可应用的微生物资源极其狭隘，因此，筛选具有抑制变形链球菌生长或其生物膜形成的新型乳酸菌菌株依然是当务之急，且是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提供了一种唾液链球菌菌株，还提供了该菌株在制备变形链球菌生长及其生物膜形成抑制剂中的应用。

具体的，一方面，本发明提供了一种唾液链球菌(Streptococcus salivarius)的菌株，其保藏编号为CGMCC NO.13308。

所述唾液链球菌(Streptococcus salivarius)菌株BD 3900，已于2016年11月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.13308。

第二方面，还提供了唾液链球菌CGMCC NO.13308在制备变形链球菌生长抑制剂中的应用。唾液链球菌CGMCC NO.13308对变形链球菌的生长有抑制作用，从而起到防治的龋齿的作用。

第三方面，还提供了唾液链球菌菌株在制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用。唾液链球菌CGMCC NO.13308对变形链球菌生物膜的形成有抑制作用，使得变形链球菌生物膜数量减少，降低了致龋菌在牙齿表面的吸附与积累，从而抑制了龋齿的形成。

其中，所述唾液链球菌菌株经发酵制得的发酵上清液用于制备变形链球菌生物膜形成抑制剂。

优选的，所述发酵上清液的制备方法如下：将CGMCC NO.13308菌株接种于含有蔗糖的M17培养基中，发酵培养后离心即得。

优选的，CGMCC NO.13308菌株的接种量为7x10⁶～3.5x10⁷cfu/mL。接种量过多或过少时，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种的繁殖速度缓慢，使得到的发酵上清液对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。

优选的，所述M17培养基中蔗糖的含量为0.25～5％。蔗糖的含量过高或过低时，均不利于菌种的繁殖和发酵。

优选的，所述发酵的温度为26～42℃，时间为8～24h。发酵温度过高或过低时，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种的代谢缓慢，会导致发酵上清液对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。

优选的，所述离心的速度为6000～10000g，时间为10～20min。在所述优选范围内，菌种能够生成具有抑制变形链球菌生物膜形成活性的发酵上清液。

本发明的有益效果为：本发明首次披露了一种新的唾液链球菌CGMCC NO.13308，唾液链球菌CGMCC NO.13308的菌体具有抑制变形链球菌生长的功能，且其M17发酵液上清可显著降低变形链球菌生物膜的形成量。本发明拓宽了唾液链球菌在龋齿防治方面的应用前景及可产业化资源。

附图说明

图1为实施例2中唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌的抑菌效果。

具体实施方式

为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：

在一个具体的实施方式中，本发明提供了一种唾液链球菌菌株，其保藏编号为CGMCC NO.13308。

CGMCC NO.13308菌株分离自正常人体口腔，该菌株经16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO:1所示。根据其生理生化特性及16S rDNA序列分析的结果，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)鉴定为唾液链球菌(Streptococcus salivarius)菌株。该菌株具有革兰氏染色阳性，细胞形态为圆形，不形成芽孢等微生物学特性。

唾液链球菌菌株具有抑制变形链球菌生长及变形链球菌生物膜形成的作用，因此，本发明还提供了唾液链球菌CGMCC NO.13308在制备变形链球菌生长抑制剂，及制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用。

其中，唾液链球菌CGMCC NO.13308的发酵上清液用于制备变形链球菌生物膜形成抑制剂。制备唾液链球菌CGMCC NO.13308的发酵上清液的方法如下：将唾液链球菌CGMCCNO.13308的菌株接种于含有蔗糖的M17培养基中，发酵培养后离心即得。

上述技术方案，首次披露了唾液链球菌CGMCC NO.13308菌体本身具有抑制变形链球菌生长的功能，而且其M17发酵液上清可显著降低变形链球菌生物膜的形成量，因此，本发明拓宽了唾液链球菌在龋齿防治方面的应用前景及可产业化资源。

