CN110791452A - 一株改善口腔健康的唾液乳杆菌jyls-372及产品和制备方法 - Google Patents

一株改善口腔健康的唾液乳杆菌jyls-372及产品和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及口腔护理技术领域,具体涉及一株改善口腔健康的唾液乳杆菌JYLS‑372及产品和制备方法,所述产品的活性成分为唾液乳杆菌JYLS‑372,制备方法包括:将唾液乳杆菌JYLS‑372接种到MRS液体培养基上并进行培养,得到MRS菌液;MRS菌液经过离心、真空冷冻干燥,获得菌粉;菌粉与低聚异麦芽糖混合复配,得到产品。本发明的唾液乳杆菌JYLS‑372能够合成人体所需要的多种维生素,如B1、B2、B12、泛酸、叶酸等,可以改善牙龈出血、蛀牙、口臭、鹅口疮和溃疡疮等症状;还具备显著降低口腔中龋齿致病菌突变型链球菌数量,减少牙菌斑的形成及牙周病的发生率的特点。

Description

一株改善口腔健康的唾液乳杆菌JYLS-372及产品和制备方法
技术领域
本发明涉及口腔护理技术领域,具体涉及一株改善口腔健康的唾液乳杆菌JYLS-372及产品和制备方法。
背景技术
口腔健康是反应生命健康质量的一面镜子,口腔健康包括良好的口腔卫生,健全的口腔功能和没有口腔疾病,而保证口腔卫生又是实现健全的口腔功能和避免口腔疾病的必要前提。口腔卫生的重点在于控制菌斑,消除污垢和失误残渣,使口腔和牙颌有一个清洁健康的环境。如果没有保持口腔卫生,则会引起龋齿、口气及口疮等口腔疾病,除影响咀嚼、言语等功能外,也会引起社交困难和心理障碍,甚至加剧某些全身疾病,如冠心病、糖尿病等,危害全身健康,影响生命质量。
益生菌是一种通过摄取适当的量、对食用者的身体健康能发挥有效作用的活菌。迄今为止,已发现的益生菌可被分为三个大类,乳杆菌类、双歧杆菌类和革兰氏阳性球菌。益生菌改善口腔健康的机理包括竞争粘附位点总数,竞争营养物质和生长因子,产生酸性抗微生物化产物,增强宿主免疫反应,抑制病原菌诱导的促炎细胞因子,从而抑制有害菌粘附并加强排空,抑制病原菌的生长等作用,影响局部和全身的免疫反应,最终拮抗病原菌,减少炎症和组织破坏。
基于此,本发明提供一株改善口腔健康的唾液乳杆菌JYLS-372及产品和制备方法。
发明内容
针对现有技术缺少以益生菌为有效成分的维持口腔健康的产品的不足,本发明提供一株改善口腔健康的唾液乳杆菌JYLS-372及产品和制备方法,利用唾液乳杆菌能够显著降低口腔中龋齿致病菌突变型链球菌数量的特性,保护口腔健康。
第一方面,本发明提供一株改善口腔健康的唾液乳杆菌JYLS-372,所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)JYLS-372已于2019年6月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC),保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏号为CGMCCNO.18044。
进一步的,所述唾液乳杆菌JYLS-372是从青州西股的母乳中分离纯化获得的。
第二方面,本发明提供一种改善口腔健康的产品,所述产品的活性成分为唾液乳杆菌JYLS-372。
第三方面,本发明提供一种改善口腔健康的产品的制备方法,方法包括如下步骤:
(1)将唾液乳杆菌JYLS-372接种到MRS液体培养基上并进行培养,得到MRS菌液;
(2)MRS菌液经过离心、真空冷冻干燥,获得菌粉;
(3)菌粉与低聚异麦芽糖混合复配,得到产品。
进一步的,所述MRS液体培养基的制备方法为:
将蛋白胨10g、牛肉粉5g、长歧杆菌粉4g、K2HPO4·7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、醋酸钠·3H2O5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.2g和MnSO4·4H2O 0.05g溶于1000mL蒸馏水中。
进一步的,所述唾液乳杆菌JYLS-372的接种量为1%。
进一步的,所述唾液乳杆菌JYLS-372的培养条件为37℃。
进一步的,所述产品中唾液乳杆菌JYLS-372的含量为50亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g、1000亿/g。
本发明的有益效果在于,
本发明提供的产品通过预防龋齿、清新口气及减少口疮改善口腔健康;
其中的活性成分唾液乳杆菌JYLS-372能够合成人体所需要的多种维生素,如B1、B2、B12、泛酸、叶酸等,可以改善牙龈出血、蛀牙、口臭、鹅口疮和溃疡疮等症状;还具备显著降低口腔中龋齿致病菌突变型链球菌数量,减少牙菌斑的形成及牙周病的发生率的特点。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
实施例1唾液乳杆菌JYLS-372的分离和鉴定
1、菌源
青州西股母乳。
2、培养基及培养条件
(1)称取采集的样品1g,置于含99mL 0.85%无菌生理盐水的三角瓶中,振荡15min,使样品充分混匀,10倍系列梯度稀释至10-7,配制成菌悬液;
(2)用菌悬液涂布于MRS平板培养基,37℃,培养48h;
(3)挑取MRS平板培养基上疑似乳酸菌单菌落,革兰氏染色,镜检;
(4)选取革兰氏阳性、杆状单菌落,在MRS平板培养基上划线,37℃培养48h;
(5)重复上述步骤4次
(6)最后,平板单菌落至斜面培养,保存。
其中,MRS平板培养基的制备方法为:
将蛋白胨10g、牛肉粉5g、长歧杆菌粉4g、K2HPO4·7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、醋酸钠·3H2O5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g和琼脂15g溶于1000ml蒸馏水中,121℃高温高压灭菌20min,固体培养基冷却至不烫手时开始倒入培养皿,液体培养基自然冷却,4℃冷藏备用。
实施例2一种改善口腔健康的产品
一种改善口腔健康的产品,产品的活性成分为唾液乳杆菌JYLS-372,产品还包含低聚异麦芽糖,产品中唾液乳杆菌JYLS-372的含量为1000亿/g。
