CN103275893A - 长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂及其制备方法 Download PDF

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梁金钟
肖文娟
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Abstract

本发明涉及一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂及其制备方法,长双歧杆菌长亚种,命名BAMA-B05/BAu-B1024,保藏编号CGMCC No.7290。一种动物双歧杆菌乳亚种,命名BAMA-B06/BAu-B0111,保藏编号CGMCC No.7289。一种巴马长寿菌复合菌剂,由长双歧杆菌长亚种BAMA-B05/BAu-B1024和动物双歧杆菌乳亚种BAMA-B06/BAu-B0111复合而成,两种菌体的数量之比为1∶1。本发明的菌种不易死亡,生长周期短,繁殖速度快,容易培养和保存。本发明可改善肠道微生态平衡、增强宿主免疫力,活化免疫细胞,缓解和治疗便秘。

Description

长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂及其制备方法。
背景技术
巴马是我国广西壮族自治区的一个瑶族自治县,位于广西西北部,这里居住着瑶、壮、汉等12个民族,总人口24万多人,与百色、田阳、田东、平果等市县毗邻。巴马是百岁老人分布率最高的地区,被誉为“世界长寿之乡”。1991年11月1日在日本东京召开的国际自然医学会第13次会议上,被命名为世界第五个长寿之乡,2003年11月,国际自然医学会授予巴马“世界长寿之乡”证书。据第二次到第五次全国人口普查,巴马百岁以上寿星占人口的比例之高都居世界五个长寿区之首。
为了揭开巴马长寿之谜,国内专家对此开展了长期的研究。研究发现,有一个共同的特征,这些老人肠道内有益菌的数量是一般人体内有益菌数量的100至1000倍,这些有益菌在人体肠道内与人共生,形成一道益生菌保护屏障-益生菌菌膜,将排泄物和消化道隔离开,抑制体内其他有害菌、腐败菌的滋生,不会形成毒素。
益生菌菌膜是多种有益菌组成的生物平衡结构,当饮食不规律,经常吸烟、饮酒、运动减少、情绪变化、机体老化,特别是过量使用抗生素之后,益生菌菌膜就会受损,腹泻、便秘等各种消化道疾病的产生。益生菌菌膜破坏后,有害菌、腐败菌就会趁机滋生,产生毒素而损伤肝脏等脏器。体内毒素堆积,使容颜衰老,皮肤晦暗。可以说,没有肠道益生菌菌膜,人的健康就会严重受损。健康人体内的有益菌是病人的50倍以上,要想身体健康长寿,维护肠道微生态菌群的平衡,保持完好的益生菌菌膜是一种重要的方法。
双歧杆菌是人类肠道正常菌群中一类重要的微生物,它们对人类健康的有益作用已得到很多研究的证明。巴马地区长寿之谜除了与当地的自然环境、气候、生活习惯、饮食结构等因素有关外,经研究发现与长寿老人肠道中的益生菌菌群的关系密切。我们从当地老人肠道中分离到两株双歧杆菌,目的就是将这两种菌进行大量人工培养,然后再将这种菌用于其他人群,使其在其他人肠道内定植,并形成益生菌菌膜,达到促进人体健康的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂及其制备方法。
为了实现本发明的目的,本发明采用的技术方案如下:本发明中的一种长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum),从广西巴马百岁老人粪便中采集,命名BAMA-B05/BAu-B1024,于2013年03月08日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号CGMCC No.7290。另外一种动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis),从广西巴马百岁老人粪便中采集,命名BAMA-B06/BAU-B0111,于2013年03月08日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号CGMCC No.7289。
本发明还具有如下特征:
1、一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂,由长双歧杆菌长亚种BAMA-B05/BAu-B1024和动物双歧杆菌乳亚种BAMA-B06/BAu-B0111复合而成,两种菌体的数量之比为1∶1。
2、一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂的其制备方法,培养基配方为,按质量百分数:低聚异麦芽糖1.0-10.0%、酵母膏0.5-5.0%、大豆蛋白胨0.5-5.0%、胰蛋白胨0.5-5.0%、乳糖1.0-10.0%和半胱氨酸0.01-0.50%,pH4.5-6.5,121℃灭菌20min,冷却后两种菌种一起接种;培养温度为30-38℃,培养时间为12-48h,培养结束后,5000rpm离心,然后加入冻干保护剂,混合均匀后,进行冷冻干燥,制得冻干菌粉,冻干菌粉的活菌数≥1.0×1010cfu/g。
3、培养基配方优选为:按质量百分数,低聚异麦芽糖2.0-3.0%、酵母膏1.0-1.5%、大豆蛋白胨1.0%、胰蛋白胨1.5%、乳糖2.0%和半胱氨酸0.05%,pH6.5,121℃灭菌20min。
以上所述的一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂的其制备方法,或者两种菌种单独接种,制得冻干菌粉后混合均匀。
本发明具有如下特点:
1、复合菌剂中主要含有长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longumBAMA-B05/BAu-B1024)和动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBAMA-B06/BAu-B0111),这两种菌可以协同共生,并且在人体肠道内生长繁殖与人共生,形成一道益生菌保护屏障-益生菌菌膜,抑制肠道内其他有害菌、腐败菌的滋生,对人体健康有益。
2、长双歧杆菌长亚种和动物双歧杆菌乳亚种的在肠道内大量生长繁殖,可改善肠道微生态平衡。益生菌的生长代谢还可产生B族维生素、维生素K及有益的微生物酶类。
3、此两种益生菌的生长繁殖可产生抗菌物质,增强宿主免疫力,活化免疫细胞,预防肠癌的发生及肿瘤的生长。
4、缓解和治疗便秘。
5、长双歧杆菌长亚种和动物双歧杆菌乳亚种抵抗不良环境的能力强,不易死亡,生长周期短,繁殖速度快,容易培养和保存。
具体实施方式
实施例1
本发明中所涉及的百分比均为重量百分比。
1.从广西巴马百岁老人粪便中采集样品,将采样工具及各种采样容器进行灭菌,从多人粪便中采集样品。
2.将采集的样品进行系列稀释:将采集的某种样品在无菌条件下混合均匀,称取10克样品,溶解于100mL无菌水中,其中装有100粒玻璃珠,用力摇动10分钟,静止一分钟,用1mL无菌吸管吸取1mL上清液,移入9mL无菌水试管中,彻底摇匀,然后再从这一稀释的样品中取出1mL样品再移入9mL无菌试管中,彻底摇匀,如此依次进行稀释,直至稀释到浓度为10-5