优选的，所述唾液链球菌CGMCC NO.13308的接种量为7x10⁶～3.5x10⁷cfu/mL；较佳地为1.4x10⁷～2.8x10⁷cfu/mL，更佳地为2.1x10⁷cfu/mL。接种量过多或过少时，唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种的繁殖速度缓慢，使得到的发酵上清液对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。

优选的，所述M17培养基中蔗糖含量为0.25～5％(w/v)，较佳地为0.5～3％(w/v)，更佳地为1％(w/v)。蔗糖为唾液链球菌CGMCC NO.13308菌种生长提供碳源，蔗糖的含量过高或过低时，均不利于菌种的繁殖和发酵。

优选的，所述发酵温度为26℃～42℃；较佳地为30℃～38℃；更佳地为34℃。发酵时间为8～24h；较佳地为12～20h；更佳地为16h。发酵温度过高或过低时，唾液链球菌CGMCCNO.13308菌种的代谢缓慢，会导致发酵上清液对变形链球菌生物膜形成的抑制活性有所降低。

结合对比例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，唾液链球菌CGMCC NO.13308发酵M17培养基，离心后得到的菌体或发酵液上清对变形链球菌生长或生物膜形成的抑制效果均发生明显地下降。而在优选范围之内，接种量，蔗糖浓度，培养温度以及发酵时间相互影响，使得唾液链球菌CGMCC NO.13308发酵产生的抑菌、抑膜活力更佳。

进一步的，上述步骤中，所述离心的速度为6000～10000g，较佳地为7000～9000g，更佳地为8000g；优选的离心时间为10～20min，较佳地为13～17min，更佳地为15min。在所述优选范围内，菌种能够生成具有抑制变形链球菌生物膜形成活性的发酵上清液。

下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、试剂、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。

实施例1唾液链球菌菌株的筛选，鉴定和保藏

本发明中的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)菌株通过如下途径获得：以无菌吸管取正常人群口腔唾液1mL，用无菌生理盐水系列稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于无菌的M17琼脂培养基(购买自OXOID LTD.，英国)上，37℃厌氧培养24h，选取菌落光滑有明显突起的菌落，转接到含1％(w/v)蔗糖的M17液体培养基中，于37℃厌氧培养24h，将发酵液9000rpm离心10min，分别取沉淀部分(菌体)和上清部分。其中的沉淀部分用无菌蒸馏水洗涤2次后，用接种针挑取少量菌体点种于铺有变形链球菌(CGMCC 1.2499，购自CGMCC)作为指示菌的BHI琼脂平板(购买自OXOID LTD.，英国)上，于37℃厌氧培养24h后观察菌株对变形链球菌的抑制情况。其中的上清部分调节pH至6.80，取100μL上述上清与100μL重悬有变形链球菌(10⁵cfu/mL)的含蔗糖(0.5％w/v)BHI液体培养基加入96微孔板(购自greiner bio～one公司，德国)中，37℃厌氧培养24h，测定生物膜的形成量。通过上述方法对不同菌株抑制变形链球菌生长或生物膜形成量的性能进行测定，筛选出一株既能抑制变形链球菌生长，又可降低其生物膜产量的菌株。

该菌株经16S rRNA基因测序的结果如序列表中SEQ ID NO:1所示。根据其生理生化特性及16S rDNA序列分析的结果，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)鉴定为(Streptococcus salivarius)菌株。该菌株已于2016年11月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.13308。该菌株的微生物学理化特性如表1所示：

表1CGMCC No.13308菌株的理化试验结果

实施例2唾液链球菌CGMCC NO.13308对变形链球菌生长和生物膜形成的抑制效果

1、材料与方法

(1)种子(发酵菌种)的制备：

唾液链球菌CGMCC No.13308种子液的制备：将唾液链球菌CGMCC No.13308的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mLM17液体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于M17液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为7x10⁸cfu/mL。

变形链球菌CGMCC 1.2499种子液的制备：将变形链球菌CGMCC1.2499(购买自CGMCC)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于BHI固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL BHI液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于BHI液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为6x10⁸cfu/mL。

