CN103409334A - 抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，寄存于中国普通微生物保藏管理中心，且该乳酸杆菌系选自由一保藏号为CGMCC No.6244之嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、一保藏号为CGMCC No.6245之乳酸乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis）及一保藏号为CGMCC No.6246之植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）所组成之群组。本发明可以吸附于宿主阴道细胞，长时间停留于宿主体内以产生较佳之抑菌能力，且能够分泌大量的过氧化氢以产生对阴道病原菌具有毒性之氧化物，对霉菌性阴道炎病原菌及细菌性阴道炎病原菌具有较佳之抑菌效果，可广泛应用于商用治疗或预防阴道炎病原菌感染之产品制备，如保健食品、医用制剂等。本发明可以单独或混合其他所需成分加工制成各种产品形式，以有效控制阴道病原菌之感染及其引发之相关疾病。
Description
技术领域
本发明系涉及一种乳酸菌之组合，特别是一种具有抑制阴道病原菌能力之乳酸杆菌组合及其用途。
背景技术
根据台湾地区妇产科的统计，约有75%的女性于一生中至少有一次阴道感染之机会，加上国内属亚热带气候国家更容易引起细菌及霉菌的滋生，且依据不同的病原菌会产生不同症状的阴道感染现象。目前常见造成女性阴道感染之原因系如下所述：
1、霉菌感染
霉菌感染较常见的病原菌系为白色念珠菌(Candida albicans)，且该白色念珠菌系喜爱生长于温热潮湿之环境，因此，当女性阴部清洁不干净或者穿着紧身不易透气之衣裤而造成阴部闷湿等情况时，系容易引起白色念珠菌的滋生，而造成阴部搔痒、灼热、外阴部红肿、小便疼痛…等症状，且于个人抵抗力不足(例如：睡眠不足、月经前后、怀孕期间…等)时更易造成反复性之感染。目前用于治疗之方式系采取口服用药(例如：Fluconazole…等)或抗霉菌阴道塞剂(例如：Fenticonazole nitrate…等)。然而，该些治疗方法系容易造成不良之副作用（例如：恶心、晕眩…等），尤其对抵抗力不足之患者(例如：怀孕妇女…等)更具有副作用加剧之风险。
2、细菌感染
细菌感染较常见之病原菌系为混合型态的病原菌(例如：阴道伽氏杆菌(Gardnerella vaginalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及链球菌属(Streptococcus)…等)，且该混合型态之病原菌系喜爱生长于偏碱性之环境(pH>4.5)，因此，过于频繁的性交或太常冲洗阴道均容易导致阴道pH值的上升而造成细菌滋生，进而产生大量灰白色或黄色之阴道分泌物而引起类 似鱼腥味的臭味。目前用于治疗之方法系采取口服用药(例如：盘尼西林(penicillin)、四环霉素(tetracycline)…等)。然而，该些口服用药系容易引起不良之副作用(例如：过敏、恶心、头晕…等)，甚至造成女性阴道内原有益生菌减少而破坏菌相之平衡。
3、滴虫感染
滴虫感染大多系由性行为传染或者于温暖潮湿的环境下(例如：三温暖、游泳池…等)间接传染，该滴虫引起的阴道感染系容易产生严重搔痒、阴部红肿、…等类似霉菌感染之症状，甚至产生脓稠之分泌物而具有腥臭味。目前用于治疗之方法系服用抗生素(例如：Metronidazole…等)，然而，抗生素之使用系容易引起恶心、腹部不适、排尿困难…等的不良副作用。
由上述得知，目前用于治疗阴道炎之方法多采取口服用药，且该些口服用药系多为抗生素或类固醇等药品，因此，于该些药物杀死病原菌的同时亦会伤害体内之益生菌(例如：乳酸杆菌…等)，使得药物治疗初期患者阴道环境系呈现无菌之状态，而逐渐产生益生菌与病原菌相互竞争生长环境之情况。然而，体内益生菌的生长往往较病原菌缓慢，因此，系容易于药物治疗的同时造成宿主免疫力的下降，进而发生重复感染的情形而必须反复进行抗生素或类固醇药物的治疗，甚至使病原菌产生抗药性而损害宿主的免疫系统。
近年来陆续有利用益生菌治疗阴道感染的相关报导，经研究发现特定的乳酸杆菌属(Lactobacillus)菌株系具有抑制阴道感染之病原菌生长的功能，如台湾专利第200806303号专利案系指出习知用以抑制阴道病原菌感染之乳酸杆菌包含嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、比菲德氏菌(Lactobacillus bifidus)、短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)…等，习知乳酸杆菌系分泌各种代谢产物，如乳酸、过氧化氢、细菌素或抗菌蛋白(antimicrobial peptide)，维持阴道pH值之恒定(pH3.8~4.2)以抑制阴道病原菌的孳生；或者系直接附着于阴道细胞竞争阴道病原菌的生长，以维持阴道内之菌相平衡。
然而，上述习知乳酸杆菌仅能够针对特定病原菌产生抑菌作用，举例说明之该比菲德氏菌只能抑制白色念珠菌却无法改善阴道细菌感染的问题，因此，抑菌效果较差，特别系当患者交叉感染多种阴道病原菌时，该 习知乳酸杆菌之抑菌效果实为有限，无法广泛地应用于多种阴道病原菌的预防或治疗。
再者，该习知乳酸杆菌虽可分泌多种代谢产物，却系以乳酸作为主要的抑菌手段，然而，该乳酸系属弱酸，其杀菌力较低，特别系当患者严重感染时，习知乳酸杆菌往往无法有效控制阴道病原菌的蔓延；又，该乳酸杆菌对于阴道细胞的吸附能力不足而无法长时间停留于阴道环境内，使得该习知乳酸杆菌的抑菌能力无法有效发挥；因此可知，习知乳酸杆菌的抑菌效果有限，仅能针对特定病原菌发挥作用，且其抑菌能力较差，无法有效抑制病原菌之生长。
有鉴于近年来阴道炎对女性所造成之高威胁性及高感染率，以及不同种类之病原菌可能产生交叉感染之问题，应开发具有同时抑制不同种类病原菌之新颖性菌株，以有效提升临床医疗上对阴道炎之病原菌的预防及治疗效果。
发明内容