3.分离方法:用Hungate厌氧滚管技术分离,从上述稀释的样品中用0.1mL无菌吸管分别取出0.1mL样品,移入融化的BCP琼脂培养基中,立即在低温下滚动试管使其凝固,每个稀释度做3个重复。BCP培养基配方(g/100mL):葡萄糖0.5g、乳糖0.5g、酵母浸粉0.5g、琼脂1.5~2.0g、溴甲酚紫(5g/100mL)1.0mL、自来水100mL,pH6.8~7.0。
4.培养:将滚管置于37℃培养箱中培养48小时,观察挑菌。
5.挑菌:将黄色菌落或培养基周围变为黄色的菌落挑入厌氧液体试管中,挑取200个菌落接入200支液体试管中,置于37℃培养箱中培养48小时。然后再进行二次厌氧分离纯化,最后得到纯培养。
6.经过初筛复筛,反复进行3次,从其中筛选出2株性能最佳者,最后得到优良菌种BAMA-B05/BAu-B1024和BAMA-B06/BAu-B0111。
7.根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版,进行形态学、生理生化和16srDNA菌种鉴定。初步确定菌株BAMA-B05/BAu-B1024为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longumsubsp.longum),菌株BAMA-B06/BAu-B0111为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)。
8.然后将菌株BAMA-B05/BAu-B1024和菌株BAMA-B06/BAu-B0111送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行最后鉴定,鉴定结果如下表所示:
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定结果
菌株BAMA-B05/BAu-B1024具有如下基本特征:
项目 特性 项目 特性
革兰氏染色 阳性 碳水化合物产酸(续)
细胞形状 杆状、多形态 核糖 +
形成芽孢 - 海藻糖 +
接触酶 - 木糖 +
氧化酶 - 麦芽糖 +
空气中生长 - 乳糖 +
厌氧生长 + 棉籽糖 +
碳水化合物产酸 山梨醇 -
甘露糖 - 蜜二糖 +
松三糖 + 半乳糖 +
果糖 + 甘露醇 -
水杨苷 - L-阿拉伯糖 +
菊糖 - 葡萄糖酸钠 -
纤维二塘 - 蔗糖 +
淀粉 -
菌株BAMA-B06/BAu-B0111具有如下基本特征:
项目 特性 项目 特性
革兰氏染色 阳性 碳水化合物产酸(续)
细胞形状 杆状、多形态 核糖 +
形成芽孢 - 海藻糖 -
接触酶 - 木糖 +
氧化酶 - 麦芽糖 +
空气中生长 - 乳糖 +
厌氧生长 + 棉籽糖 +
碳水化合物产酸 山梨醇 -
甘露糖 + 蜜二糖 +
松三糖 - 半乳糖 +
果糖 + 甘露醇 -
水杨苷 + L-阿拉伯糖 -
菊糖 - 葡萄糖酸钠 -
纤维二塘 - 蔗糖 +
淀粉 +
通过形态学、生理生化试验和16srDNA菌种鉴定,最后确定菌株BAMA-B05/BAu-B1024为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum),菌株BAMA-B06/BAu-B0111为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)。两株菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,登记入册编号分别为:CGMCC N0.7289(动物双歧杆菌乳亚种)和CGMCC N0.7290(长双歧杆菌长亚种)。
9.培养方法培养基配方:低聚异麦芽糖1.0-10.0%、酵母膏0.5-5.0%、大豆蛋白胨0.5-5.0%、胰蛋白胨0.5-5.0%、乳糖1.0-10.0%和半胱氨酸0.01-0.50%,pH4.5-6.5,121℃灭菌20min,冷却后接种。培养温度为30-38℃,培养时间为12-48h。培养结束后,5000rpm离心,然后加入冻干保护剂,混合均匀后,进行冷冻干燥,制得冻干菌粉,冻干菌粉的活菌数≥1.0×1010cfu/g。
实施例2
一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂的其制备方法,
长双歧杆菌长亚种的制备方法:培养基配方:低聚异麦芽糖2.0%、酵母膏1.0%、大豆蛋白胨1.0%、胰蛋白胨1.0%、乳糖1.0%和半胱氨酸0.05%,pH6.5,121℃灭菌20min。
冷却至37℃,接入长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)BAMA-B05/BAu-B1024菌种。培养温度为37℃,培养时间为24h。
培养结束后,5000rpm离心,然后加入冻干保护剂,混合均匀后,进行冷冻干燥,制得冻干菌粉,冻干菌粉的活菌数≥1.0×1010cfu/g。
动物双歧杆菌乳亚种的制备方法:培养基配方:低聚异麦芽糖2.0%、酵母膏1.0%、大豆蛋白胨1.0%、胰蛋白胨1.0%、乳糖1.0%和半胱氨酸0.05%,pH6.5,121℃灭菌20min。
冷却至37℃,接入动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BAMA-B06/BAu-B0111菌种。培养温度为37℃,培养时间为24h。
培养结束后,5000rpm离心,然后加入冻干保护剂,混合均匀后,进行冷冻干燥,制得冻干菌粉,冻干菌粉的活菌数≥1.0×1010cfu/g。
将上述制得的两种冻干菌粉后混合均匀,制得一种巴马长寿菌复合菌剂。
实施例3
一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂的其制备方法,培养基配方:低聚异麦芽糖3.0%、酵母膏1.5%、大豆蛋白胨1.0%、胰蛋白胨1.5%、乳糖2.0%和半胱氨酸0.05%,pH6.5,121℃灭菌20min。
冷却至37℃,接入长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)BAMA-B05/BAu-B1024和动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BAMA-B06/BAu-B0111菌种。培养温度为37℃,培养时间为24h。培养结束后,5000rpm离心,然后加入冻干保护剂,混合均匀后,进行冷冻干燥,制得冻干菌粉,冻干菌粉的活菌数≥1.0×1010cfu/g。
实施例4
一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂的其制备方法,培养基配方为:按质量百分数,低聚异麦芽糖10.0%、酵母膏5.0%、大豆蛋白胨5.0%、胰蛋白胨5.0%、乳糖10.0%和半胱氨酸0.50%,pH6.5,121℃灭菌20min,冷却后两种菌种一起接种;培养温度为30-38℃,培养时间为12-48h,培养结束后,5000rpm离心,然后加入冻干保护剂,混合均匀后,进行冷冻干燥,制得冻干菌粉,冻干菌粉的活菌数≥1.0×1010cfu/g。