上述产品的制备方法包括以下步骤:
(1)将唾液乳杆菌JYLS-372接种到MRS液体培养基上并进行培养,接种量为1%,培养条件为37℃,得到MRS菌液;
其中,MRS液体培养基的制备方法为:
将蛋白胨10g、牛肉粉5g、长歧杆菌粉4g、K2HPO4·7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、醋酸钠·3H2O5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.2g和MnSO4·4H2O 0.05g溶于1000mL蒸馏水中;
(2)MRS菌液经过离心、真空冷冻干燥,获得菌粉;
(3)菌粉与低聚异麦芽糖按比例混合复配,得到产品。
实施例3唾液乳杆菌JYLS-372对3种常见口腔致病菌的体外抑菌效果
1、指示菌悬液的配制:
(1)分别将口腔变形链球菌ATCC25175划线接种于血琼脂平板,放置在厌氧罐中,放入微需氧产气袋,于35℃微生物培养箱中培养48h,挑取单个菌落,接种于10mL BHI中,放置在厌氧罐中,放入一袋微需氧产气袋,于35℃微生物培养箱中培养48h,传代培养3代后,调整菌液浓度为106CFU/mL作为指示菌悬液;
(2)将牙龈卟啉单胞菌ATCC33277划线接种血琼脂平板,放置于厌氧罐中,放入厌氧产气袋,于35℃微生物培养箱中培养48h,挑取单个菌落,接种于10mL BHI中,放置在厌氧罐中,放入厌氧产气袋,于35℃微生物培养箱中培养48h,传代培养3代后,调整菌液浓度为106CFU/mL作为指示菌悬液;
(3)将金黄色葡萄球菌划线接种于平板计数琼脂,于37℃微生物培养箱中培养48h,挑取单个菌落,接种于10mL BHI中,于37℃微生物培养箱中培养48h,传代培养3代后,调整菌液浓度为106CFU/mL作为指示菌悬液。
2、将唾液乳杆菌菌株JYLS-372菌液的配制
分别取唾液乳杆菌菌株JYLS-372菌液,5000r/min离心10min,收集菌体沉淀后用无菌PBS洗涤2次,用无菌PBS重悬,稀释成108CFU/mL用于抑菌实验。
3、琼脂扩散法:
分别各取500μL指示菌菌液,加入到琼脂平板上(口腔变形链球菌ATCC25175及牙龈卟啉单胞菌ATCC33277加到血琼脂平板,金黄色葡萄球菌加到平板计数琼脂平板上),用无菌玻耙涂抹均匀,用镊子将灭菌后的牛津杯垂直放置在培养基的表面,轻轻加压,使它与培养基接触无空隙,每个平板放3只牛津杯;
分别将唾液乳杆菌菌株JYLS-372菌液200μL加入到不同的牛津杯内,同时用PBS作为空白对照,在指示菌最适培养条件培养,量取抑菌圈直径大小,同时每个样品做3个重复,结果取平均值。
4、判定标准:
不敏感:抑菌圈直径4mm;
低度敏感:抑菌圈直径5~10mm;
中度敏感:抑菌圈直径11~15mm;
高度敏感:抑菌圈直径大于15mm。
5、测试结果
表1唾液乳杆菌JYLS-372对3种常见口腔致病菌的体外抑菌效果
Figure BDA0002287165980000061
与空白组相比,*p<0.05。
测试结果如上表1所示,唾液乳杆菌菌株JYLS-372对口腔变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均大于15mm,对口腔变形链球菌及牙龈卟啉单胞菌的抑菌圈直径显著大于金黄色葡萄球菌(p<0.05),表明唾液乳杆菌菌液对3株口腔病原菌均有较强的抑菌作用,且对牙龈卟啉单胞菌及口腔变形链球菌抑菌作用强于金黄色葡萄球菌。革兰氏阳性菌具有较厚的细胞壁结构,因此对外界不适宜的环境有较强的抵抗力,而唾液乳杆菌菌液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显弱于其他口腔病原菌,这可能与金黄色葡萄球菌细胞壁较厚有关。
实施例4产品对于口腔护理患者的治疗作用
1、试验成员:84例需进行口腔护理患者。
在这些患者中,有42例男性患者,42例女性患者,其年龄为30~58岁,平均年龄为(37.5±6.9)岁,将这些患者随机分为对照组和观察组,每组各42例患者,两组患者的性别、年龄等一般资料相比较,差异无统计学意义(P>0.05)具有可比性。
2、口腔护理方法
定期检查患者的口腔黏膜、口唇、牙龈等处有无糜烂、肿胀或出血,同时测定其口腔的pH值;
指导患者保持口腔卫生及个人卫生,禁止食用有刺激性和过热的食物,同时戒除烟酒;
为对照组患者使用维生素B2片(每次5mg,每日1次)口服,共用药14d;
为观察组患者使用实施例2制备的产品,10g/天,共用药14d。
3、疗效判定指标
(1)显效:用药7d内溃疡面基本消失,同时疼痛、吞咽困难等症状消失;
(2)有效:用药7d内溃疡面积明显缩小,同时疼痛、吞咽困难等症状明显减轻;
(3)无效:用药7d后溃疡面积未缩小甚至扩大,同时疼痛、吞咽困难等症状缓解不明显,甚至加重;
按照如下等式计算治疗有效率:
有效率=(显效例数+有效例数)/总例数。
4、试验结果
表2唾液乳杆菌对观察组及对照组口腔溃疡治疗有效率的影响
Figure BDA0002287165980000071
如表2所示,本次研究中,观察组显效22例,有效16例,无效4例;对照组显效12例,有效16例,无效14例,由结果可知,观察组与对照组组间差异具有统计学意义(P<0.05)。
目前临床上已有较多实验证实,补充维生素对于口腔溃疡的辅助治疗具有明显的效果,但目前尚未形成统一治疗方案,并且辅助治疗选用的维生素种类和剂量均无统一标准。本次研究结果显示,观察组在临床治疗有效率方面显著优于对照组。这一结果表明,唾液乳酸杆菌JYLS-372比B族维生素能更加显著的治疗口腔溃疡,同时能够缩短治疗时间。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述,但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下,本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换,而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

