CN110016442B - 鼠李糖乳杆菌及其复合菌粉在防治阴道炎制品中的应用 - Google Patents

鼠李糖乳杆菌及其复合菌粉在防治阴道炎制品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新的鼠李糖乳杆菌，即鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR 519，保藏编号为CGMCC No.15969，该菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌、白色假丝酵母菌等阴道致病菌均具有较好的抑制作用，能够调节阴道微生态平衡，维护女性阴道的健康，该菌株可用于制备防治阴道炎的药物、食品、卫生用品中。本发明同时公开了含有鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45的复合菌粉及其在防治阴道炎的药物、食品、卫生用品中的应用。

Description

鼠李糖乳杆菌及其复合菌粉在防治阴道炎制品中的应用
技术领域
本发明涉及一种新的鼠李糖乳杆菌LR 519，同时涉及含有鼠李糖乳杆菌LR 519的菌粉及用途。
背景技术
阴道炎，即阴道微生态失调症，临床表现主要为白带异常、外阴瘙痒，发病率较高，是严重影响育龄妇女身心健康的一种疾病。临床上常见的阴道炎主要分为四大类，分别为细菌性阴道炎、外阴阴道假丝酵母菌病、滴虫阴道炎、老年性阴道炎。
对于阴道炎的治疗，以往单纯应用抗生素来杀灭致病微生物，只是表面上的治愈，并没有恢复阴道pH值和阴道内乳酸杆菌的数量和质量，也没有真正恢复已被破坏的阴道微生态环境，所以没有达到真正意义上的治愈，极易复发。目前，在阴道炎的治疗上，有效改善临床症状、提高其治愈率的同时，关键在于恢复阴道的防御功能、降低阴道炎的复发。因此，在治疗阴道炎时，应用抗生素及微生态制剂联合用药，起到了“边治边调”的作用，既避免了长期使用抗生素引起的耐药性，又可以达到治疗和预防合二为一的功效，从根本上恢复阴道微生态，有益于女性身体健康。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的鼠李糖乳杆菌LR519，该菌株能够抑制女性阴道内致病菌的活性，具有防治阴道炎的作用。本发明还提供了含有鼠李糖乳杆菌LR 519的复合菌粉及其用途。
为了实现本发明的目的，发明人提供了以下技术方案。
鼠李糖乳杆菌，为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR 519，保藏编号为CGMCC No.15969。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌LR519能够用于制备防治阴道炎的药物。
鼠李糖乳杆菌LR 519可作为有益成分添加在发酵果蔬汁、发酵乳制品、增强免疫力保健食品、女性私护固体饮料等食品中，能够提升人体免疫力，尤其能够增强女性生殖道免疫力作用。
鼠李糖乳杆菌LR519还可添加在女性卫生用品中，拮抗阴道致病菌的生长繁殖，起到预防阴道炎症发生的作用。
鼠李糖乳杆菌LR 519在药物、食品、女性卫生用品中应用时，菌株为活性菌株或灭活性菌株。
本发明还提供了含有鼠李糖乳杆菌LR 519的复合菌粉，其组分包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR 519，保藏编号为CGMCC No.15969；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YMC 1005，保藏编号为CGMCC No.8072。
上述复合菌粉，其组分中鼠李糖乳杆菌LR 519与植物乳杆菌YMC 1005菌株为活性菌株或灭活性菌株，鼠李糖乳杆菌LR 519与植物乳杆菌YMC 1005活菌数的比例为1：1-5或1-5:1，或鼠李糖乳杆菌LR 519与植物乳杆菌YMC 1005菌体数的比例为1：1-5或1-5:1。
上述复合菌粉能够用于制备防治阴道炎的药物。
上述复合菌粉可作为有益成分添加至发酵果蔬汁、发酵乳制品、增强免疫力保健食品、女性私护固体饮料等食品中，能够提升人体免疫力，尤其能够增强女性生殖道免疫力作用。
上述复合菌粉还可添加在女性卫生用品中，拮抗阴道致病菌的生长繁殖，起到预防阴道炎症发生的作用。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌LR519属于乳酸菌的一种，它对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌、白色假丝酵母菌均具有较好的抑制作用，能够调节阴道微生态平衡，抵御外源性致病菌的生长繁殖，维护女性阴道的健康。