本发明之主要目的乃改良上述缺点，提供一种抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，其系能够同时抑制不同种类之阴道炎病原菌的生长。
本发明之次一目的系提供一种抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，系对于阴道病源菌具有良好的杀菌能力。
本发明之再一目的系提供一种抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，系对于宿主阴道细胞具有良好的吸附能力，以延长该乳酸杆菌的杀菌能力。
本发明之又一目的系提供一种抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，系能够将一抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌用于制备抑制阴道炎病原菌之食品或药物组成物。
为达到前述发明目的，本发明所述抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，系寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，且该乳酸杆菌系选自由一保藏号为CGMCCNo.6244之嗜酸乳杆菌、一保藏号为CGMCC No.6245之德式乳杆菌乳亚种及一保藏号为CGMCC No.6246之植物乳杆菌所组成之群组；以及，一种乳酸杆菌之用途，系将选自由上述乳酸杆菌所组成之群组，用以制备抑制阴道炎病原菌感染之食品组成物或药物组成物。
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，保藏号为CGMCC No.6244，保藏日期：2012年6月20日)的DNA序列表如下：
cgtggggaac ctgccccata gtctaggata ccacttggaa acaggtgcta 50
ataccggata ataaagcaga tcgcatgatc agcttataaa aggcggcgta 100
agctgtcgct atgggatggc cccgcggtgc attagctagt tggtaaggta 150
acggcttacc aaggcaatga tgcatagccg agttgagaga ctgaacggcc 200
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg 250
aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa 300
gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt 350
agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa ccagaaagtc acggctaact 400
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt 450
attgggcgta aagcgagcgc aggcggaaga ataagtctga tgtgaaagcc 500
ctcggcttaa ccgaggaatt gcatcggaaa ctgtttttct tgagtgcaga 550
agaggagagt ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga 600
agaacaccag tggcgaaggc ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc 650
tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg 700
taaacgatga gtgctaagtg ttgggaggtt tccgcctctc agtgctgcag 750
cgtattcacc gcggcgttct gatccgcgat tactagcgat tccagcttcg 800
tgcagtcgag ttgcagactg cagtccgaac tgagaacagc tttcagagat 850
tcgcttgcct tcgcaggctc gcttctcgtt gtactgccca ttgtagcacg 900
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg acttgacgtc atccccacct 950
tcctccggtt tgtcaccggc agtctcatta gagtgcccaa cttaatgctg 1000
gcaactaata ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 1050
acgacacgag ctgacgacag ccatgcacca cctgtcttag cgtccccgaa 1100
gggaactcct aatctcttag gatggcacta gatgtcaaga cctggtaagg 1150
ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 1200
ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg 1250
agtgcttaat gcgttagctg cagcactgag aggcggaaac ctcccaacac 1300
ttagcactca tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc 1350
gctacccatg ctttcgagcc tcagcgtcag ttgcagacca gagagccgcc 1400
ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac gcattccacc gctacacatg 1450
