KR102198552B1

KR102198552B1 - 인체 구강유래 락토바실러스 퍼멘텀 ok 균주를 포함하는 구취 또는 충치 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102198552B1
Application number: KR1020200069829A
Authority: KR
Inventors: 지근억; 박명수; 맹소연
Original assignee: 주식회사 비피도
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-06-09

Abstract

본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 균주를 포함하는 구취 또는 충치 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 균주를 포함하는 조성물은 구강유해균 또는 구취유발균의 저해를 통해 구취 또는 충치 개선, 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있다.

Description

인체 구강유래 락토바실러스 퍼멘텀 OK 균주를 포함하는 구취 또는 충치 개선, 예방 또는 치료용 조성물{Composition improving, preventing or treating halitosis or dental caries comprising Lactobacillus fermentum OK derived from human oral cavity}

본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 균주를 포함하는 구취 또는 충치 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

구취(halitosis)는 입이나 비강(nasal cavity)를 통해 나오는 악취 또는 입에서 나는 불쾌한 냄새로 정의되는데, 구취를 유발하는 주요 원인은 구강 혐기성균에 의한 부패 작용으로 인해 탈락 상피세포와 백혈구 등을 분해하여 생성되는 황화 수소(hydrogen sulfide, H₂S)와 메틸 머캡탄(methyl mercaptan, CH₃SH)과 같은 휘발성 유황화합물(volatile sulfur compound, VSC)에 의해 발생된다. 휘발성 유황화합물의 생성은 황을 함유하는 시스테인과 메티오닌과 같은 아미노산으로부터 생성되는 것으로 보고되고 있다.

시스테인으로부터 황화수소를 생성하는 세균은 펩토스크렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 유박테리움(Eubacterium), 셀레노모나스(Selenomonas), 센티페다(Centipeda), 박테로이데스(Bacteroides), 푸조박테리움(Fusobacterium), 프레보텔라(Prevotella)이며, 메티오닌으로부터 메틸 머캡탄을 만드는 세균은 푸조박테리움(Fusobacterium), 박테로이데스(Bacteroides), 포르피로모나스(Porphyromonas), 유박테리움(Eubacterium)으로 알려져 있다. 특히, 황화수소나 메틸 머캡탄을 생성하는 주요 세균인 푸소박테륨 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)은 혐기성세균으로 구강에 정상적으로 존재하면서 치주염을 일으키며 휘발성 유황화합물을 생성하여 구취를 발생하는 그람음성세균이다.

구취를 예방하기 위해 구취유발균의 증식을 억제하거나 휘발성 유황화합물의 생성을 감소시키는 아연(Zinc) 이온, 클로르헥시딘(chlorhexidine, CHX), 염화세틸피리디늄(cetylpyridinium chloride, CPC), 금속염(metal salts)이 효과적이라는 여러 보고들이 있어 왔지만, 구강 유산균을 이용한 구취유발균 저해에 관한 연구는 미미하다. 이에 구강 유산균을 이용하여 효과적이고 안전하면서도 실용적인 구취 예방을 위한 기술 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 충치(dental caries)는 치아 면에 부착된 박테리아(bacteria)가 만들어낸 산(acid)에 의해 치아 및 상아질(dentine)의 에나멜질(enamel)이 부식되는 질환이다. 충치를 유발하는 구강유해균으로는 다양한 종이 있는데, 대표적으로 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.)이 있으며 이들의 성장을 억제하기 위한 방법으로 다양한 연구가 보고되어 왔다. 충치를 예방하기 위해 페니실린(penicillin), 에리트로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline)과 같은 항생제(antibiotic)이 사용되어 왔지만, 이들을 장기간으로 사용하면 항생제에 대한 내성이 발생하는 한계가 있다. 그 외에도 천연 물질을 이용하여 구강유해균를 저해하거나, 충치 발생 원인이 되는 글루코실트랜스퍼라아제(glucosyltransferase, GTase)의 활성 저해 등에 대한 연구가 이루어졌으나 이러한 방법들은 지속적인 효과가 나타나지 않거나, 구강유해균을 억제할 뿐 아니라 구강내 정상 미생물도 억제한다는 문제가 있다. 이에 구강내 건강을 유지할 수 있게 효과적이고 안전하면서도 실용적인 충치 예방을 위한 기술 개발이 요구되고 있는 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0106988호(공개일자: 2014.09.04)에는, 충치유발균주인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균활성을 갖는 박테리오신을 생산하는 김치 유래의 유산균에 관한 것으로, 충치 유발 세균의 성장 억제 활성을 나타내는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CBNU2567; 및 이들 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 충치 예방용 식품 조성물에 관한 것이다. 대한민국 등록특허 제10-1715163호(등록일자: 2017.03.06)에는, 솔잎 및 솔방울 추출물의 김치 유산균 발효물을 포함하는 구취 제거용 식품 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 솔잎 및 솔방울 추출물을 김치유산균으로 발효한 것을 주요성분으로 사용함으로써 구취 제거 또는 구취 개선 효과를 가지는 식품 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 구강유해균 또는 구취유발균의 저해를 통해 구취 또는 충치 개선, 예방 또는 치료 효과가 있는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK (KCCM12725P) 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 구취 또는 충치 개선용 식품 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은, 바람직하게 껌, 캔디, 정제 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 제형을 가지는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK (KCCM12725P) 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 구취 또는 충치 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은, 바람직하게 치약, 구강 세정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제 중에서 선택되는 하나 이상의 제형을 가지는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK (KCCM12725P) 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 구취 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 균주를 포함하는 조성물은 구강유해균 또는 구취유발균의 저해를 통해 구취 또는 충치 개선, 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있다.