本发明所提供的鼠李糖乳杆菌LR519是从中国云南省大理白族自治州剑川县农户家中自制的乳扇中分离得到的。该菌株已经过鉴定，鉴定结果该菌株为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，商业编号为LR519，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2018年6月20日，保藏编号为：CGMCC No.15969。
本发明所述的植物乳杆菌YMC1005，商品编号为LP45，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2013年8月26日，保藏编号为：CGMCC No.8072。
植物乳杆菌LP45也表现出对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌、白色假丝酵母菌较好的抑制作用。
鼠李糖乳杆菌LR519与植物乳杆菌LP45都属于乳酸菌，在防治阴道炎中，均表现出乳酸菌的通性，具有改善阴道菌群平衡，与致病性微生物竞争生存环境，分泌有机酸、过氧化氢和细菌素抑制致病微生物生长繁殖，提高黏膜免疫力，增强宿主抗感染作用。
发明人经试验证实，鼠李糖乳杆菌LR519能够与植物乳杆菌LP45协同作用，有效抑制女性阴道致病菌的生长繁殖，从而调节阴道微生态平衡，维护女性阴道的健康。因此，本发明提供了含有鼠李糖乳杆菌LR519菌粉与植物乳杆菌LP45菌粉的复合菌粉。
本发明所述的灭活性菌株是指将鼠李糖乳杆菌LR 519、植物乳杆菌YMC1005菌株进行高温短时灭活，保证灭活后乳酸菌菌落总数≤200cfu/g或≤200cfu/mL。灭活后的菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均具有较强的抑制效果。
本发明所述的鼠李糖乳杆菌LR519，以及含有鼠李糖乳杆菌LR519与植物乳杆菌LP45的复合菌粉在实际应用时可根据需要添加不同的辅料，将高浓度的菌粉进行稀释，降低其浓度，以方便使用。可添加的辅料包括麦芽糊精、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、低聚壳聚糖、低聚异麦芽糖、乳糖、淀粉等。
在实际应用中，鼠李糖乳杆菌LR519，以及含有鼠李糖乳杆菌LR519与植物乳杆菌LP45的复合菌粉还可以根据需要加入益生元、乳酸、中药或中药提取物，例如苦参、蛇床子、黄柏、冰片、益母草等。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
实施例1鼠李糖乳杆菌LR519的分离、鉴定
(1)菌株分离
取乳扇(采集自云南大理剑川县农户家中)，用无菌生理盐水冲洗后，接入质量百分比为12％的脱脂奶中，室温培养至凝乳。取1mL凝乳的脱脂奶，用9mL无菌生理盐水梯度稀释后，在MRS固体培养基中进行涂布，37℃培养72h。选择长有单菌落的MRS平板，分别挑取大小、颜色、状态不同的菌落，进行革兰氏染色，将革兰氏阳性杆菌接入MRS液体培养基中，37℃培养至浑浊。将菌液在MRS固体培养基中划线分离，如此反复3次以上，得到菌落、菌体形态一致的菌株，进行保存。
(2)菌株鉴定
取菌落乳白色、凸起、边缘整齐，表面光滑，并在显微镜下为杆状、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株，进行16S rRNA、pheS基因鉴定及API 50CH试验。鉴定结果该菌株为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，商业编号LR519。表1为该菌株细胞形态和理化实验结果。
表1
Figure BDA0001974622330000051
实施例2鼠李糖乳杆菌LR519的溶血性试验和菌种稳定性评价
溶血试验结果表明鼠李糖乳杆菌LR519没有溶血性，即γ溶血。菌种稳定性试验表明，经连续传代培养和对比实验，该菌株的形态特征、理化特征等分类鉴定性状，以及抗生素敏感等未发现可见变化，表明该菌株的性状可稳定遗传。
实施例3鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45抑菌能力试验
(一)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力试验
(1)试验方法
①鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45由冻存管活化，分别接种于液体MRS培养基中活化3代，将活化好的乳酸菌按3％接种量接于液体MRS培养基中，37℃培养24h将乳酸菌发酵液按8000rpm/min离心10min收集发酵上清液，用细菌过滤器对上清液过滤除菌备用；
②将10mL冷却至50℃的2.0％素琼脂培养基倾倒在无菌平皿中，在洁净工作台中晾干；
③取灭菌牛津杯放在素琼脂培养基上，静置10min；
④将1mL培养好的大肠杆菌菌液加入到100mL冷却至50℃的营养琼脂培养基中充分混匀；
⑤在放有牛津杯的平皿上倾倒10mL含有大肠杆菌的营养琼脂培养基，待培养基凝固后将牛津杯取出，形成牛津杯孔；
⑥在各孔中注入0.1mL乳酸菌发酵上清液，于37℃过夜培养，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，每组设置两个平行，重复3次试验。
对金黄色葡萄球菌抑菌能力的试验方法同上。
(2)试验结果
表2为鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌能力试验的结果。
表2
Figure BDA0001974622330000061
Figure BDA0001974622330000071
注：由于牛津杯孔有8mm的直径，只有抑菌圈直径≥8mm表示具有抑菌效果。
结果表明，鼠李糖乳杆菌LR 519、植物乳杆菌LP 45对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抑制能力。
(二)对阴道加德纳菌的抑制能力试验
(1)试验方法
①鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45由冻存管活化，分别接种于液体MRS培养基中活化3代，将活化好的乳酸菌按3％接种量接于液体MRS培养基中，37℃培养24h将乳酸菌发酵液按8000rpm/min离心10min收集发酵上清液，用细菌过滤器对上清液过滤除菌备用；
②采用琼脂扩散法，在灭菌平皿中加入20mL含5％脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，待培养基凝固后加入0.1mL阴道加德纳菌液均匀涂布；
③取灭菌牛津杯放在培养基上，静置10min，在牛津杯中加入0.1mL乳酸菌上清液，37℃微厌氧培养20h用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，每组设置两个平行。
(2)试验结果
表3为鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45对阴道加德纳菌的抑制能力试验结果。
表3
菌株 抑菌圈直径(mm)
LR519 18.56±0.8
LP45 17.60±1.1
注：由于牛津杯孔有8mm的直径，只有抑菌圈直径≥8mm表示具有抑菌效果。
结果表明，鼠李糖乳杆菌LR 519和植物乳杆菌LP 45对阴道加德纳菌均具有良好的抑制能力。
(三)对白色假丝酵母菌的抑制能力试验
(1)试验方法
①植物乳杆菌LP45和鼠李糖乳杆菌LR519由冻存管活化，分别接种于液体MRS培养基中活化3代，将活化好的乳酸菌按3％接种量接于液体MRS培养基中，37℃培养16h。
②将5mL乳酸菌发酵液和5mL的白色假丝酵母菌菌液等体积混匀，分别在0h、12h和24h对白色假丝酵母进行活菌计数，采用选择性YPD培养基。
③将5mL液体MRS培养基(pH6.8)和5mL液体MRS培养基(pH4.0)分别与5mL白色假丝酵母菌菌液等体积混匀，分别在0h、12h和24h对白色假丝酵母进行活菌计数，采用选择性YPD培养基。
④计算试验菌株对白色假丝酵母的抑制能力
试验菌株对白色假丝酵母的抑制率A＝(A0-At)/A0×100％
At代表与试验菌株培养12h、24h的白色假丝酵母活菌数
A0代表与试验菌株培养0h的白色假丝酵母活菌数(2)试验结果
表4为鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45对白色假丝酵母菌的抑菌能力试验结果。
表4
Figure BDA0001974622330000081
Figure BDA0001974622330000091
结果表明，pH4.0和pH6.8的MRS液体培养基不能抑制白色假丝酵母生长。鼠李糖乳杆菌LR 519、植物乳杆菌LP 45对白色假丝酵母菌均有较强的抑制效果，且随时间延长抑菌效果增强。
实施例4鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45在低pH环境中的耐受性试验
(1)试验方法
将活化好的鼠李糖乳杆菌LR 519、植物乳杆菌LP 45分别按3％接种量接于pH4.5的液体MRS培养基中，37℃静置培养，分别在6h、12h、24h测定活菌数检测乳酸菌在低pH值环境中的生长状况。
(2)试验结果
表5为鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45在不同pH值条件下的生长状况。
表5
Figure BDA0001974622330000092
结果表明，低pH环境(pH值为4.5)不会抑制鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45的生长，不仅如此，随着培养时间的延长，鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45活菌数呈现增长趋势。
实施例5鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45产过氧化氢的能力
表6给出了鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45产生过氧化氢能力的试验结果。
表6
Figure BDA0001974622330000101
实施例6复合菌粉的制备
鼠李糖乳杆菌LR519和植物乳杆菌LP45分别经发酵培养、离心浓缩、深冷速冻或真空冷冻干燥、粉碎或低温喷雾干燥制成菌粉。
以鼠李糖乳杆菌LR519菌粉和植物乳杆菌LP45菌粉为原料，添加麦芽糊精，经混合、包装制成的活菌数≥4.0×109cfu/g乳酸菌产品。
制备过程中，按照终产品中活菌数来计算菌粉原料的添加量。
发明人依照上述方法制备得到了一系列的复合菌粉，其中，鼠李糖乳杆菌LR 519与植物乳杆菌YMC 1005活菌数的比例分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、3:1、4:1、5:1。
发明人将依照此方法制备得到的复合菌粉进行了一系列的理化、动物及人体试验，实施例7-10给出了鼠李糖乳杆菌LR 519与植物乳杆菌YMC 1005活菌数的比例2:1的复合菌粉的试验资料。
实施例7复合菌粉的抑菌能力试验
(1)试验方法
①将鼠李糖乳杆菌LR519菌粉和植物乳杆菌LP45菌粉按活菌数的不同比例配制复合菌粉(活菌数≥4.0×109cfu/g)，将1g复合菌粉加入2mL无菌水中混合均匀，放置4℃备用；
②将10mL冷却至50℃的2.0％素琼脂培养基倾倒在无菌平皿中，在洁净工作台中晾干；
③取灭菌牛津杯放在素琼脂培养基上，静置10min；
④将1mL培养好的大肠杆菌菌液加入到100mL冷却至50℃的营养琼脂培养基中充分混匀；
⑤在放有牛津杯的平皿上倾倒10mL含有大肠杆菌的营养琼脂培养基，待培养基凝固后将牛津杯取出，形成牛津杯孔；
⑥在各孔中注入0.1mL复合菌粉水溶液，于37℃过夜培养，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，每组设置两个平行，重复3次试验。
对金黄色葡萄球菌抑菌能力的试验方法同上。
复合菌粉加无菌水制成菌粉溶液后再进行抑菌试验。在这个过程中菌粉首先要自身活化，活化后的乳酸菌产生代谢产物并起到抑菌作用。
(2)试验结果
如表7所示。
表7
Figure BDA0001974622330000111
Figure BDA0001974622330000121
实施例8复合菌粉的水溶液在不同时间段的产酸情况
(1)试验方法
将0.5g复合菌粉加入到1mL无菌水中混匀，37℃静置，采用高效液相色谱法分别在0h、12h、24h、36h、48h测定复合菌粉水溶液中的乳酸含量。
(2)试验结果
表8为0-48h内复合菌粉水溶液中乳酸的浓度。
表8
时间 pH值 乳酸浓度
0h pH4.45 2.03g/L
12h pH3.36 10.72g/L
24h pH3.27 14.40g/L
36h pH3.25 14.71g/L
48h pH3.24 15.52g/L
复合菌粉水溶液在37℃条件下随时间延长pH值逐渐下降。经液相检测，复合菌粉水溶液中生成的主要为乳酸，在37℃贮存0h-48h过程中，复合菌粉能够持续产生乳酸，维持环境的低pH值。
(3)试验结论
健康女性阴道中乳酸的作用主要是维持阴道的酸性环境，Rosario等人的研究表明健康女性阴道中乳酸的生理浓度为55-111mM即4.95g/L-10.00g/L，体外验证生理浓度的乳酸(55-111mM)和pH4.5会导致阴道加德纳菌失活，而不影响阴道特有乳酸菌，并且失活是依赖于乳酸而不是pH值。
本发明提供的含有鼠李糖乳杆菌LR 519和植物乳杆菌LP 45的复合菌粉具有产乳酸能力，且能够达到有效的生理浓度，可以维持女性阴道正常的酸性环境。