gagttccact ctcctcttct gcactcaaga aaaacagttt ccgatgcaat 1500
所述德式乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis，保藏号CGMCC No.6245，保藏日期：2012年6月20日)的DNA序列表如下：
ttcaaagatc ccttcggggt gatttgttgg atgctagcgg cggatgggtg 50
agtaacacgt gggcaatctg ccctaaagac tgggatacca cttggaaaca 100
ggtgctaata ccggataaca acatgaatcg catgattcaa gtttgaaagg 150
cggcgcaagc tgtcacttta ggatgagccc gcggcgcatt agctagttgg 200
tggggtaaag gcctaccaag gcaatgatgc gtagccgagt tgagagactg 250
atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 300
agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt 350
gagtgaagaa ggtcttcgga tcgtaaagct ctgttgttgg tgaagaagga 400
tagaggcagt aactggtctt tatttgacgg taatcaacca gaaagtcacg 450
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 500
cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggaatgata agtctgatgt 550
gaaagcccac ggctcaaccg tggaactgca tcggaaactg tcattcttga 600
gtgcagaaga ggagagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat 650
atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tctctggtct gcaactgacg 700
ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc 750
catgccgtaa acgatgagcg ctaggtgttg gggactttcc ggtcctcagt 800
gccgcagcaa acgcattaag cgctccgcct ggggagtacg accgcaaggt 850
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900
tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctgcgc 950
tacacctaga gataggtggt tcccttcggg gacgcagaga caggtggtgc 1000
atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1050
agcgcaaccc ttgtctttag ttgccatcat taagttgggc actctaaaga 1100
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1150
gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatgggca gtacaacgag 1200
aagcgaaccc gcgagggtaa gcggatctct taaagctgct ctcagttcgg 1250
actgcaggct gcaactcgcc tgcacgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1300
gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1350
tcacaccatg gaagtctgca atgcccaaag tcggtgggat aacctttata 1400
ggagtcagcc gcctaaggca gggcagatga ctggggtgaa gtcgtaacaa 1450
ggtagccgta ggagaa 1466
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，保藏号为CGMCC No.6246，，保藏日期：2012年6月20日)的DNA序列表如下：
cgtggggaac ctgccccata gtctaggata ccacttggaa acaggtgcta 50
ataccggata ataaagcaga tcgcatgatc agcttataaa aggcggcgta 100
agctgtcgct atgggatggc cccgcggtgc attagctagt tggtaaggta 150
acggcttacc aaggcaatga tgcatagccg agttgagaga ctgaacggcc 200
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg 250
aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa 300
gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt 350
agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa ccagaaagtc acggctaact 400
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt 450
