JP5108068B2 - 口腔内の細菌群を改善するラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95(LactobacillusfermentumSG−A95)及びその保健組成物 - Google Patents
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Description
(b)ストレプトコッカス・サンギスに関連する疾患:虫歯、感染性心内膜炎、急性感染性関節炎(Acute septic arthritis)、心血管疾患。
(c)ストレプトコッカス・ミュータンスに関連する疾患:虫歯、感染性心内膜炎。
(d)アクチノマイセス・ビスコーサスに関連する疾患:歯周病。
ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95を液体培地(本実施例はMRS培地を採用)で、30〜37℃で15〜24時間培養後、発酵菌液を30倍の濃度に濃縮し、透析膜(Spectra/Por(登録商標)Dialysis Membrane;MWCO:3500、Spectrum Laboratories Inc,CA)を使用して48時間透析し、さらに実験の必要に応じてラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95と濃縮した発酵産物を異なる濃度に希釈した。それぞれストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)(ATCC 25175)、ストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguis)(ATCC 49295)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)(ATCC 33277)、アクチノマイセス・ビスコーサス(Actinomyces viscosus)(ATCC 15987)とディスク寒天拡散試験(Disc agar diffusion test)、ブロス希釈法(Broth dilution method)、ラクトバシラス・ファーメンタム生菌と病原菌の共同培養試験を行い、病原菌成長の抑制状況を調べた。以上4株の病原菌の菌株は財団法人食品工業発展研究所生物資源保存及び研究中心またはATCCから購入した。
濁度が0.5比濁度に相当するまで培養したストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノマイセス・ビスコーサス菌液に、無菌棉棒を3秒間浸漬し、寒天表面に3方向に均等に塗布して接種材料を均一に分布させた。ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95の30倍発酵産物を透析した後、濃縮4倍(LFP4)、濃縮2倍(LFP2)及び1倍(LFP1)(未濃縮の発酵菌液)に調整し、ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95生菌をそれぞれ1×109(LFBL)、2×109(LFBM)、5×109(LFBH)の異なる菌数に希釈した。直径6mmの消毒滅菌済みペーパーディスクを異なる濃度のラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95の発酵産物または異なる生菌数の菌液中に3秒間浸漬させた後、ディスクを取り出して寒天表面に貼り付け、37℃の嫌気培養ボックス中に入れて24時間培養した後、その阻止円の大きさを測定した。
ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95の30倍発酵産物を透析した後、濃縮4倍(LFP4)、濃縮2倍(LFP2)及び1倍(LFP1)(未濃縮の発酵菌液)に調整し、また別途ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノマイセス・ビスコーサス菌液を無菌標準液体培地(BHI Broth)で濁度が0.5比濁度に相当するまで培養し、それぞれ50μLの菌液を試験管中に加え、37℃の嫌気培養ボックス中に入れて48時間培養した後、平板計数法で細菌集落数を計算し、サンプルの発育阻止濃度を推算した。
ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95生菌をストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギス、ポルフィロモナス・ジンジバリスと共に試験管に入れ、37℃で共同培養した。異なる時間点でサンプリングをそれぞれ行い、平板計数法で細菌集落数を計算し、サンプルの病原菌成長抑制状況を調べた。
実験群と対照群をそれぞれ設定した。ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95実験群は、それぞれ濃縮4倍、濃縮2倍及び1倍(未濃縮発酵菌液)の透析後のラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95発酵産物濃縮液3組と、それぞれ1×109、2×109、5×109の異なる菌数のラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95 3組の6組に分けた。対照群は2組(テトラサイクリン(tetracycline)0.267mg/mL及び蒸留水(distilled water)とした。
八週齢の雌Balb/cマウス各組12匹(表2)を選び、毎日異なる濃度のラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95発酵産物またはラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95生菌、テトラサイクリン0.267mg/mLまたは蒸留水各1mlを投与し、かつその下顎前歯に歯列矯正用ワイヤ(ligature wire)を取り付け、歯周組織に歯周病病原細菌ストレプトコッカス・ミュータンスを接種して、マウスを人工的に歯周組織病変の状態にした。この操作は全部の動物が犠牲になるまで行われ、その病理表徴を観察、記録した。歯科医師による診断で対照群(蒸留水を与えた模擬処置群(mock−treated group))の歯肉に赤い腫れ及び歯垢の出現が開始したら、ワイヤの束縛を解除し、歯周病病原細菌の接種を停止した。ワイヤの束縛を解除した後、4、8、12、16日目にマウスの歯周ポケット深度(pocket depth)を測定し、各組3匹を犠牲にして採血し、検体を取得して組織学的観察を行った。
八週齢の雌Balb/cマウス各組12匹(表3)を選び、その下顎前歯に歯列矯正用ワイヤを取り付け、対照群の歯肉に赤みと腫れ及び歯垢が出現するまで、歯周組織に歯周病病原細菌ストレプトコッカス・ミュータンスを接種し、マウスを人工的に歯周組織病変の状態にした。それぞれ歯科医師による組織病変の診断後、毎日異なる濃度のラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95発酵産物またはラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95生菌、テトラサイクリン0.267mg/mLまたは蒸留水各1mlを投与し、その病理表徴を観察、記録した。治療開始日からワイヤの束縛を解除し、歯周病病原細菌の接種を停止した。ワイヤ束縛解除後4、8、12、16日目にマウスの歯周ポケットの深さを測定し、各組3匹を犠牲にして採血し、検体を取得して組織学的観察を行った。
対照群を標準として、マン・ホイットニー検定(Mann−Whitney test)を使用し、各群中の各個体の検査を行い、有意差のある個体を改善個体と呼ぶこととした。(改善個体数/群の全個体数)×100%=歯周ポケット深度改善割合である。
死亡していない動物を犠牲にして頚動脈から取った血液を3000r.p.m.、4℃の条件下で10分間遠心処理し、上層の血清を取得して自動生化学分析装置でそのALT、AST、クレアチニン、BUN生化学指標を測定した。且つ、その重要な臓器(肝臓、腎臓)を10%ホルマリン液で固定し、組織切片のパラフィン包埋後にH.E.染色を行い、病理学的観察を行った。
実験数値は平均値±標準偏差(mean±S.D.)で表示する。マウスの歯周ポケット状況の実験群と対照群間の統計差異は、縦断的(longitudinal)研究では一元配置分散分析(One‐way ANOVA)とDunnett多重事後比較法(Dunnett multiple post hoc comparison)を採用して測定し、横断的(cross−sectional)研究では一元配置分散分析とLSD多重事後比較法(LSD multiple post hoc comparison)を採用して測定した。また、マン・ホイットニー検定を採用して歯周ポケット改善の個体数を調べた。統計有意水準のp値は0.05である。
1.体外実験(in vitro study)
(a)ディスク寒天拡散試験
表4にディスク寒天拡散試験の抗菌効果を示す。無菌ペーパーディスクの直径は6mmであり、阻止円が>6mmであれば抗菌効果があることを示し、そうでなければ抗菌効果がないことを示す。培養温度及び時間は37℃、24時間であり、対照群はテトラサイクリンを含むペーパーディスクで、阻止円の数値は平均値±標準偏差で表す(n=3)。
(a)動物歯周病予防効果の評価
SG−A95発酵産物を与えた群または生菌数が最高濃度の各群は16日目の肝臓、腎臓組織切片(図2〜図5と図10〜図13)において、各群の肝臓及び腎臓組織細胞に顕著な毒性傷害の表徴はなく、炎症細胞浸潤もなく、無治療対照群(tMTまたはpMT)(図6〜図9と図14〜図17)と比較して明らかな差異はなかった。
体外実験のディスク寒天拡散試験から、ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95濃縮2倍以上の発酵産物はこれら4種類の病原菌に対してすべて阻止円の形成があり、生菌は1×109(LFBL)、2×109(LFBM)または5×109(LFBH)のいずれもアクチノマイセス・ビスコーサス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギスの4種類の歯周病原細菌に対してすべて9〜10mmの阻止円が形成された。ブロス希釈法試験においては、ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95の発酵産物濃度が歯周病原細菌に対して異なる程度の抑制効果があることが示された。共同培養のデータから、ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95生菌のポルフィロモナス・ジンジバリスに対する抑制効果が最も優れており、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サンギスに対しても抑制作用があり、且つ生菌数が高いほど抑制効果も良好であることが示された。
Claims (10)
- ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95であって、寄託番号がCGMCC3248のラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95(Lactobacillus fermentum,SG−A95)。
- 請求項1に記載のラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95であって、SEQ ID NO:1に示されるヌクレオチド配列のコードを含むことを特徴とする、ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95。
- ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95の発酵産物であって、請求項1に記載のラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95を培地で発酵させて得たことを特徴とする、ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95の発酵産物。
- 口腔内細菌群を改善する保健組成物であって、請求項1に記載のラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95または請求項3に記載の発酵産物を含むことを特徴とする、保健組成物。
- 請求項4に記載の保健組成物であって、そのうちラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95が生菌であり、発酵産物が発酵液であることを特徴とする、保健組成物。
- 請求項4に記載の保健組成物であって、個体口腔内の歯周病細菌の成長を抑制するために用いることを特徴とする、保健組成物。
- 請求項6に記載の保健組成物であって、そのうち前記歯周病細菌がストレプトコッカス・ミュータンスまたはストレプトコッカス・サンギス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノマイセス・ビスコーサスを含むことを特徴とする、保健組成物。
- 請求項6に記載の保健組成物であって、そのうち前記個体が哺乳動物であることを特徴とする、保健組成物。
- 請求項4に記載の保健組成物であって、そのうち発酵産物が、ラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95成分を培養できる培地でラクトバシラス・ファーメンタムSG−A95を発酵させた後の産物であることを特徴とする、保健組成物。
- 請求項4に記載の保健組成物であって、錠剤、スプレー剤、溶液、食品、医薬品または口腔洗浄剤の添加剤のいずれかの態様であることを特徴とする、保健組成物。
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