(2)唾液链球菌菌体抑制变形链球菌活性的检测方法：点种法。用接种针挑取少量唾液链球菌菌体点种于铺有变形链球菌作为指示菌的BHI琼脂平板上，置于37℃厌氧培养24h，观察并记录抑菌圈的有无及大小。抑菌圈直径越大，抑菌活性越强。

(3)唾液链球菌M17发酵液上清对变形链球菌的生物膜形成量抑制率的检测方法：唾液链球菌M17发酵液上清调节pH至6.80，取100μL上述上清与100μL重悬有变形链球菌(10⁵cfu/mL)的含蔗糖(0.25％w/v)BHI液体培养基同时加入96微孔板中，37℃厌氧培养24h，用去离子水将参与反应的微孔洗涤3次，去除游离细菌，室温下倒扣微孔板，待其自然干燥后，向微孔内加入100μL 0.5g/L的结晶紫溶液，室温下染色15min后除去染色液，以大量去离子水冲洗去未吸附的结晶紫，自然干燥后每孔加入200μL无水乙醇溶解吸附的结晶紫，使用酶标仪检测600nm下样品组吸光度值OD_样品组，以沸水浴灭活的发酵液上清进行相同操作在600nm下测得相应的对照组吸光度值OD_对照组，用公式“抑制率＝(1-OD_样品组/OD_对照组)×100％”计算对生物膜形成的抑制率。

2、唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌生长和生物膜形成的抑制效果

将唾液链球菌CGMCC No.13308种子以接种量3％(v/v)无菌接种于含蔗糖1％(w/v)的M17液体培养基中，34℃厌氧培养16h得发酵液。

将发酵液8000g离心15min，分别取沉淀部分(菌体)和发酵上清部分。其中沉淀部分用无菌蒸馏水洗涤2次后，以上述点种法测定其对变形链球菌的抑制活性(以抑菌圈直径表示)。其中发酵上清部分按上述方法测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制率。

经测定，唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌的抑菌圈直径为18mm(如图1所示)，其M17发酵液上清对变形链球菌生物膜形成的抑制率为61％。

实施例3唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌生长和生物膜形成的抑制效果

1、材料与方法：同实施例2

将唾液链球菌种子以接种量1％(v/v)无菌接种于含蔗糖5％(w/v)的M17液体培养基中，42℃厌氧培养24h得发酵液。

将发酵液10000g离心10min，分别取沉淀部分(菌体)和发酵上清部分。其中沉淀部分用无菌蒸馏水洗涤2次后，以上述点种法测定其对变形链球菌的抑制活性(以抑菌圈直径表示)。其中发酵上清部分按上述方法测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制率。

经测定，唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌的抑菌圈直径为16mm，其M17发酵液上清对变形链球菌生物膜形成的抑制率为13％。

实施例4唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌生长和生物膜形成的抑制效果

1、材料与方法：同实施例2

将唾液链球菌CGMCC No.13308种子以接种量5％(v/v)无菌接种于含蔗糖0.25％(w/v)的M17液体培养基中，26℃厌氧培养8h得发酵液。

将发酵液6000g离心20min，分别取沉淀部分(菌体)和发酵上清部分。其中沉淀部分用无菌蒸馏水洗涤2次后，以上述点种法测定其对变形链球菌的抑制活性(以抑菌圈直径表示)。其中发酵上清部分按上述方法测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制率。

经测定，唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌的抑菌圈直径为17mm，其M17发酵液上清对变形链球菌生物膜形成的抑制率为15％。

实施例5唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌生长和生物膜形成的抑制效果

1、材料与方法：同实施例2

将唾液链球菌CGMCC No.13308种子以接种量2％(v/v)无菌接种于含蔗糖2％(w/v)的M17液体培养基中，38℃厌氧培养12h得发酵液。

将发酵液9000g离心13min，分别取沉淀部分(菌体)和发酵上清部分。其中沉淀部分用无菌蒸馏水洗涤2次后，以上述点种法测定其对变形链球菌的抑制活性(以抑菌圈直径表示)。其中发酵上清部分按上述方法测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制率。