attgggcgta aagcgagcgc aggcggaaga ataagtctga tgtgaaagcc 500
ctcggcttaa ccgaggaatt gcatcggaaa ctgtttttct tgagtgcaga 550
agaggagagt ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga 600
agaacaccag tggcgaaggc ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc 650
tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg 700
taaacgatga gtgctaagtg ttgggaggtt tccgcctctc agtgctgcag 750
cgtattcacc gcggcgttct gatccgcgat tactagcgat tccagcttcg 800
tgcagtcgag ttgcagactg cagtccgaac tgagaacagc tttcagagat 850
tcgcttgcct tcgcaggctc gcttctcgtt gtactgccca ttgtagcacg 900
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg acttgacgtc atccccacct 950
tcctccggtt tgtcaccggc agtctcatta gagtgcccaa cttaatgctg 1000
gcaactaata ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 1050
acgacacgag ctgacgacag ccatgcacca cctgtcttag cgtccccgaa 1100
gggaactcct aatctcttag gatggcacta gatgtcaaga cctggtaagg 1150
ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 1200
ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg 1250
agtgcttaat gcgttagctg cagcactgag aggcggaaac ctcccaacac 1300
ttagcactca tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc 1350
gctacccatg ctttcgagcc tcagcgtcag ttgcagacca gagagccgcc 1400
ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac gcattccacc gctacacatg 1450
gagttccact ctcctcttct gcactcaaga aaaacagttt ccgatgcaat1500
附图说明
图1为本发明乳酸杆菌之处理流程图，图1中，S1表示培养步骤、S2表示鉴定步骤、S3表示保存步骤
图2为本发明LA25与LDL114及LP115的协同抑制白色念珠菌情形之一。
图3为本发明LA25与LDL114及LP115的协同抑制白色念珠菌情形之二。
图4为本发明LA25与LDL114及LP115的协同抑制伽氏阴道杆菌情形。
具体实施方式
为让本发明之上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本发明之
较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下：
本发明一种抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，系自一乳制品中选殖得一嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、一乳酸乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)及一植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；该些乳酸杆菌系具有霉菌性阴道炎病原菌之杀菌能力、细菌性阴道炎病原菌之杀菌能力、分泌过氧化氢之能力及宿主阴道细胞之吸附特性，且相较于习知乳酸杆菌具有较佳之抑菌能力及抑菌效果，可应用于预防或治疗阴道炎之商品制备。
请参照第1图所示，本发明之乳酸菌系经由以下各方式处理而获得， 系包含一培养步骤S1、一鉴定步骤S2及一保存步骤S3。其中，该嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌及植物乳杆菌的培养、鉴定及保存步骤均相同，故仅叙述其一筛选获得该嗜酸乳杆菌之详细流程，其余不再加以赘述。
该培养步骤S1系分离乳制品中所含有之乳酸菌进行培养。本发明系取样自一乳制品(例如：干酪…等)，置于一培养液进行增殖培养(enrichment culture)，待适当培养时间后将该培养液进行序列稀释，另接种至一培养基以挑选可生长之菌株。本实施例之增殖培养系将该乳制品以1:50之体积比例接种于一液态MRS培养基(MRS Broth)，以37℃培养20小时而获得一增殖培养菌液，再以序列稀释该增殖培养菌液，将稀释后之增殖培养菌液以涂抹法接种一固态MRS培养基(MRS Agar)，挑选可生长之菌株。该液态MRS培养基与固态MRS培养基之配方如第1及2表所示。
第1表:液态MRS培养基(MRS Broth)配方(1公升):
| 配方成分 | 含量(公克) |
| 蛋白胨(Peptone) | 10 |
| 牛肉抽出物(Beef Extract) | 10 |
| 酵母菌萃取物(Yeast Extract) | 5 |
| 葡萄糖(Dextrose) | 20 |
| 柠檬酸铵(Ammonium Citrate) | 5 |