도 1은 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 균주를 선별하기 위해 타액으로부터 과산화물(H₂O₂) 생성이 뛰어난 총 500개의 colony를 1차 분리한 후(A), 그 중 50개의 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)를 2차 분리한 결과(B)이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 균주의 생육과 과산화수소(H₂O₂) 생산능을 나타낸 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 균주와 구강유해균과 혼합 배양시 구강유해균에 대한 억제능 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 균주의 인공치태(artificial dental plaque) 억제능 결과 그래프이다.

구취를 유발하는 주요 원인은 구강 혐기성균에 의한 부패 작용으로 인해 탈락 상피세포와 백혈구 등을 분해하여 생성되는 황화 수소(hydrogen sulfide, H₂S)와 메틸 머캡탄(methyl mercaptan, CH₃SH)과 같은 휘발성 유황화합물(volatile sulfur compound, VSC)에 의해 발생되며, 휘발성 유황화합물의 생성은 황을 함유하는 시스테인과 메티오닌과 같은 아미노산으로부터 생성되며 이들을 생성하는 균으로부터 발생한다고 알려져 있다. 이에 구취를 예방하기 위해 구취유발균의 증식을 억제하거나 휘발성 유황화합물의 생성을 감소시키는 아연(Zinc) 이온, 클로르헥시딘(chlorhexidine, CHX), 염화세틸피리디늄(cetylpyridinium chloride, CPC), 금속염(metal salts)이 효과적이라는 여러 보고들이 있어 왔지만, 구강 유산균을 이용한 구취유발균 저해에 관한 연구는 미미하다. 이에 구강 유산균을 이용하여 효과적이고 안전하면서도 실용적인 구취 예방을 위한 기술 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 충치를 유발하는 구강유해균으로는 다양한 종이 있는데, 대표적으로 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.)이 있으며 이들의 성장을 억제하기 위한 방법으로 다양한 연구가 보고되어 왔다. 충치를 예방하기 위해 페니실린(penicillin), 에리트로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline)과 같은 항생제(antibiotic)이 사용되어 왔지만, 이들을 장기간으로 사용하면 항생제에 대한 내성이 발생하는 한계가 있다. 또한, 천연 물질을 이용하여 구강유해균를 저해하거나, 충치 발생 원인이 되는 글루코실트랜스퍼라아제(glucosyltransferase, GTase)의 활성 저해 등에 대한 연구가 이루어졌으나 이러한 방법들은 지속적인 효과가 나타나지 않거나, 구강유해균을 억제할 뿐 아니라 구강내 정상 미생물도 억제한다는 문제가 있다. 이에 구강내 건강을 유지할 수 있게 효과적이고 안전하면서도 실용적인 충치 예방을 위한 기술 개발이 요구된다.