经测定，唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌的抑菌圈直径为16mm，其M17发酵液上清对变形链球菌生物膜形成的抑制率为30％。

实施例6唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌生长和生物膜形成的抑制效果

1、材料与方法：同实施例2

将唾液链球菌CGMCC No.13308种子以接种量4％(v/v)无菌接种于含蔗糖0.5％(w/v)的M17液体培养基中，30℃厌氧培养20h得发酵液。

将发酵液7000g离心17min，分别取沉淀部分(菌体)和发酵上清部分。其中沉淀部分用无菌蒸馏水洗涤2次后，以上述点种法测定其对变形链球菌的抑制活性(以抑菌圈直径表示)。其中发酵上清部分按上述方法测定其对变形链球菌生物膜形成的抑制率。

经测定，唾液链球菌CGMCC No.13308对变形链球菌的抑菌圈直径为16mm，其M17发酵液上清对变形链球菌生物膜形成的抑制率为25％。

效果实施例1唾液链球菌CGMCC No.13308的溶血性分析

用接种环挑取少量实施例2中无菌蒸馏水洗涤过的M17发酵液离心沉淀部分(菌体)，划线于含5％(v/v)马血的M17琼脂平板上，37℃厌氧培养48h，观察血平板是否有溶血晕圈。

结果显示，唾液链球菌CGMCC No.13308菌株在血平板上无溶血圈出现，这表明摄入唾液链球菌CGMCC No.13308安全可靠，对机体无溶血方面的潜在危害。

效果实施例2唾液链球菌CGMCC No.13308对牙齿的粘附能力分析

1、唾液链球菌CGMCC No.13308的疏水性分析

用pH 6.8 PBS(磷酸盐缓冲液)将实施例2中无菌蒸馏水洗涤过的M17发酵液离心沉淀部分(菌体)重悬起来，使菌悬液在600nm的吸光度OD₆₀₀为0.6，向上述菌悬液(3mL)加入疏水溶剂二甲苯(1mL)，先静置5min，充分振荡120s后，再静置10min，取水相测其OD₆₀₀值。根据以下公式计算对非极性溶剂二甲苯的粘附率。

A₀：菌悬液初始吸光值(此处为0.6)；

A₁：充分静置后的水相吸光值

经测定，唾液链球菌CGMCC No.13308对非极性溶剂二甲苯粘附率高达95.8％，说明该菌株具有极强的表面疏水性。

2、唾液链球菌CGMCC No.13308的静电作用分析

用pH 6.8 PBS(磷酸盐缓冲液)将实施例2中无菌蒸馏水洗涤过的M17发酵液离心沉淀部分(菌体)重悬起来，使菌悬液在600nm的吸光度OD₆₀₀为0.6，向上述菌悬液(3mL)加入乙酸乙酯(路易斯碱溶液)或氯仿(路易斯酸溶液)(1mL)，先静置5min，充分振荡120s后，再静置10min，取水相测其OD₆₀₀值。根据以下公式计算对乙酸乙酯和氯仿的粘附率。

A₀：菌悬液初始吸光值(此处为0.6)；

A₁：充分静置后的水相吸光值

经测定，唾液链球菌CGMCC No.13308对氯仿和乙酸乙酯表现高度的粘附性，具体粘附率分别为88.6％和99.6％，表明菌体表面携带有大量可产生静电作用力的电荷。

1、结论：在口腔中，益生菌通过特异性和非特异性粘附方式与口腔黏膜进行结合，其中非特异性粘附主要与静电、疏水和范德华力相关。实验发现，唾液链球菌CGMCCNo.13308菌体表面具有极强的疏水性，并携带有大量可产生静电作用力的电荷，该特性有助于其粘附于牙齿表面，并进一步与病原菌竞争结合位点以发挥其益生特性。