| 硫酸镁(MgSO4) | 0.1 |
| 硫酸锰(MnSO4) | 0.05 |
| 磷酸氢二钾(Dipotassium Phosphate) | 2 |
| 醋酸钠(Sodium Acetate) | 5 |
| 吐温80(Tween 80) | 1 |
第2表:固态MRS培养基(MRS Agar)配方(1公升):
| 配方成分 | 含量(公克) |
| 蛋白胨(Peptone) | 10 |
| 牛肉抽出物(Beef Extract) | 10 |
| 酵母菌萃取物(Yeast Extract) | 5 |
[0125]
| 葡萄糖(Dextrose) | 20 |
| 柠檬酸铵(Ammonium Citrate) | 5 |
| 硫酸镁(MgSO4) | 0.1 |
| 硫酸锰(MnSO4) | 0.05 |
| 磷酸氢二钾(Dipotassium Phosphate) | 2 |
| 醋酸钠(Sodium Acetate) | 5 |
| 吐温80(Tween 80) | 1 |
| 琼脂(Agar) | 15 |
该鉴定步骤S2系依照该乳酸菌之物理型态、生理特性或分子特征等判断其菌种分类。本实施例将该乳酸菌进行革兰氏染色、触酶反应及16SrDNA之分子鉴定，由该乳酸菌之染色图(结果为革兰氏阳性菌)、16S rDNA部分序列(如SEQ ID No:1所示)﹝于美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology；NCBI)之序列比对数据库(BLAST)所得相似度达99%之菌种为Lactobacillus acidophilus﹞及触酶反应试验(触酶反应阴性)等鉴定结果确定本发明之乳酸菌系为一嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，保藏号为CGMCC No.6244，命名为嗜酸乳杆菌LA25。
该保存步骤S3系使该嗜酸乳杆菌可以稳定于低温环境下长久存放，以便后续使用。将本发明之嗜酸乳杆菌接种至该固态MRS培养基，以37℃培养48小时后挑选单一菌落转殖至MRS培养液(如第1表之配方所示)，以进行冷冻保存。该MRS培养液中较佳系包含30%之抗冻剂(例如：甘油)，暂存于-80℃之恒温保存室，以待后续使用。
此外，依照上述相同之技术手段另外挑选可生长之菌株，且以上述鉴定步骤S2进行菌种分类之判断，由该乳酸菌之染色图等鉴定确定该二乳酸菌分别为一乳酸乳杆菌，保藏号CGMCC No.6245，命名为乳酸乳杆菌LDL114，以及一植物乳杆菌，保藏号CGMCC No.6246，命名为植物乳杆菌LP115。
为证实本发明之乳酸杆菌系具有较佳之抑菌能力及抑菌效果，系分别测试该嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌及其复合物分泌过氧化氢及 细胞吸附之能力，以及该嗜酸乳杆菌相较于习知洛德乳杆菌(Lactobacillus reuteri)及鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)对该些病原菌之抑制性，以观察其对阴道炎病原菌的杀菌效果。
部分乳酸杆菌系能够分泌乳酸、过氧化氢、细菌素等物质达到对抗病原菌之功效，其中，过氧化氢系能够与卤素离子(如氯离子)反应生成一种对抗病原菌之毒性氧化物(如氢氧化氯)，而提高乳酸杆菌对抗病原菌之能力。因此，为了解本发明之乳酸杆菌分泌过氧化氢之能力，本实施例系将本发明之乳酸杆菌及习知洛德乳杆菌及鼠李糖乳杆菌分别培养于该液态MRS培养基，待适当时间生长后，以检测过氧化氢之商用套组(
H2O2-560TM,DXIS)进行过氧化氢之检测，其中，该适当时间系指本发明之乳酸杆菌生长菌数达109时，将菌体各自离心取得上清液，以针对该些上清液进行过氧化氢浓度之测试，本发明之乳酸杆菌分泌过氧化氢之情形系纪录于第3表：
第3表:本发明乳酸杆菌之过氧化氢分泌能力。
| 菌株 | 过氧化氢(微莫耳浓度μM) |
| 嗜酸乳杆菌LA25 | 58.06±2.21 |
| 乳酸乳杆菌LDL114 | 6.60±3.34 |
| 植物乳杆菌LP115 | 44.92±3.34 |
| LA25+LDL114+LP115 | 48.95±8.87 |
| 洛德乳杆菌 | 7.03±3.34 |
| 鼠李糖乳酸杆菌 | ─* |
| 洛德乳杆菌+鼠李糖乳杆菌 | 7.03±3.34 |
由上述结果得知，本发明之乳酸杆菌相较于其他习知乳酸杆菌系具有较佳过氧化氢之分泌能力，其中，又以嗜酸乳杆菌及植物乳杆菌所呈现之过氧化氢分泌量明显高于该洛德乳杆菌之7.03μM，甚至该鼠李糖乳杆菌之过氧化氢分泌量系微量至无法侦测。由此可证实，本发明之乳酸杆菌系具有分泌过氧化氢之能力，且较其他乳酸杆菌之过氧化氢分泌量为佳，因宿主体内的过氧化氢系容易与卤素离子反应而生成该具有毒性之氧化物，而该毒性氧化物系对阴道病原菌产生毒杀作用，因此，本发明之乳酸杆菌系 能够发挥该较佳之杀菌能力。
为了进一步了解本发明之乳酸杆菌对阴道细胞之吸附能力，本实施例系将阴道
上皮细胞培养稳定后，再以每毫升5×104之阴道上皮细胞种殖于24孔盘内，待培养24小时后，于该24孔盘内加入最终浓度为108CFU/mL之乳酸杆菌体，再于37℃且具有5%二氧化碳之环境共培养2小时，接着以PBS缓冲溶液缓慢地进行冲洗以去除未吸附至阴道上皮细胞之乳酸杆菌，接着打破该阴道上皮细胞，以固态MRS培养基测定吸附于该阴道上皮细胞上的乳酸杆菌菌数。其中，该乳酸杆菌菌株系包含本发明之乳酸杆菌及习知洛德乳酸杆菌及鼠李糖乳酸杆菌。本实施例所选用之阴道上皮细胞系一人类子宫颈癌细胞株Hela cell，系购自台湾食品工业发展研究所BCRC60005，本发明乳酸杆菌之详细吸附情形纪录于第4表。
第4表:本发明乳酸杆菌之上皮细胞吸附能力。
| 菌株 | 细胞吸附能力(n/cell) |
| 嗜酸乳杆菌LA25 | 71 |
| 乳酸乳杆菌LDL114 | 76 |
| 植物乳杆菌LP115 | 6 |
| LA25+LDL114+LP115 | 81 |
| 洛德乳酸杆菌 | 9 |
| 鼠李糖乳酸杆菌 | 34 |
| 洛德乳酸杆菌+鼠李糖乳酸杆菌 | 67 |