본 발명은 건강한 성인의 타액으로부터 구강유해균 억제능이 우수한 락토바실러스 속 균주를 분리 선발하고 그 중에서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대해서 억제능이 우수했던 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK를 동정, 명명하였다.

한편, 하기 실험에 의하면, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK는 많은 양의 과산화물을 생성하여서 구취유발균 또는 구강유해균의 감염에 대한 방어가 우수하였고, 응집력(coaggreation)이 뛰어나 구취유발균 또는 구강유해균의 직접적인 억제를 가능하게 하였다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK와 구강유해균의 혼합 배양을 통한 구강유해균에 대한 높은 억제능, 구강유해균의 구강상피세포 부착억제능 및 인공치태 억제능에 탁월한 효과를 발휘함을 확인하여 충치 개선, 예방 또는 치료에 효과적인 균주로서의 사용 가능성을 확인하였고, 이를 포함하여 식품 또는 약학 조성물을 제공할 수 있음을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK (KCCM12725P) 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 구취 또는 충치 개선용 식품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK (KCCM12725P) 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 구취 또는 충치 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK (KCCM12725P) 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 구취 억제용 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK는 구강유해균 또는 구취유발균을 저해하여 구취 또는 충치 개선, 예방 또는 치료효과를 발휘할 수 있는데 다양한 구강유해균 및 구취유발균이 대상이 될 수 있다. 본 발명에서는 구취유발균의 일예로, 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)를 사용하였다. 또한, 구강유해균의 일예로, 구강 호기성 유해균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sorbrinus), 스트렙토코커스 상구이니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii)를 사용하였다.

더욱 구체적으로는 Korean Collections of Oral Microbiology (KCOM, Gwangju, Korea)으로부터 분양 받은 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) KCOM 1001, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) KCOM 2796, 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia) KCOM 2889, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) KCTC 3065, 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sorbrinus) KCOM 1157, 스트렙토코커스 상구이니스(Streptococcus sanguinis) KCOM 2167, 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii) KCOM 1788를 사용하였다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은, 제형이 한정되지는 않으나, 바람직하게 껌, 캔디, 정제 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 제형을 가지는 것이 좋다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은, 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 치약, 구강 세정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제 중에서 선택되는 하나 이상의 제형을 가지는 것이 좋다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 구취 억제용 조성물은, 사용방법에 따라 바람직한 제형일 수 있으며, 적용되는 제형이 한정되지는 않는다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 또는 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1: 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) OK 균주의 분리]

1) 실험 방법

본 실시예에서는 충치 발생을 억제하는 락토바실러스를 분리하기 위해 만 20세 이상의 건강한 성인을 대상으로 타액(saliva)을 수집하였다. 실험에 사용된 타액 샘플은 서울대학교의 Food Microbiological Research Laboratory에서 모집된 치은 연상 치태(supragingival plaque)가 거의 없고 구강 질환이 없는 성인 200명으로부터 채취하였다(IRB No. 1907/003-018). 샘플은 아침에 기상 후 양치 전 또는 식사 전에 채취하여 멸균된 70% 글리세롤(glycerol)rhk 1:1로 혼합하여 실험 전까지 냉장 보관하였다.