效果实施例3唾液链球菌CGMCC No.13308的存活性能分析

1、唾液链球菌CGMCC No.13308对抗生素的耐受性分析

用pH 6.8 PBS(磷酸盐缓冲液)将实施例2中无菌蒸馏水洗涤过的M17发酵液离心沉淀部分(菌体)重悬起来，使菌悬液的菌浓为10⁷cfu/mL，取上述菌悬液50μL加入至含有150μL M17液体培养基的微孔板中，再向其中分别加入不同浓度(1、10、20、30、40、50、60μg/mL)的抗生素溶液(螺旋霉素、庆大霉素、氯霉素和青霉素)，置于37℃厌氧培养24h，测定OD₆₀₀吸光度值，根据吸光度值变化情况判断菌体对不同抗生素的耐受性，结果如表2所示。

表2唾液链球菌CGMCC No.13308对抗生素的耐受性

唾液链球菌CGMCC No.13308对氯霉素最敏感，耐受剂量＜1μg/mL，对螺旋霉素和青霉素有一定耐受性，而对庆大霉素的耐受性最强，达40μg/mL，由此可见，唾液链球菌CGMCC No.13308对大部分受试抗生素有一定耐受性。

2、唾液链球菌CGMCC No.13308对溶菌酶的耐受性分析

用pH 6.8 PBS(磷酸盐缓冲液)将实施例2中无菌蒸馏水洗涤过的M17发酵液离心沉淀部分(菌体)重悬起来，将上述菌悬液加入温度为45℃的M17固体培养基中，使培养基中活菌终浓度为10⁶cfu/mL，倒平板，待其冷却凝固后，将无菌牛津杯置于固体培养基表面并向其中分别加入100μL不同浓度(0.1、0.2、0.5、1、3、5mg/mL)的溶菌酶溶液，37℃厌氧培养48h，通过抑菌圈分析菌株对溶菌酶的耐受性，结果如表3所示。

表3唾液链球菌CGMCC No.13308对溶菌酶的耐受性

注：～：阴性，无抑菌圈；+：阳性，有抑菌圈

唾液链球菌CGMCC No.13308最高可耐受3mg/mL的溶菌酶，该数据已远高于正常人群口腔内的溶菌酶浓度(1～57μg/mL)，由此可见，唾液链球菌CGMCC No.13308在正常人群口腔内不会被溶菌酶抑制失活。

3、结论：唾液链球菌CGMCC No.13308对部分抗生素以及一定浓度的溶菌酶具有耐受性，因此，该菌株不会受到口服抗生素和口腔内溶菌酶的影响而失活，具有应用前景。

对比例1

将实施例2中的接种量，蔗糖浓度，培养温度以及发酵时间逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的M17发酵液，将各组所得发酵液参照实施例2所述方法测定对变形链球菌及其生物膜形成的抑制效果，结果如表4所示。

表4不同方法制备的M17发酵液对变形链球菌及其生物膜形成的抑制效果

参照表4所示的结果中可以得出，将所述M17发酵液的制备方法中接种量，蔗糖浓度，培养温度以及发酵时间调整到优选范围之外的时候，唾液链球菌CGMCC No.13308依然可以抑制变形链球菌及其生物膜的形成，但是效果明显下降。

对比例2

参考实施例2所述方法，比较由唾液链球菌CGMCC No.13308、乳酸乳球菌CGMCC1.2472(购买自CGMCC)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.汉森公司提供)制备的M17发酵液对变形链球菌生长及其生物膜形成的抑制效果，具体操作如下：

1、材料与方法

(1)种子(发酵菌种)的制备：

将唾液链球菌CGMCC No.13308、嗜热链球菌ST-BODY-3和乳酸乳球菌CGMCC1.2472的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL M17液体，37℃培养24h后，培养物9000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。