Claims (6)

1.一种长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum),从广西巴马百岁老人粪便中采集,命名BAMA-B05/BAu-B1024,保藏编号CGMCCNo.7290。
2.一种动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis),从广西巴马百岁老人粪便中采集,命名BAMA-B06/BAu-B0111,保藏编号CGMCCNo.7289。
3.一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂,其特征在于:由长双歧杆菌长亚种BAMA-B05/BAu-B1024和动物双歧杆菌乳亚种BAMA-B06/BAu-B0111复合而成,两种菌体的数量之比为1∶1。
4.根据权利要求3所述的一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂的其制备方法,其特征在于:培养基配方为:按质量百分数,低聚异麦芽糖1.0-10.0%、酵母膏0.5-5.0%、大豆蛋白胨0.5-5.0%、胰蛋白胨0.5-5.0%、乳糖1.0-10.0%和半胱氨酸0.01-0.50%,pH4.5-6.5,121℃灭菌20min,冷却后两种菌种一起接种;培养温度为30-38℃,培养时间为12-48h,培养结束后,5000rpm离心,然后加入冻干保护剂,混合均匀后,进行冷冻干燥,制得冻干菌粉,冻干菌粉的活菌数≥1.0×1010cfu/g。
5.根据权利要求4所述的一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂的其制备方法,其特征在于:培养基配方优选为:按质量百分数,低聚异麦芽糖2.0-3.0%、酵母膏1.0-1.5%、大豆蛋白胨1.0%、胰蛋白胨1.5%、乳糖2.0%和半胱氨酸0.05%,pH6.5,121℃灭菌20min。
6.根据权利要求4或5所述的一种长双歧杆菌和动物双歧杆菌的复合菌剂的其制备方法,其特征在于:或者两种菌种单独接种,制得冻干菌粉后混合均匀。
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