과산화수소(hydrogen peroxide) 생산성이 뛰어난 락토바실러스를 1차 선발하기 위해 Eschenbach et al., Journal of clinical microbiology, 1989와 John F. T. Spencer, Methods in Molecular Biology, 2004에 의해 기술된 방법을 변형하여 사용하였다. 스크리닝 플레이트(Screening plate)인 테트라 메틸 벤지딘(Tetra methyl benzidin, TMB) 아가(agar)를 만들기 전 solution A, solution B를 제조하였다. Solution A는 TMB (3,3',5,5'-tetra methyl benzidine, Sigma, St Louis, MO, USA) 12.5 mg을 DMSO (Dimethyl sulfoxide, Sigma, St Louis, MO, USA) 3 mL에 완전히 용해시켜 제조하였다. Solution B는 과산화효소(peroxidase) (Sigma, St Louis, MO, USA) 0.5 mg을 1 mL의 멸균수(sterilized water)에 녹여 제조하였다 (0.5 mg/mL or 100 U/mL peroxidase). de Man-Rogosa-Sharpe (MRS, BD Difco??, Franklin Lakes, NJ, USA) agar 을 121℃에 15 분동안 완전 멸균(sterilization) 후 워터 배스(water bath)에서 45℃로 맞춰주었다. MRS agar 10 mL에 solution A 0.6 mL과 solution B 0.2 mL를 잘 혼합한 후, 혼합물을 플레이트(plates)에 붓고 굳혔다. 1 플레이트당 최종적으로 1 mM TMB와 10 μg/mL (2 U/mL) 과산화효소(peroxidase)의 농도로 들어간다. Solutions A 와 B는 TMB agar을 제조할 때 만들어서 사용했다. 과산화효소(peroxidase)가 불안정하기 때문에 TMB agar는 제작 후 2-8℃에서 보관하여 3일 이내에 사용해야 한다. 과산화수소를 생성하는 젖산 박테리아를 분리하기 위해 수집한 타액 샘플 100 μL을 sterilized phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4)에 연속희석(serial dilution)시켰다. 연속 희석한 것을 0.25 ㎎/ml TMB 와 0.01 ㎎/ml of 과산화효소(peroxidase)를 함유한 MRS agar의 표면에 스프레딩하였다. 37℃에서 48시간 동안 무산소성(anaerobic)으로 배양한 후, 산소에 15~30분동안 노출시켜 지시약(indicator)의 반응을 기다렸다.

각 배지에 형성된 파란색을 띄는 single colony 10개를 임의 선택하여 새 배지에 여러 번 연속적으로 스트리킹하여 순수한 500개의 single colony를 분리하였다. 이어서 분리한 single colony를 LBS (Lactobacillus Selection, BD Difco™, Franklin Lakes, NJ, USA) agar을 이용하여 락토바실러스(Lactobacillus)만 선별하였다. 각각의 colony를 LBS agar에 도말하여 24시간 동안 배양한 후, colony가 자랐는지 확인하여 50개의 미생물을 분리하였다.

마지막으로 구강유해균에 항균력을 강하게 보이는 균을 최종 선발하기 위해 배양액 희석 테스트(Broth dilution test)를 실시하였다. 분리한 50개의 균주를 5 ml의 MRS broth에서 37℃에서 24시간 배양하고, 4℃, 15,000 rpm에서 5분간 원심분리로 상층액을 회수하였다. 유기산의 항균효과를 제외하기 위하여 상층액을 1M NaOH로 pH 6.5~7로 조절 후 syringe (0.45 μm)로 filter를 내리고 실험 전까지 -20℃에 보관하였다. 96 well plates (SPL Life Sciences Co., Ltd. Pocheon, Korea) 에 200 μL의 MRS broth를 첨가한 후 37℃에서 18시간 배양한 구강유해균 11종의 배양액을 1% 접종하였다. 분리 균주의 배양 상층액을 균이 접종된 broth에 10 μL씩 로딩하여 37℃에서 혐기적으로 배양하였다. 24시간까지 시간별로 각 well을 마이크로플레이트 리더(microplate reader) (Epoch2, BioTek, USA)를 이용하여 600nm에서 측정하였다.

2) 실험 결과

배지 내 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)는 박테리아(bacteria)의 과산화물 생성에 의해 TMB의 산화를 유도하여 블루 콜로니(blue colony)를 형성하였다. 즉, colony의 색이 푸른색을 띠면 과산화물 생성(+)으로 판단하였고 색깔에 따라 네이비 블루(navy blue)는 강한 양성(strongly positive) (+++), 블루(blue)는 양성(positive) (++), 스카이 블루(sky blue)는 약한 양성(weakly positive) (+), 색깔의 변화가 없으면 음성(negative) (-)로 정하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같았다. 타액으로부터 과산화물(H₂O₂) 생성이 뛰어난 총 500개의 colony를 1차 분리한 후, 그 중 50개의 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)를 2차 분리하였다(도 1). 50개 중 구강유해균에 대한 억제능이 가장 강한 균주를 탐색하였고 충치를 유발하는 균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 생장을 억제하는 'OK'를 분리하였다(하기 표 2 참조). pH 측정에서는 'OK'가 MRS broth (pH 6.5)에서 24시간 배양 후 pH 4.72±0.4까지 낮아졌다(표 1).