(2)各菌株抑制变形链球菌活性的检测方法：同实施例2。

(3)各菌株M17发酵上液清对变形链球菌生物膜形成量抑制率的检测方法：同实施例2。

2、各菌株对变形链球菌生长和生物膜形成的抑制效果

将各菌株种子以接种量3％(v/v)无菌接种于含蔗糖1％(w/v)的M17液体培养基中，34℃厌氧培养16h得发酵液。

将各组发酵液8000g离心15min，分别取沉淀部分(菌体)和发酵上清部分。其中沉淀部分用无菌蒸馏水洗涤2次后，以上述点种法测定其对的抑制活性(以抑菌圈直径表示)。其中发酵上清部分按上述方法测定其对生物膜形成的抑制率。

各菌株对变形链球菌生长及其生物膜形成的抑制率如表5所示。

表5不同菌株制备的M17发酵液对变形链球菌及其生物膜形成的抑制效果

注：～表示无抑菌圈

由表5可知，其他常规M17发酵菌株不具有发酵M17产生抑制变形链球菌及其生物膜形成的物质的能力，而唾液链球菌CGMCC No.13308可以发酵M17培养基，最后得到抑制变形链球菌生长的菌体细胞，并在代谢产生降低生物膜产量的物质。

以上对本发明所提供的变形链球菌抑制剂及其制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 光明乳业股份有限公司

<120> 一种唾液链球菌菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1459

<212> DNA

<213> 16S rRNA

<400> 1

atacatgcag tagaacgctg aagagaggag cttgctcttc ttggatgagt tgcgaacggg 60

tgagtaacgc gtaggtaacc tgccttgtag cgggggataa ctattggaaa cgatagctaa 120

taccgcataa caatggatga cacatgtcat ttatttgaaa ggggcaattg ctccactaca 180

agatggacct gcgttgtatt agctagtagg tgaggtaacg gctcacctag gcgacgatac 240

atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300

gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat gggggcaacc ctgaccgagc aacgccgcgt 360

gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgtaag tcaagaacga gtgtgagagt 420

ggaaagttca cactgtgacg gtagcttacc agaaagggac ggctaactac gtgccagcag 480

ccgcggtaat acgtaggtcc cgagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag 540

gcggtttgat aagtctgaag ttaaaggctg tggctcaacc atagttcgct ttggaaactg 600

tcaaacttga gtgcagaagg ggagagtgga attccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat 660

atatggagga acaccggtgg cgaaagcggc tctctggtct gtaactgacg ctgaggctcg 720

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tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ctattgttag 1080

ttgccatcat tcagttgggc actctagcga gactgccggt aataaaccgg aggaaggtgg 1140

ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggttg 1200

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attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg 1320

ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta 1380

acacccgaag tcggtgaggt aaccttttgg agccagccgc ctaaggtggg atagatgatt 1440

ggggtgaagt cgtaacaag 1459

Claims

1.一种唾液链球菌菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.13308。

2.权利要求1所述的唾液链球菌菌株在制备变形链球菌生长抑制剂中的应用。

3.权利要求1所述的唾液链球菌菌株在制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的唾液链球菌菌株在制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用，其特征在于，唾液链球菌菌株经发酵制得的发酵上清液用于制备变形链球菌生物膜形成抑制剂。

5.根据权利要求4所述的唾液链球菌菌株在制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用，其特征在于，所述发酵上清液的制备方法如下：将CGMCC NO.13308菌株接种于含有蔗糖的M17培养基中，发酵培养后离心即得。

6.根据权利要求5所述的唾液链球菌菌株在制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用，其特征在于，所述CGMCC NO.13308菌株的接种量为7x10⁶～3.5x10⁷cfu/mL。

7.根据权利要求5所述的唾液链球菌菌株在制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用，其特征在于，所述M17培养基中蔗糖的含量为0.25～5％。

8.根据权利要求5所述的唾液链球菌菌株在制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用，其特征在于，所述发酵的温度为26～42℃，时间为8～24h。

9.根据权利要求5所述的唾液链球菌菌株在制备变形链球菌生物膜形成抑制剂中的应用，其特征在于，所述离心的速度为6000～10000g，时间为10～20min。