Claims (8)

1.一株改善口腔健康的唾液乳杆菌JYLS-372,其特征在于,所述唾液乳杆菌JYLS-372已于2019年6月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏号为CGMCC NO.18044。
2.一株如权利要求1所述的改善口腔健康的唾液乳杆菌JYLS-372,其特征在于,所述唾液乳杆菌JYLS-372是从青州西股的母乳中分离纯化获得的。
3.一种改善口腔健康的产品,其特征在于,所述产品的活性成分为唾液乳杆菌JYLS-372。
4.一种如权利要求3所述的改善口腔健康的产品的制备方法,其特征在于,方法包括如下步骤:
(1)将唾液乳杆菌JYLS-372接种到MRS液体培养基上并进行培养,得到MRS菌液;
(2)MRS菌液经过离心、真空冷冻干燥,获得菌粉;
(3)菌粉与低聚异麦芽糖混合复配,得到产品。
5.如权利要求4所述的一种改善口腔健康的产品的制备方法,其特征在于,所述MRS液体培养基的制备方法为:
将蛋白胨10g、牛肉粉5g、长歧杆菌粉4g、K2HPO4·7H2O 2g、柠檬酸三铵2g、醋酸钠·3H2O5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO4·7H2O 0.2g和MnSO4·4H2O 0.05g溶于1000mL蒸馏水中。
6.如权利要求4所述的一种改善口腔健康的产品的制备方法,其特征在于,所述唾液乳杆菌JYLS-372的接种量为1%。
7.如权利要求4所述的一种改善口腔健康的产品的制备方法,其特征在于,所述唾液乳杆菌JYLS-372的培养条件为37℃。
8.如权利要求4所述的一种改善口腔健康的产品的制备方法,其特征在于,所述产品中唾液乳杆菌JYLS-372的含量为50亿/g、150亿/g、250亿/g、500亿/g或1000亿/g。
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