Lactobacillus species	H₂0₂ production	pH	Lactobacillus species	H₂0₂ production	pH
Control A			S26	+++	4.80±0.1
Control B			S27	+++	4.30±0.2
S1	+++	5.50±0.2	S28	+++	4.70±0.3
S2	+++	5.30±0.2	S29	+++	4.36±0.3
S3	+++	4.30±0.1	S30	++	4.7±0.1
S4	+++	4.40±0.0	S31	++	4.35±0.2
S5	+++	4.90±0.3	S32	+	4.74±0.4
S6	+	4.70±0.3	S33	++	5.07±0.4
S7	+++	4.96±0.4	S34	++	5.13±0.1
S8	+++	4.78±0.1	S35	+++	4.74±0.4
S9	+++	4.70±0.0	S36	+++	4.40±0.3
S10	+++	4.70±0.2	S37	++	4.26±0.3
S11	+++	4.78±0.1	S38	+	4.40±0.1
S12	+	4.20±0.1	S39	+++	4.80±0.2
S13	+	4.30±0.1	S40	+++	4.80±0.2
S14	+++	4.43±0.4	S41	+++	4.78±0.4
S15(OK)	++	4.72±0.4	S42	+++	4.75±0.1
S16	+	4.36±0.2	S43	+++	4.86±0.2
S17	++	4.39±0.2	S44	+++	4.85±0.4
S18	+	5.04±0.1	S45	+++	4.83±0.1
S19	+	5.09±0.1	S46	++	4.84±0.1
S20	+	5.10±0.1	S47	+	4.40±0.2
S21	++	4.30±0.2	S48	+++	3.40±0.3
S22	++	4.40±0.3	S49	+++	4.00±0.3
S23	+	5.10±0.3	S50	+++	4.66±0.3
S24	-	5.20±0.3
S25	+++	5.40±0.4

다음으로 'OK'의 항균 효과를 다양한 구강유해균 또는 구취유발균에 대해 조사하였다. 그 결과, 하기 표 2와 같이 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대해 60 %로 가장 높은 억제율을 나타냈고, 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii)에 대해 25 %의 항균 활성을 나타냈고, 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sorbrinus)에 대해 약 27 %의 항균 활성을 나타냈다. 또한, 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 스트렙토코커스 상구이니스(Streptococcus sanguinis)에서는 약한 활성을 보였다.

Strains	Inhibition level (%)
Fusobacterium nucleatum KCOM 1001	18±3
Porphyromonas gingivalis KCOM 2796	16±2
Prevotella intermedia KCOM 2889	27±8
Streptococcus sobrinus KCOM 1157	27±5
Streptococcus gordonii KCOM 1788	25±4
Streptococcus sanguinis KCOM 2167	11±7
Streptococcus mutans KCTC 3065	60±2

상당한 양의 과산화물을 생성하고 구강유해균 또는 구취유발균에 대한 항균력이 뛰어난 'OK'를 유전적 동정(genetic Identification)하였고, 이를 위해 16S rRNA의 시퀀싱(sequencing)한 후, 염기서열(base sequence)을 기초로 하여 Molecular Phylogenetic Status도 병행하였다. 그 결과, 'OK'가 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)임을 확인하였고, 'OK'의 16S rRNA base sequence를 GenBank에 등재된 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)의 16S rRNA sequence와 다중 정렬(multiple alignment)하여 유사매트릭스(similarity matrix)를 구하고 계보학(genealogy)을 작성한 결과, 16S rRNA homology의 범위는 모두 99%로 나타났다. 이를 통해 'OK'는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)과 99%의 높은 상동성을 보여 '락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK'로 최종 명명하였다

이에 따라, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK를한국미생물보존센터(KCCM)에 2020년 05월 21일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12725P를 부여받았다.