由第4表之结果得知，本发明之乳酸杆菌对于该阴道上皮细胞系产生较佳之吸附效果，特别系以乳酸乳杆菌LDL114所呈现之吸附细胞量较其他乳酸杆菌所呈现之吸附细胞量为多，更以复合乳酸乳杆菌LDL114及植物乳杆菌LP115后呈现有显著的细胞吸附能力。由此可证实，本发明之乳酸杆菌具有吸附人类阴道上皮细胞的能力，且较其他乳酸杆菌之吸附力为佳，因阴道病原菌(包含白色念珠菌及阴道伽氏杆菌)仅吸附于宿主之阴道 细胞，而本发明之乳酸杆菌可以长时间停留在宿主之阴道细胞上，故能于宿主体内发挥较佳之抑菌能力。本发明特别系以乳酸乳杆菌LDL114复合乳酸乳杆菌LDL114及植物乳杆菌LP115具有较佳之吸附能力，藉以弥补其过氧化氢分泌量不足之情形，同样能于宿主体内发挥较佳抑菌之功效。
再者，为了解本发明之乳酸杆菌对阴道细胞的预防及治疗之能力。本实施例系将该乳酸杆菌分别与白色念珠菌及阴道伽氏杆菌接种于该阴道上皮细胞进行共培养，以观察该嗜酸乳杆菌与阴道病原菌(包含白色念珠菌及阴道伽氏杆菌)于阴道上皮细胞的竞争吸附情形，藉以利用竞争排除之方法来证实本发明之乳酸杆菌对阴道
细胞的治疗能力；另外，本实施例系将该乳酸杆菌先与阴道上皮细胞进行培养2小时后，再以固态MRS作为共同培养基于此分别加入该白色念珠菌及阴道伽氏杆菌，以观察该乳酸杆菌保护阴道上皮细胞避免该阴道病原菌吸附之情形(请参照第5表所示)，藉以利用此方法来证实本发明之乳酸杆菌对阴道细胞的预防能力。其中，本实施例之白色念珠菌系购自台湾食品工业发展研究所，且该白色念珠菌之保藏号为BCRC20511及BCRC21538。
第5表:本发明乳酸杆菌吸附阴道上皮细胞之比率。
由上述结果得知，于该阴道上皮细胞上添加该乳酸杆菌与阴道病原菌共培养之情况下，本发明之乳酸杆菌系能够具有高达87%抑制阴道伽氏杆菌吸附于阴道上皮细胞之效果，且同样能够抑制白色念珠菌吸附于阴道上皮细胞；另外，使该乳酸杆菌先于阴道上皮细胞产生保护作用再添加阴道病原菌共培养之情况下，本发明之乳酸杆菌系具有高达98%预防阴道伽氏杆菌吸附于阴道上皮细胞之效果，且具有高达73~82%预防白色念珠菌吸 附于阴道上皮细胞。由此可证实，本发明之乳酸杆菌对阴道伽氏杆菌系具有较佳的竞争能力，能够对抗附着于阴道上皮细胞之病原菌，使该些病原菌自阴道上皮细胞脱落而死亡；且不论对阴道伽氏杆菌或白色念珠菌均具有良好的抑制作用，能够有效防止该阴道病原菌吸附于阴道上皮细胞而造成感染之情形，因此，本发明之乳酸杆菌系能够长时间限制阴道炎病原菌于宿主阴道内之生长。
由上所述，本发明之乳酸杆菌可以吸附于宿主阴道细胞，长时间停留于宿主体内以产生较佳之抑菌能力，且该乳酸杆菌系能够分泌大量的过氧化氢以产生对阴道病原菌具有毒性之氧化物，以同时于霉菌性阴道炎病原菌(如白色念珠菌)及细菌性阴道炎病原菌(如阴道伽氏杆菌)具有较佳之抑菌效果；该乳酸杆菌可广泛应用于商用治疗或预防阴道炎病原菌感染之产品制备，如保健食品、医用制剂或加工食品等；该乳酸杆菌可以单独或混合其他所需成分(如载剂、营养成分等)加工制成各种产品形式，如锭剂、胶囊、饮品、粉末或滴剂等，可以系由各种方式给予个体以有效控制阴道病原菌之感染，及其所引发之相关疾病。
再者，更进一步证实本发明乳酸杆菌的抑菌能力及抑菌效果，系分别测试该嗜酸乳杆菌LA25、乳酸乳杆菌LDL114、植物乳杆菌LP115及其复合后对该些病原菌之抑制性，藉此观察其对阴道炎病原菌的杀菌效果，详见于第2至4图及第6-1至6-3表。
以该白色念珠菌为例(如第6-1表及第6-2表)，经0至24小时长时间的共培养下，同时具有该嗜酸乳杆菌LA25与该二乳杆菌之液态培养基中，其所含之病原菌菌数系随时间增加仍未有上升之趋势，甚至随时间上升至24小时，该白色念珠菌之菌数相较于0至8小时所测得之菌数系明显下降。藉此得知该嗜酸乳杆菌LA25与该二乳杆菌相互协同作用下不仅可以具有长时间的抑菌效果，甚至可以降低病原菌之细菌数以达到额外的杀菌作用。
第6-1表：本发明LA25与LDL114及LP115的协同抑菌情形。
第6-2表：本发明LA25与LDL114及LP115的协同抑菌情形。
再者，以该阴道伽氏杆菌为例(如第6-3表)，经0至24小时长时间的培养下，同时具有该嗜酸乳杆菌LA25与该二乳杆菌之液态培养基中，其所含之病原菌菌数相较于该病原菌正常生长速度系随时间增加仍维持有下降之趋势，甚至随时间上升至24小时，该阴道伽氏杆菌之菌数相较于控制组测得之菌数系明显下降。藉此得知该嗜酸乳杆菌LA25与该二乳杆菌相互协同作用下虽无法完全抑制该阴道伽氏杆菌之生长，但于长时间的培养下相较于控制组仍具有减缓该病原菌之繁殖速度之功
效，甚至于24小时之情况下些微降低病原菌之细菌数以达到额外杀菌之作用。
第6-3表：本发明LA25与LDL114及LP115的协同抑菌情形。
本发明之抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，其系能够于宿主阴道细胞作用，以同时达到抑制不同种类之阴道炎病原菌生长之功效。
本发明之抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，系能够利用过氧化氢对病原菌的毒化作用，以完整发挥该乳酸杆菌之杀菌功效。
本发明之抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，系能够利用细胞吸附特性附着于阴道细胞上，以长时间限制阴道炎病原菌于宿主阴道内之生长，达到较佳抑菌之功效。
本发明之乳酸杆菌之用途，系将如上所述之抑制阴道病原菌之乳酸杆菌应用于商用抑菌产品的制备，以进一步控制阴道病原菌之感染，为本发明之功效。
本发明之乳酸杆菌之复合物，系将如上所述之抑制阴道病原菌之乳酸杆菌搭配其他兼容性菌株，以提升该乳酸杆菌之抑菌能力，进而达到抑制阴道炎病原菌之功效。
虽然本发明已利用上述较佳实施例揭示，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者在不脱离本发明之精神和范围之内，相对上述实施例进行各种更动与修改仍属本发明所保护之技术范畴，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