实施例9复合菌粉对动物阴道黏膜刺激性试验
发明人将复合菌粉的样品送至宁波市出入境检验检疫局检验检疫技术中心，进行了阴道黏膜刺激试验，具体如下。
检验项目：阴道黏膜刺激试验
检测环境：普通环境兔房，合格证号：SYXK(浙)2018-0003，室温22.6℃～24.5℃；相对湿度48.9％～61.0％。
试验动物：新西兰家兔。
动物数/性别：6只，雌性。
试验方法：样品对家兔的阴道黏膜刺激试验分为样品组和对照组，每组3只动物。染毒24小时后处死动物，取阴道黏膜组织做病理学观察。
结果：受试动物阴道病理组织学观察，样品对阴道黏膜的刺激指数为0.78。
结论：按阴道黏膜刺激强度分级，该受试物对兔阴道黏膜的刺激强度属无刺激性。
实施例10复合菌粉的人体试验
(1)受试者的选择
筛选年龄在20-50岁之间的已婚女性志愿者，排除药物过敏的患者，排除患有严重心、脑、肝、肾疾病或免疫性疾病的患者，排除处于妊娠期或哺乳期的患者，排除入组前一周内采用抗菌药物进行治疗的患者，进行妇科检查和阴道分泌物五联检的检查，根据检查结果，选定受试者共37人，其中患有阴道炎症的受试者17人，阴道健康的受试者20人。
妇科检查包括：分泌物、附件、宫颈、外阴、阴道、子宫、既往史、其它、现症状。
阴道分泌物五联检包括：BV、滴虫、念珠菌、乳酸杆菌、白细胞。
阴道清洁度判定：清洁度分为4度，分别为：
Ⅰ度：白细胞0-5/HP，属正常。
Ⅱ度：白细胞5-15/HP，可见少量球菌，属基本正常。
Ⅲ度：白细胞15-30/HP，球菌较多，提示有阴道炎。
Ⅳ度：白细胞>30/HP，有大量球菌，提示有较重的阴道炎。
(2)药物试验
受试样品：复合菌粉规格为0.5g/包，含活菌40亿单位。无菌注射用水1mL/瓶。
用药方法：受试者在给药前清洗外阴，将复合菌粉溶于无菌注射用水中，然后用给药器将复合菌粉溶液推入阴道内，睡前使用。
试验周期：每晚给药一次，连续给药10天。
(3)试验结果
表9和表10分别给出了17名阴道炎受试者和20名阴道健康受试者使用复合菌粉前后相关检查的结果。
表9
Figure BDA0001974622330000141
Figure BDA0001974622330000151
表10
Figure BDA0001974622330000152
试验过程中，受试者均未出现阴道瘙痒、灼痛、红肿的症状，不良反应率为零。
(4)试验结论
试验证明，使用含有植物乳杆菌LP45和鼠李糖乳杆菌LR519复合菌粉对女性生殖道没有刺激性，所有受试者使用后均未出现瘙痒、疼痛或肿胀等过敏不适症状，表明了该复合菌粉的安全性。使用复合菌粉后，阴道炎患者和阴道健康者的阴道炎症或阴道清洁度均有不同程度的改善，说明了该复合菌粉的有效性。此外，多数受试者反馈，使用复合菌粉后阴道分泌物的量及颜色均有改善。
Figure BDA0001974622330000171
Figure BDA0001974622330000181
Figure IDA0001974622380000011
Figure IDA0001974622380000021

Claims (7)

1.一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR 519，其保藏编号为CGMCCNo.15969。
2.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LR519在制备用于防治阴道炎药物中的应用。
3.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LR519在生产女性卫生用品中的应用。
4.含有权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LR519的复合菌粉，其特征在于，组分包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR 519，保藏编号为CGMCC No.15969；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YMC 1005，保藏编号为CGMCC No.8072。
5.根据权利要求4所述的复合菌粉，其特征在于，组分中鼠李糖乳杆菌LR 519与植物乳杆菌YMC 1005活菌数的比例为1：1-5或1-5：1。
6.如权利要求4所述的复合菌粉在制备用于防治阴道炎药物中的应用。
7.如权利要求4所述的复合菌粉在生产女性卫生用品中的应用。
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