[실험예 1: 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) OK 균주의 충치유발 억제 효능관련 실험]

1) 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) OK 균주의 생육과 과산화수소(H ₂ O ₂ ) 생산능

락토바실러스 배양물을 MRS broth에서 교반없이 37℃에서 두번 서브컬쳐(subculture)한 후 50 rpm으로 교반하면서 시간별로 24시간까지 37℃에서 배양하였다. 배양 배지(culture medium)를 4℃에서 10 분 동안 2,000 rpm에서 원심분리한 다음, 상층액을 분리하였다. 이후, 상층액을 Pierce Quantitative Peroxide assay kit(aqueous-compatible formulation, Thermo fisher scientific, USA)를 사용하여 colorimetric method로 분석하였다. 96 well microplate에 200 μL의 워킹 리에이전트(Working Reagent)와 상층액 20 μL을 혼합하여 15분이 지난 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader) (Epoch2, BioTek, USA)로 570nm에서 각 well의 광학밀도(optical density)를 측정하였다.

그 결과, 도 2와 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK가 생산한 과산화물은 0 μmol/L 에서 9시간 후 1,130 μmol/L까지 지속적으로 증가되었고, 21시간까지 1,000 μmol/L 이상의 과산화물의 양을 유지하다 이후 감소되었다. 이와 같이 많은 양의 과산화물 생성을 통해 구강유해균 또는 구취유발균의 감염에 대한 방어가 우수하게 나타날 수 있음을 확인하였다.

2) 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) OK의 응집력

응집력(Coaggreation)이 높은 유익균은 구강에 투입하였을 때 짧은 시간내 구강유해균과 결합하여 타액, 물리학적 제거 등에 의해 구강에서 제거가 되는 것을 막게 된다. 또한, 구강유해균과 같이 응집된 상태로 유익균이 생산하는 박테리오신(bacteriocin), 젖산(lactic acid), 과산화물(hydrogen peroxide)과 같은 항균물질을 바로 접하게 되어 구강유해균이 직접적인 타격을 받아 억제되도록 작용한다. 이에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK와 다양한 구강유해균의 응집력을 평가하고자 하였다. Handley et al., Microbiology, 1987의 스펙트로포토메트릭 어세이(spectrophotometric assay)를 변형하여 응집력 어세이(Coaggregation assays)를 수행하였다.

배양 배지(culture medium)를 4000Ｘg에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 펠렛(pellet)을 Cisar's buffer (1 mM Tris(hydroxymethyl) aminomethane (pH 8.0), 100 μM CaCl₂, 100 μM MgCl₂, and 0.15 M NaCl)로 3회 세척한 후 약 10⁹ cell/ml의 농도로 리서스펜션(resuspension)하였다. Coaggregation pair를 각각 1 ml씩 섞어 10 초간 볼텍싱(vortexing)하여 혼합하고, 110 rpm에서 약하게 섞으면서 37℃에서 30분간 배양하였다. 배양 후, 응집체(coaggregate)를 침전시키기 위해 3분간 실온에 방치하였다. 0.5 ml의 상등액을 조심스럽게 추출하여 microplate reader (Epoch2, BioTek, USA)로 660 nm에서 광학밀도(optical density)를 측정하여 대조군(control)과 비교하여 흡수값(absorbance value)을 얼마나 감소시키는지 비교하였다. 응집력의 퍼센티지(ercentage)는 Handley et al., Microbiology, 1987의 방정식(하기 수학식 1)을 사용하여 계산하였다. 여기서 X와 Y는 대조군 튜브의 두 미생물을 각각 나타낸 것이고, (X+Y)는 혼합물이다.

그 결과, 하기 표 3과 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK는 구강 혐기성 세균 중에서는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)와 약 76%로 가장 높은 응집력을 보였고, 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)에 대해 각각 약 51%, 약 52%의 응집력을 보였다. 또한, 구강 호기성 세균 중에서는 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sorbrinus)에 대해 약 81%로 가장 높은 응집력을 보였고, 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 상구이니스(Streptococcus sanguinis)에 대해 약 76%, 약 74%, 약 70%순으로 높은 응집력을 보였다.