Claims (7)
1.一种抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，寄存于中国普通微生物保藏管理中心，且该乳酸杆菌系选自由一保藏号为CGMCC No.6244之嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、一保藏号为CGMCC No.6245之乳酸乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis）及一保藏号为CGMCC No.6246之植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）所组成之群组。
2.如权利要求1所述的抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，其特征在于是保藏号为CGMCC No.6244之嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、保藏号为CGMCC No.6245之乳酸乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis）及一保藏号为CGMCC No.6246之植物乳杆菌按1：1：1的菌数比组成的混合物。
3.根据权利要求1或2所述之抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，其特征在于具有分泌过氧化氢及细胞吸附之能力。
4.根据权利要求1或2所述之抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，其特征在于保藏号为CGMCC No.6244之嗜酸乳杆菌系具有如序列辨识编码：
cgtggggaac ctgccccata gtctaggata ccacttggaa acaggtgcta 50
ataccggata ataaagcaga tcgcatgatc agcttataaa aggcggcgta 100
agctgtcgct atgggatggc cccgcggtgc attagctagt tggtaaggta 150
acggcttacc aaggcaatga tgcatagccg agttgagaga ctgaacggcc 200
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg 250
aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa 300
gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt 350
agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa ccagaaagtc acggctaact 400
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt 450
attgggcgta aagcgagcgc aggcggaaga ataagtctga tgtgaaagcc 500
ctcggcttaa ccgaggaatt gcatcggaaa ctgtttttct tgagtgcaga 550
agaggagagt ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga 600
agaacaccag tggcgaaggc ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc 650
tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg 700
taaacgatga gtgctaagtg ttgggaggtt tccgcctctc agtgctgcag 750
cgtattcacc gcggcgttct gatccgcgat tactagcgat tccagcttcg 800
tgcagtcgag ttgcagactg cagtccgaac tgagaacagc tttcagagat 850
tcgcttgcct tcgcaggctc gcttctcgtt gtactgccca ttgtagcacg 900
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg acttgacgtc atccccacct 950
tcctccggtt tgtcaccggc agtctcatta gagtgcccaa cttaatgctg 1000
gcaactaata ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc 1050
acgacacgag ctgacgacag ccatgcacca cctgtcttag cgtccccgaa 1100
gggaactcct aatctcttag gatggcacta gatgtcaaga cctggtaagg 1150
ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 1200
ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg 1250
agtgcttaat gcgttagctg cagcactgag aggcggaaac ctcccaacac 1300
ttagcactca tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc 1350
gctacccatg ctttcgagcc tcagcgtcag ttgcagacca gagagccgcc 1400
ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac gcattccacc gctacacatg 1450