Strains	Coaggregation (%)
Fusobacterium nucleatum KCOM 1001	51±1
Porphyromonas gingivalis KCOM 2796	76±7
Prevotella intermedia KCOM 2889	52±5
Streptococcus sobrinus KCOM 1157	81±2
Streptococcus gordonii KCOM 1788	76±4
Streptococcus sanguinis KCOM 2167	70±2
Streptococcus mutans KCTC 3065	74±1

3) 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) OK의 혼합배양시 구강유해균 억제능

구강유해균에 대한 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK의 영향을 보기 위해 혼합 배양후 선별된 배양 플레이트를 이용하여 생존세포수를 세었다. 혐기성세균은 KCOM broth에, 호기성세균은 2 mL의 BHI broth에 각각 0.1 ml와 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK 0.1 ml를 단독 또는 병합 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 생존세포수를 세었다. 혐기성세균은 1 mL KCOM agar, 호기성세균은 1 mL MSB (Mitis Salivarius Sucrose Bacitracin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) agar, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK는 LBS agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 선별된 배양플레이트로 사용하였다.

그 결과, 도 3과 같이 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK는 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)과 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 상구이니스(Streptococcus sanguinis)에 대해 강한 증식 억제력이 있었으며, 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sorbrinus), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대해서는 약한 억제력을 보였다. 또한, 구강유해균과의 상호작용에 의해 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK의 증식 또한 영향을 받았는데, 대조군에 비해 대부분의 혼합 배양에서 약한 증식 억제반응이 나타났고 그 중 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)과 혼합 배양한 생균수의 감소가 가장 높게 나타났다.

4) 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) OK의 구강상피세포 부착억제능 및 제거능

락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK의 구강상피세포 부착억제능 및 제거능을 확인하였다. 부착테스트는 Ren et al., Inhibition of Staphylococcus aureus, 2012의 실험법을 변형하여 사용하였다. KB cell (human mouth epithelial cells; Korean cell line bank 10017)을 5% CO₂, 37℃에서 2 mmol 1^-1L-글루타민(glutamine)과 10 % fetal bovine serum을 함유한 minimal essential medium with Earle's salts (Hyclone, Logan, Utah, USA)에서 배양하였다. 부착 테스트는 24-well multi culture dish (Thermo Fisher Scientific, St Peters, MO, USA)을 사용하였다. KB cell을 well 당 10⁵ cell를 가하여 5% CO₂, 37℃에서 18시간 배양하였다. KB cell를 PBS로 2 회 세척하고, 부착 억제능 테스트를 위해 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK를 (10⁸ bacteria ml^-1)를 1 mL 가하였다. 부착을 위해 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 5 % CO₂에서 배양하였다. 상등액을 제거하고 세포(cell)를 PBS로 두차례 세척한뒤 유해균(10⁸ bacteria ml^-1)를 1 mL 가하였다. 부착을 위해 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 5 % CO₂에서 배양하였다. 200 μL trpsin/EDTA (Welgene, Daegu, Korea)를 10분 동안 세포 단층에 첨가한 후, 세포 및 부착된 박테리아를 수집하였다. 부착 제거능 테스트는 유익균과 유해균의 접종 순서만 바뀌고 실험방법은 동일하게 진행되었다. 각각의 KB 세포에 부착된 박테리아의 수는 real-time PCR 방법에 의해 계산되었다. 수확된 펠렛에서 부착된 박테리아의 게놈 DNA (gDNA)를 MG cell genomic DNA 추출 SV 키트 (Doctor protein, Seoul, Korea)를 사용하여 추출하였다.

그 결과, 하기 표 4와 같이 락토바실러스 퍼멘텀 OK는 푸조박테리움 뉴클레아툼 KCOM 1001에 대해 95% 방어하고 92% 제거하는 효과가 있으며, 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC 3065에 대해 100% 방어하고 86% 제거하는 효과가 있는 것으로 나타났다.

KB cell_Protection assays
	10^2	억제율(%)
Lactobacillus fermentum OK	3100
F. nucleatum KCOM 1001	18350
Streptococcus mutans KCTC 3065	2570
(OK→KCOM 1001)KCOM 1001	950	95
(OK→KCTC 3065)KCTC 3065	10	100
KB cell_Displacement assays
	10^2
Lactobacillus fermentum OK	3100
F. nucleatum KCOM 1001	18350
Streptococcus mutans KCTC 3065	2570
(KCOM 1001→OK)KCOM 1001	1380	92
(KCTC 3065→OK)KCTC 3065	370	86

5) 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) OK의 인공치태(artificial dental plaque) 억제능

스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 구강에서 치태(dental plaque)를 형성하여 충치의 원인이 될 뿐만 아니라 일정시간이 지나 플라크로 변하여 치주염(periodontitis)로 발전하게 된다. 스트렙토코커스 뮤탄스에 의한 인공치태(artificial dental plaque) 형성에 대해 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK의 억제정도를 확인하기 위해 Yu et al.과 Chung et al.의 연구방법을 참고하여 Beaker-wire tests를 하였다. BHI broth와 MRS broth가 동량 섞어진 40 ml broth에 5 % sucrose와 0.1 M MOPS(3-모르폴리노프로판(morpholinopropane)-1-술폰산(sulfonic acid)) buffer를 첨가하여 pH 7로 조정하였다. 2Ｘ10⁸CFU/ml의 스트렙토코커스 뮤탄스와 2Ｘ10⁸CFU/ml의 락토바실러스 퍼멘텀 OK를 단독 또는 병합으로 접종한다. 3개의 스테인리스 스틸(stainless steel) 재질의 캘리브레이션 와이어(calibration wire) (5 cm length, 0.016 inch, 1 mm diam, orthodontic wire, Oramco, Glendora, CA, USA)를 50 mg 내외가 되게 준비하여 3개씩 코니컬 튜브(conical tube)에 매달아 broth에 잠기도록 한다. 37℃에서 110 rpm으로 회전시키면서 24시간 배양 후, 3개의 캘리브레이션 와이어(calibration wire)에 생성된 인공치태(artificial dental plaque)의 무게를 측정하였다.

그 결과, 도 4와 같이 스트렙토코커스 뮤탄스를 단독 접종한 broth 내(A) 캘리브레이션 와이어에 형성된 인공치태의 무게는 평균 105±5 mg 인데 반해, 락토바실러스 퍼멘텀 OK를 단독 접종한 broth 내(B)에서는 생산되지 않았다. 스트렙토코커스 뮤탄스와 락토바실러스 퍼멘텀 OK를 혼합 배양한 broth 내(C) 캘리브레이션 와이어에 형성된 인공치태의 무게는 2.2±7 mg 으로 스트렙토코커스 뮤탄스를 단독배양할 때에 비해 약 97.9 % 감소한 것을 확인하였다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12725P

수탁일자 : 20200521

Claims

락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK (KCCM12725P) 균주를 포함하되,
상기 락토바실러스 퍼멘텀 OK 균주는,
과산화수소 생산능을 갖으며, 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 상구이니스(Streptococcus sanguinis), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sorbrinus) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 구강유해균에 대해 증식 억제능을 발휘하는 것을 특징으로 하는 구취 또는 충치 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서,
상기 식품 조성물은,
껌, 캔디, 정제 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 구취 또는 충치 개선용 식품 조성물.
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK (KCCM12725P) 균주를 포함하되,
상기 락토바실러스 퍼멘텀 OK 균주는,
과산화수소 생산능을 갖으며, 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 상구이니스(Streptococcus sanguinis), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sorbrinus) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 구강유해균에 대해 증식 억제능을 발휘하는 것을 특징으로 하는 구취 또는 충치 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 약학 조성물은,
치약, 구강 세정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제 중에서 선택되는 하나 이상의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 구취 또는 충치 예방 또는 치료용 약학 조성물.
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) OK (KCCM12725P) 균주를 포함하되,
상기 락토바실러스 퍼멘텀 OK 균주는,
과산화수소 생산능을 갖으며, 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii), 스트렙토코커스 상구이니스(Streptococcus sanguinis), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sorbrinus) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 구강유해균에 대해 증식 억제능을 발휘하는 것을 특징으로 하는 구취 억제용 조성물.