gagttccact ctcctcttct gcactcaaga aaaacagttt ccgatgcaat 1500
5.根据权利要求1或2所述之抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，其特征在于保藏号为CGMCC No.6245之乳酸乳杆菌系具有如序列辨识编码：
ttcaaagatc ccttcggggt gatttgttgg atgctagcgg cggatgggtg 50
agtaacacgt gggcaatctg ccctaaagac tgggatacca cttggaaaca 100
ggtgctaata ccggataaca acatgaatcg catgattcaa gtttgaaagg 150
cggcgcaagc tgtcacttta ggatgagccc gcggcgcatt agctagttgg 200
tggggtaaag gcctaccaag gcaatgatgc gtagccgagt tgagagactg 250
atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc 300
agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt 350
gagtgaagaa ggtcttcgga tcgtaaagct ctgttgttgg tgaagaagga 400
tagaggcagt aactggtctt tatttgacgg taatcaacca gaaagtcacg 450
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 500
cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggaatgata agtctgatgt 550
gaaagcccac ggctcaaccg tggaactgca tcggaaactg tcattcttga 600
gtgcagaaga ggagagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat 650
atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tctctggtct gcaactgacg 700
ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc 750
catgccgtaa acgatgagcg ctaggtgttg gggactttcc ggtcctcagt 800
gccgcagcaa acgcattaag cgctccgcct ggggagtacg accgcaaggt 850
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900
tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctgcgc 950
tacacctaga gataggtggt tcccttcggg gacgcagaga caggtggtgc 1000
atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1050
agcgcaaccc ttgtctttag ttgccatcat taagttgggc actctaaaga 1100
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1150
gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatgggca gtacaacgag 1200
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actgcaggct gcaactcgcc tgcacgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1300
gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1350
tcacaccatg gaagtctgca atgcccaaag tcggtgggat aacctttata 1400
ggagtcagcc gcctaaggca gggcagatga ctggggtgaa gtcgtaacaa 1450
ggtagccgta ggagaa 1466
6.根据权利要求1或2所述之抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌，其特征在于保藏号为CGMCC No.6246之植物乳杆菌系具有如序列辨识编码：
cgtggggaac ctgccccata gtctaggata ccacttggaa acaggtgcta 50
ataccggata ataaagcaga tcgcatgatc agcttataaa aggcggcgta 100
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acggcttacc aaggcaatga tgcatagccg agttgagaga ctgaacggcc 200
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg 250
aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa 300
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7.权利要求1或2所述之抑制阴道炎病原菌之乳酸杆菌在制备抑制阴道炎病原菌感染之食品组成物或药物组成物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |